孫 穎，劉雅蓉，吳鴻飛，2，戴 敏，2

(1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，安徽 合肥 230012；2.新安醫(yī)學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽 合肥 230038)

動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是心腦血管疾病中的重要病程，嚴(yán)重影響人們的身體健康。臨床研究表明，導(dǎo)致AS的危險(xiǎn)因素包括高脂血癥、高血壓、高血糖、高纖維蛋白原血癥等[1]。AS發(fā)生過程中的病理變化主要有脂質(zhì)積累導(dǎo)致的血管堵塞，內(nèi)皮細(xì)胞受損導(dǎo)致的內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙，血流低切應(yīng)力造成的內(nèi)皮功能的進(jìn)一步紊亂，以及炎癥反應(yīng)導(dǎo)致的血管病變等。近年來研究[2]發(fā)現(xiàn)，丹皮酚對實(shí)驗(yàn)性AS的治療作用顯著，尤其是在降低脂質(zhì)以及抑制炎癥反應(yīng)方面效果明顯，同時(shí)在改善內(nèi)皮功能障礙及抗氧化等方面也有較好的作用?，F(xiàn)對丹皮酚對實(shí)驗(yàn)性AS的預(yù)防及治療作用，以及丹皮酚對AS發(fā)生的相關(guān)細(xì)胞的作用與機(jī)制進(jìn)行綜述。

1 AS的病理機(jī)制及其相關(guān)細(xì)胞

AS是現(xiàn)代社會危害人類身體健康的主要疾病之一，損害累及機(jī)體的重要器官，主要是心腦血管系統(tǒng)。其病因病機(jī)復(fù)雜，主要有脂質(zhì)浸潤學(xué)說、內(nèi)膜損傷學(xué)說以及炎癥學(xué)說[3]。深入研究后發(fā)現(xiàn)，血管內(nèi)皮細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞及單核巨噬細(xì)胞在AS的發(fā)生發(fā)展過程中起到重要作用。

1.1 血管內(nèi)皮細(xì)胞在AS中的作用 血管內(nèi)皮細(xì)胞是血管最外層的屏障。當(dāng)危害血管的外界刺激如高血脂、血流低切應(yīng)力等對血管內(nèi)皮細(xì)胞造成損傷后，會導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙，異常分泌細(xì)胞間黏附分子-1(intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1)及血管細(xì)胞黏附分子-1(vascular cell adhesion molecule-1，VCAM-1)等一系列黏附分子或白細(xì)胞介素，使得在血液中游離的單核細(xì)胞易于黏附在內(nèi)皮細(xì)胞表面，并分化成為巨噬細(xì)胞，進(jìn)而釋放單核細(xì)胞趨化蛋白-1(monocyte chemotactic protein-1，MCP-1)等導(dǎo)致更多的單核巨噬細(xì)胞聚集，逐漸形成AS的斑塊。內(nèi)皮細(xì)胞炎癥也是導(dǎo)致AS發(fā)生發(fā)展的重要因素之一。炎癥因子的升高標(biāo)志著炎癥反應(yīng)的加劇，不斷促進(jìn)斑塊的形成。內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙還會引起血管收縮及擴(kuò)張因子的分泌改變，導(dǎo)致內(nèi)皮依賴性血管舒張障礙[4]。

1.2 血管平滑肌細(xì)胞在AS中的作用 平滑肌細(xì)胞表型的轉(zhuǎn)變及異常增殖是影響AS發(fā)展的突出表現(xiàn)[5]。當(dāng)平滑肌細(xì)胞被生長因子等外在條件激活后由收縮表型轉(zhuǎn)變?yōu)楹铣杀硇蚚6]。同時(shí)血管平滑肌細(xì)胞開始過度增殖，造成平滑肌增厚及管腔狹窄，合成表型使得異常增殖的血管平滑肌細(xì)胞的遷移更易進(jìn)行。隨著炎癥的進(jìn)一步加劇，平滑肌細(xì)胞會釋放基質(zhì)金屬蛋白酶等細(xì)胞因子，溶解初步形成的動脈粥樣斑塊，形成易損斑塊，造成AS的進(jìn)一步發(fā)展。

1.3 單核-巨噬細(xì)胞在AS中的作用 單核-巨噬細(xì)胞參與了AS發(fā)展的全過程[7]。巨噬細(xì)胞可以隨血液移行與各個(gè)細(xì)胞產(chǎn)生相互聯(lián)系[8-9]。由于巨噬細(xì)胞具有異質(zhì)性和多樣性，在炎癥反應(yīng)發(fā)生后會由原型向M1型轉(zhuǎn)變[10]，隨后吞噬受損處聚集的脂質(zhì)，進(jìn)入內(nèi)膜下，形成泡沫細(xì)胞。變異壞死的泡沫細(xì)胞和部分脂質(zhì)釋放至胞外，形成粥樣斑塊的脂質(zhì)核心。泡沫細(xì)胞分泌基質(zhì)金屬蛋白酶，參與纖維帽金屬膠原纖維的降解，加劇了斑塊的不穩(wěn)定性；同時(shí)M1型巨噬細(xì)胞會繼續(xù)分泌更多的炎癥因子，使得AS的進(jìn)一步加劇[11]。除此之外，進(jìn)展期中的巨噬細(xì)胞自噬能力下降，促進(jìn)斑塊壞死，促使大多數(shù)的細(xì)胞凋亡及炎癥應(yīng)答反應(yīng)的產(chǎn)生。

2 丹皮酚的主要藥理活性及抗AS作用

牡丹皮是毛茛科植物牡丹的根皮，具有清熱涼血、活血化瘀的功效。丹皮酚是牡丹皮中主要活性成分之一，其化學(xué)結(jié)構(gòu)為2-羥基-4-甲氧基苯乙酮。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，丹皮酚可以降低AS模型動物血脂，使主動脈內(nèi)膜趨向光滑，并使斑塊厚度變薄，脂質(zhì)條紋減少[12]，丹皮酚還能降低氧化低密度脂蛋白(oxidation low density lipoprotein，ox-LDL)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)水平及提高超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活力發(fā)揮抗氧化作用[13]，以及改善血管內(nèi)的炎癥反應(yīng)等[14]。因此認(rèn)為丹皮酚具有良好的抗AS的效果。近年來丹皮酚抗AS的機(jī)制研究逐漸深入，發(fā)現(xiàn)丹皮酚對AS相關(guān)細(xì)胞有顯著作用。

2.1 丹皮酚通過抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)抗AS

2.1.1 丹皮酚提高內(nèi)皮細(xì)胞存活率 內(nèi)皮功能障礙是AS的始動因素，丹皮酚對損傷的內(nèi)皮細(xì)胞具有保護(hù)作用。首先在改善細(xì)胞損傷方面，細(xì)胞受到脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)或ox-LDL刺激時(shí)，丹皮酚組的內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)變化最小。研究[15]發(fā)現(xiàn)，LPS刺激后的內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生的乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)增多，而丹皮酚可以抑制LDH的產(chǎn)生，進(jìn)而改善細(xì)胞的通透性，明顯提高內(nèi)皮細(xì)胞存活率。

2.1.2 丹皮酚抑制炎癥因子的分泌 研究[16]發(fā)現(xiàn)，丹皮酚與miRNA-21抑制劑均可抑制炎癥因子的釋放，且兩者共同作用后效果增強(qiáng)，說明丹皮酚是通過降低miRNA-21的水平起到對內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)作用。進(jìn)一步的研究[16]發(fā)現(xiàn)，丹皮酚還下調(diào)了p38絲裂原活化的蛋白激酶(p38 mitogen-activated protein kinase，p38-MAPK)信號通路相關(guān)蛋白的表達(dá)，從而說明丹皮酚可通過降低miRNA-21的水平進(jìn)而抑制p38-MAPK信號通路的活化起到減少炎癥因子的分泌實(shí)現(xiàn)抗炎作用。另有研究[15]發(fā)現(xiàn)，丹皮酚可使磷脂酰肌醇-3激酶(phosphatidylinositol-3 kinase，PI3K)/絲氨酸蘇氨酸蛋白激酶(serine- threonine kinase，AKT)通路中經(jīng)誘導(dǎo)后的蛋白磷酸化作用降低，從而抑制其下游的信號通路，下調(diào)炎癥反應(yīng)程度起到保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞的作用。

2.1.3 丹皮酚改善血管內(nèi)皮細(xì)胞的黏附功能 丹皮酚可以直接減少ICAM-1、VCAM-1等黏附分子的異常表達(dá)，降低其他細(xì)胞向內(nèi)皮細(xì)胞的異常黏附。有研究[17]發(fā)現(xiàn)，miRNA-126參與了內(nèi)皮細(xì)胞的損傷及修復(fù)過程，證明了VCAM-1是miRNA-126的特異性調(diào)控基因，丹皮酚通過上調(diào)miRNA-126的水平，降低大鼠單核細(xì)胞對血管內(nèi)皮細(xì)胞的黏附性。另有研究[18]發(fā)現(xiàn)，丹皮酚會抑制Toll樣受體4(Toll like receptor，TLR-4)受體及核因子κB(nuclear factor-κappaB，NF-κB)基因的表達(dá)及激活，并可顯著下調(diào)由LPS導(dǎo)致的TLR-4受體及下游NF-κB信號通路相關(guān)蛋白的表達(dá)水平，降低黏附分子的表達(dá)，改善細(xì)胞的黏附功能。也有研究人員采用腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor -α，TNF-α)作為刺激劑，加強(qiáng)了單核細(xì)胞向內(nèi)皮細(xì)胞的黏附，導(dǎo)致ICAM-1的表達(dá)增多；丹皮酚則可以抑制ICAM-1的表達(dá)，改善內(nèi)皮細(xì)胞黏附異常。進(jìn)一步的研究[19]發(fā)現(xiàn)，ICAM-1的過度表達(dá)可能與NF-κB信號通路及細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK)的磷酸化有關(guān)，丹皮酚可以抑制NF-κB p65易位入核和抑制因子B(I κBα)的磷酸化；同時(shí)也阻斷了TNF-α誘導(dǎo)的p38和ERK的磷酸化，從而抑制了ICAM-1的表達(dá)。

2.1.4 丹皮酚調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細(xì)胞的自噬和凋亡 有研究[20]發(fā)現(xiàn)，以丹酚酸B配伍丹皮酚配伍的含藥血清可以使得Bcl-2表達(dá)量升高，Bax表達(dá)量降低，表明丹皮酚可能通過抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的方式來保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞。另有研究[21]發(fā)現(xiàn)，ox-LDL引起血管內(nèi)皮細(xì)胞的自噬產(chǎn)生，而丹皮酚可以減弱自噬；研究還證明了在血管內(nèi)皮細(xì)胞中，Beclin-1是miR-30a的靶基因，Beclin-1的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物微管相關(guān)蛋白輕鏈3(microtubules associated protein light chain 3，LC3Ⅱ)蛋白的表達(dá)也受到miR-30a的調(diào)控，miR-30a表達(dá)增多時(shí)，Beclin-1和LC3Ⅱ蛋白的表達(dá)都受到抑制。丹皮酚的治療可以上調(diào)miR-30a的表達(dá)，從而抑制自噬相關(guān)基因蛋白的表達(dá)，減弱血管內(nèi)皮細(xì)胞的自噬。

2.1.5 丹皮酚抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的早衰 內(nèi)皮細(xì)胞早衰會對內(nèi)皮細(xì)胞的生長以及抗氧化作用產(chǎn)生消極影響。有研究[22]用H2O2刺激細(xì)胞，造成內(nèi)皮細(xì)胞早衰的模型，發(fā)現(xiàn)丹皮酚預(yù)處理可以直接減少刺激劑導(dǎo)致的衰老細(xì)胞的數(shù)量，改善H2O2導(dǎo)致的內(nèi)皮細(xì)胞生長停滯，使其不再長期處于G0/G1期，恢復(fù)細(xì)胞增殖的活力；丹皮酚還可下調(diào)內(nèi)皮細(xì)胞p53的過度表達(dá)，并且抑制了組蛋白H3、H4的乙酰化，從而使得Sirt1蛋白的表達(dá)降低。

2.2 丹皮酚通過調(diào)節(jié)血管平滑肌細(xì)胞功能抗AS

2.2.1 丹皮酚抑制血管平滑肌細(xì)胞過度增殖 丹皮酚可以抑制TNF-α誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞異常增殖和遷移以及后續(xù)的炎癥反應(yīng)。丹皮酚可明顯降低增殖細(xì)胞核抗原的表達(dá)；另一方面，丹皮酚可抑制TNF-α誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞的增殖和降低TNF-α刺激產(chǎn)生的炎癥因子，如IL-1β和IL-6的水平[23]。由丹皮酚會增大G0/G1期比例而縮小S期的比例，推測丹皮酚可阻止增殖的血管平滑肌細(xì)胞從G0/G1期進(jìn)入S期，從而改善血管平滑肌細(xì)胞的異常增殖。進(jìn)一步研究[24]發(fā)現(xiàn)，丹皮酚的這種作用可能與Ras-Raf-細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(Ras-Raf-extracellular regulated protein kinases1/2，Ras-Raf-ERK1/2)信號傳導(dǎo)途徑有關(guān)。通路抑制劑組與丹皮酚組的細(xì)胞存活率是相類似的；低氧狀態(tài)下有更多細(xì)胞從G0/G1期進(jìn)入S期和G2/M期。丹皮酚或通路抑制劑U0126單獨(dú)處理后，進(jìn)展至細(xì)胞周期S期和G2/M期的大鼠肺動脈平滑肌細(xì)胞數(shù)量減少，說明丹皮酚抑制平滑肌細(xì)胞增殖以及改善細(xì)胞周期進(jìn)程的作用機(jī)制是與ERK1/2有關(guān)的。實(shí)驗(yàn)研究[25-26]發(fā)現(xiàn)，丹皮酚可以阻斷內(nèi)皮細(xì)胞與平滑肌細(xì)胞共培養(yǎng)系統(tǒng)中血管平滑肌細(xì)胞的過度增殖，升高內(nèi)皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOS )mRNA的表達(dá)，降低c-fos mRNA的表達(dá)，并且通過抑制血小板源性生長因子(platelet derived growth factor-B，PDGF-B)及VEGF的表達(dá)阻斷Ras-Raf-ERK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，從而對平滑肌細(xì)胞起到保護(hù)作用。

2.2.2 丹皮酚誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞的凋亡 有研究[27]用丹皮酚干預(yù)平滑肌細(xì)胞，再將細(xì)胞與TNF-α共孵育后發(fā)現(xiàn)Bax上調(diào)，Bcl-2下調(diào)，此結(jié)果說明丹皮酚可能通過誘導(dǎo)凋亡的方式抑制平滑肌細(xì)胞的過度增殖。以丹皮酚干預(yù)共培養(yǎng)系統(tǒng)，發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮細(xì)胞所分泌的TNF-α隨丹皮酚濃度的增多而減少，血管平滑肌細(xì)胞表達(dá)的p53和活化的caspase-3水平下降，同時(shí)抑制p38MAPK信號通路的蛋白表達(dá)，說明丹皮酚可通過抑制共培養(yǎng)系統(tǒng)中內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)TNF-α分泌，抑制血管平滑肌細(xì)胞中p38 MAPK信號通路，降低凋亡相關(guān)蛋白水平，進(jìn)而抑制血管平滑肌細(xì)胞的凋亡[28]。

2.2.3 丹皮酚調(diào)節(jié)血管平滑肌細(xì)胞的自噬 有研究[29]發(fā)現(xiàn)，丹皮酚在改善血管平滑肌細(xì)胞過度增殖的同時(shí)可以增加自噬標(biāo)志蛋白LC3的表達(dá)，促進(jìn)自噬，這種作用是在激活了AMP依賴的蛋白激酶(Adenosine 5′-monophosphate-activated protein kinase，AMPK)通路后實(shí)現(xiàn)的。

2.3 丹皮酚通過調(diào)控巨噬細(xì)胞功能抗AS

2.3.1 丹皮酚減少巨噬細(xì)胞吞噬脂質(zhì) 泡沫細(xì)胞聚集于AS損傷部位是早期AS的標(biāo)志。而泡沫細(xì)胞正是由巨噬細(xì)胞吞噬脂質(zhì)而形成的。用ox-LDL刺激巨噬細(xì)胞油紅染色后發(fā)現(xiàn)，丹皮酚能明顯減少紅色油滴產(chǎn)生，并下調(diào)清道夫受體A(scavenger receptor A，SR-A) mRNA水平，結(jié)果提示丹皮酚可能通過下調(diào)SR-A mRNA減少攝取ox-LDL。另有實(shí)驗(yàn)結(jié)果[30]提示，丹皮酚可能是通過增加巨噬細(xì)胞血紅素加氧酶-1(heme oxygenase1，HO-1)蛋白表達(dá)，及影響C-Jun/CD36通路來減少巨噬細(xì)胞對ox-LDL的攝取。

2.3.2 丹皮酚促進(jìn)巨噬細(xì)胞外排膽固醇 有實(shí)驗(yàn)研究[31]發(fā)現(xiàn)，丹皮酚可能通過增加巨噬細(xì)胞ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體A1(ATP-binding cassette transporter A1，ABCA1)蛋白的表達(dá)，促進(jìn)巨噬細(xì)胞外排膽固醇。進(jìn)一步的研究[32]發(fā)現(xiàn)，丹皮酚通過促進(jìn)肝X受體α/類視黃醇X受體α(liver X receptor α/retinoid X receptor α，LXRα/RXRα)的活化，增強(qiáng)ABCA1蛋白表達(dá)，使得巨噬細(xì)胞內(nèi)膽固醇流出增多，從而減輕泡沫細(xì)胞的形成，達(dá)到抗AS的作用。

2.3.3 丹皮酚抑制巨噬細(xì)胞分泌炎癥因子 丹皮酚可降低由晚期氧化蛋白產(chǎn)物(advanced oxidation protein product，AOPP)誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞炎癥因子及iNOS的基因表達(dá)水平，促進(jìn)晚期糖基化終產(chǎn)物受體(receptor for advanced glycation end products，RAGE)和CD36蛋白水平的升高，由此認(rèn)為丹皮酚的抗氧化應(yīng)激的作用可能是激活RAGE和CD36介導(dǎo)的信號通路，降低炎癥因子的表達(dá)[33]。丹皮酚還可呈劑量依賴性地抑制LPS誘導(dǎo)的c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)、ERK1/2、p38 MAPKs的磷酸化。研究結(jié)果說明，丹皮酚是通過抑制NF-κB通路及MAPK信號傳導(dǎo)，抑制炎癥因子產(chǎn)生，提高細(xì)胞活率[34]。

3 丹皮酚對細(xì)胞間相互作用的影響

3.1 丹皮酚對血管內(nèi)皮細(xì)胞與血管平滑肌細(xì)胞相互作用的影響 有研究[35]將血管平滑肌細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞共同培養(yǎng)以LPS刺激血管平滑肌細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)丹皮酚可劑量依賴性地改善血管內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞損傷，降低炎癥因子及黏附分子的產(chǎn)生，改善血管內(nèi)皮細(xì)胞的異常黏附功能。其作用機(jī)制為丹皮酚降低PI3K/AKT磷酸化，減少p65入核以抑制下游通路的傳導(dǎo)，改善內(nèi)皮細(xì)胞損傷。用LPS對血管內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行刺激，發(fā)現(xiàn)丹皮酚可以抑制TNF-α的分泌，同時(shí)抑制共培養(yǎng)體系中血管平滑肌細(xì)胞的凋亡。進(jìn)一步研究[28]發(fā)現(xiàn)，丹皮酚可以劑量依賴性地抑制p38 MAPK通路及凋亡蛋白的激活。這說明丹皮酚可能通過抑制p38 MAPK信號通路的激活，進(jìn)而抑制血管平滑肌細(xì)胞的凋亡，達(dá)到對血管平滑肌細(xì)胞的保護(hù)作用，達(dá)到抗AS的目的。

3.2 丹皮酚對血管內(nèi)皮細(xì)胞與單核細(xì)胞相互作用的影響 外泌體是由細(xì)胞分泌的一種囊泡樣物質(zhì)，其中包含了許多如miRNA、mRNA信息，能實(shí)現(xiàn)細(xì)胞間的信息交流和相互作用[36]。研究人員將血管內(nèi)皮細(xì)胞與單核細(xì)胞共培養(yǎng)，以LPS誘導(dǎo)單核細(xì)胞炎癥反應(yīng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)丹皮酚組單核細(xì)胞所分泌出的外泌體中miR-223顯著上升，同時(shí)其下游的STAT3信號通路被抑制，內(nèi)皮細(xì)胞的黏附功能隨之得到改善。實(shí)驗(yàn)證實(shí)丹皮酚可能通過上調(diào)THP-1細(xì)胞外泌體中miR-223的表達(dá)，抑制下游STAT3的信號通路，從而抑制內(nèi)皮黏附作用，改善內(nèi)皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)[37]。

4 結(jié)語

AS作為一種形成機(jī)制復(fù)雜、病程發(fā)展漫長的慢性炎癥性疾病，得到了越來越多的關(guān)注和研究。丹皮酚能通過減輕內(nèi)皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)，調(diào)節(jié)血管平滑肌細(xì)胞功能及抑制巨噬細(xì)胞泡沫化等方面達(dá)到對AS的防治作用。影響AS病程的細(xì)胞遠(yuǎn)不止以上所提到的幾種，還包括樹突狀細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、白細(xì)胞等免疫細(xì)胞，以及紅細(xì)胞等血液細(xì)胞，但目前關(guān)于丹皮酚對于這幾類細(xì)胞的研究還鮮有報(bào)道。同時(shí)近年來miRNA也被發(fā)現(xiàn)在AS中起到重要作用，這也為以后研究丹皮酚治療AS的機(jī)制提供了更多可研究的思路。