鐘 霞，余欣彤，劉路芳，王瑜婷，劉燎原，程學仁，王壽富

(廣東一方制藥有限公司，廣東省中藥配方顆粒企業(yè)重點實驗室，廣東 佛山 528244)

丹皮酚為常用中藥徐長卿和牡丹皮的主要藥用成分，具有抑菌抗炎、解熱鎮(zhèn)痛、抗過敏、活血化瘀等作用[1-2]。因其具有水溶性差、熔點低、易揮發(fā)、見光易分解的特點，影響了其在制劑中的穩(wěn)定性和生物利用度[3]。β-環(huán)糊精(β-cyclodextrin，β-CD)有獨特的空腔結(jié)構，可在一定條件下與藥物形成包合物，能顯著提高藥物的溶解度，增強藥物的穩(wěn)定性，改善藥物的生物利用度等[4-5]。目前，有關丹皮酚包合物的制備方法多為得到包合物溶液后，再經(jīng)冷藏，抽濾，石油醚、乙醚或乙醇洗滌，低溫干燥的工序得到包合物粉末[6-12]，涉及的工序較多，制備流程復雜，且石油醚或乙醚的使用對藥物安全性和環(huán)境衛(wèi)生均具有潛在的不利影響，不適于丹皮酚-β-CD包合物的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。

噴霧干燥方式通過霧化器將原料液分散成霧滴，熱空氣與霧滴直接接觸將其干燥為粉粒狀產(chǎn)品的一種干燥過程[13-14]。噴霧干燥相對其他干燥方式具有產(chǎn)品含水量低、流動性好、粉末均一性好等優(yōu)點，已廣泛應用于食品、化工、醫(yī)藥等領域[15-16]。本研究首次采用噴霧干燥法，以包合物得率和丹皮酚包合率的綜合評分為評價指標，以β-CD與丹皮酚的用量比、β-CD與水的用量比、包合時間和噴霧干燥進出風溫度為影響因素設計L9(34)正交試驗，優(yōu)選丹皮酚-β-CD的包合工藝，以提高丹皮酚制劑過程中的穩(wěn)定性和生物利用度，為實際生產(chǎn)中丹皮酚-β-CD的包合工藝選擇提供試驗依據(jù)和參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters Arc型高效液相色譜儀(美國Waters公司)；B-290型噴霧干燥儀(瑞士Buchi公司)；SHC-Ⅰ型磁力攪拌器(國力天(深圳)科技有限公司)；SHH-250SD型藥品穩(wěn)定性試驗箱(重慶市永生實驗儀器廠)；DZF-6050型真空干燥箱(上海精宏實驗設備有限公司)；ME204E型萬分之一天平、XP26型百萬分之一天平(瑞士梅特勒-托利多公司)；KQ-500DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；Milli-Q Direct型超純水系統(tǒng)(德國Merck公司)。

1.2 試藥

丹皮酚對照品(批號：110708-201908，純度：99.8%)購自中國食品藥品檢定研究院；β-環(huán)糊精(批號：20200128，孟州市華興生物化工有限公司)；甲醇為色譜純(德國Merck公司)，水為超純水，其余試劑均為分析純。徐長卿藥材購自臨沂健源中藥材有限公司，產(chǎn)地為山東臨沂，經(jīng)廣東一方制藥有限公司魏梅主任藥師鑒定為蘿藦科植物徐長卿Cynanchumpaniculatum(Bge.)Kitag.的干燥根和根莖[17]，樣品存放于廣東一方制藥有限公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 丹皮酚結(jié)晶的制備

取徐長卿藥材，除去雜質(zhì)，迅速洗凈，切成長段，加藥材5倍量的水，水蒸氣蒸餾3 h，收集蒸餾液，蒸餾液靜置，析出結(jié)晶后過濾，自然晾干，得丹皮酚結(jié)晶。

2.2 包合物的制備方法

取丹皮酚結(jié)晶約5.0 g，精密稱定，置于研缽中，加適量95%乙醇溶解，按正交試驗表精密加入β-CD和水，混勻，在室溫下研磨至規(guī)定時間，噴霧干燥，收集噴干粉，混勻，即得。

2.3 HPLC測定丹皮酚的含量

2.3.1 色譜條件[18]色譜柱：Agilent ZORBAX SB-C18柱(150 mm×4.6 mm，5μm)；流動相：甲醇-水(45∶55)；檢測波長：274 nm；柱溫：30 ℃；流速：0.8 mL·min-1；進樣量：10μL。

2.3.2 對照品溶液的制備 取丹皮酚對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含20μg的溶液，即得。

2.3.3 供試品溶液的制備 取包合物、混合物約0.25 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，稱定重量，超聲處理(功率300 W，頻率50 kHz)30 min，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過。精密量取續(xù)濾液1 mL，置10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3.4 專屬性考察 分別精密吸取空白溶劑、對照品溶液和“2.3.3”項下供試品溶液，照“2.3.1”項下色譜條件測定，結(jié)果如圖1。結(jié)果表明，供試品溶液和對照品溶液在相同保留時間處均有較大吸收，陰性無干擾，說明測定方法專屬性較好。

注：A.對照品；B.供試品；C.陰性對照；1.丹皮酚。圖1 丹皮酚HPLC色譜

2.3.5 線性關系考察 分別精密吸取濃度為315.408μg·mL-1的丹皮酚對照品母液0.5、1、2、3、5、10 mL置10 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，制成每1 mL含15.770、31.541、63.082、94.622、157.704、315.408μg的對照品溶液。分別精密吸取上述6個不同濃度的對照品溶液，照“2.3.1”項下色譜條件測定，記錄色譜峰面積。以峰面積為縱坐標(Y)，對照品濃度為橫坐標(X)，繪制標準曲線，得回歸方程：Y=60 121X+32 368(r=1.000 0)，表明丹皮酚質(zhì)量濃度在15.770～315.408μg·mL-1范圍內(nèi)與峰面積呈良好線性關系。

2.3.6 精密度試驗 精密吸取濃度為63.082μg·mL-1的對照品溶液，照“2.3.1”項下色譜條件重復進樣6次，計算丹皮酚峰面積的RSD為0.42%，表明儀器精密度良好。

2.3.7 重復性試驗 精密稱取同一包合物樣品6份，照“2.3.3”項下方法制備供試品溶液6份，照“2.3.1”項下色譜條件測定，計算丹皮酚含量的RSD為1.86%，表明該方法重復性良好。

2.3.8 穩(wěn)定性試驗 精密吸取同一供試品溶液，分別于配制后0、2、4、8、12、24 h照“2.3.1”項下色譜條件測定，計算丹皮酚含量的RSD為2.01%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.9 加樣回收率試驗 取已知含量的丹皮酚包合物適量，精密稱取9份，每份約0.1 g，分為三組，置具塞錐形瓶中，分別按高、中、低濃度精密加入丹皮酚對照品溶液適量，照“2.3.3”項下方法制備供試品溶液，照“2.3.1”項下色譜條件測定，計算平均回收率為100.88%，RSD為2.36%，結(jié)果見表2。

表1 加樣回收率試驗結(jié)果

2.4 正交試驗設計

2.4.1 因素與水平 根據(jù)文獻報道[6-7，19-21]和前期單因素試驗結(jié)果，以β-CD與丹皮酚的用量比(A)、β-CD與水的用量比(B)、包合時間(C)、噴霧干燥進出風溫度(D)為考察因素，采用L9(34)正交試驗表進行試驗，正交試驗因素和水平設計見表2。

2.4.2 試驗方案與結(jié)果 本研究采用多指標綜合評價包合工藝[22-23]，測定各試驗組包合物收得量、包合物中丹皮酚含量，以包合物得率、丹皮酚包合率為評價指標，計算公式如下。(1)包合物得率=包合物收得量/(β-CD量+丹皮酚投入量)×100%；(2)丹皮酚包合率=包合物中丹皮酚量/(丹皮酚結(jié)晶投入量×結(jié)晶的丹皮酚含量×包合物得率)×100%。

采用Hassan法[24]對各個指標進行歸一化處理，將各指標標準化為0～1之間的“歸一值”，對于取值越大越好的指標，歸一值計算公式為：dj=(Yj-Ymin)/(Ymax-Ymin)，Yj表示第Y項指標第j次試驗的指標值，dj表示其標準化的數(shù)據(jù)。包合物得率與丹皮酚包合率均為評價包合工藝的重要指標，在評價中具有同等的重要性，因此給予兩者相同的權重系數(shù)。包合物得率標準化數(shù)據(jù)為Mj，丹皮酚包合率標準化數(shù)據(jù)為Nj，綜合評分值Pj=Mj×0.5+Nj×0.5。結(jié)果見表3、表4。

表3 丹皮酚-β-CD包合工藝正交直觀分析

表4 丹皮酚-β-CD包合工藝正交方差分析

由直觀分析結(jié)果可知，各因素對試驗結(jié)果的影響依次為C>A>B>D，即包合時間>β-CD與丹皮酚的用量比>β-CD與水的用量比>噴霧干燥進出風溫度。方差分析結(jié)果顯示，包合時間和β-CD與丹皮酚的用量比對結(jié)果有顯著影響(P<0.05)，β-CD與水的用量比和噴霧干燥進出風溫度對結(jié)果無顯著影響(P>0.05)，最優(yōu)組合為A3B2C3D3，即β-CD與丹皮酚的用量比為10∶1、β-CD與水的用量比為1∶6、包合時間為2 h、噴霧干燥的進出風溫度為185/90 ℃。

2.5 包合工藝驗證試驗

取丹皮酚結(jié)晶3份，加適量95%乙醇溶解，按優(yōu)選的包合工藝條件，進行重復驗證試驗。結(jié)果表明，驗證試驗的包合物得率和丹皮酚包合率均值分別為80.59%、81.84%，RSD分別為2.86%、2.36%，說明優(yōu)選的包合工藝穩(wěn)定、簡單、可行。

表5 驗證試驗結(jié)果 (%)

2.6 包合物穩(wěn)定性考察[2，25-26]

2.6.1 熱穩(wěn)定性 稱取丹皮酚-β-CD包合物和物理混合物(丹皮酚結(jié)晶與β-CD按1∶10的比例混合即得)適量，置密閉容器中，分別于60、80 ℃真空恒溫干燥箱內(nèi)放置10 d，第0、1、3、5、10天時取樣，測定樣品的丹皮酚含量，結(jié)果見表6。結(jié)果表明，在60 ℃下，包合物和物理混合物的丹皮酚含量均較為穩(wěn)定，在80 ℃下，物理混合物的丹皮酚含量下降較為明顯，可見，包合物的熱穩(wěn)定性優(yōu)于物理混合物。

表6 丹皮酚-β-CD包合物熱穩(wěn)定性考察結(jié)果 (n=3)

2.6.2 濕穩(wěn)定性 稱取丹皮酚-β-CD包合物和物理混合物適量，置密閉容器中，分別于溫度為25 ℃，相對濕度為75.0%和92.5%的藥品穩(wěn)定性試驗箱內(nèi)放置10 d，第0、1、3、5、10天時取樣，測定樣品的丹皮酚含量，結(jié)果見表7。結(jié)果表明，包合物受高濕條件影響較小，丹皮酚含量較穩(wěn)定，而物理混合物的丹皮酚在相對濕度為92.5%條件下，放置10天后含量呈現(xiàn)緩慢下降的趨勢，說明包合物在高濕條件下的穩(wěn)定性優(yōu)于物理混合物。

表7 丹皮酚-β-CD包合物濕穩(wěn)定性考察結(jié)果 (n=3)

3 討論

現(xiàn)有研究中，丹皮酚-β-CD包合物的制備方法主要有飽和水溶液法、研磨法和超聲法，這三種方法制得包合液后，均需要經(jīng)過冷藏，抽濾，石油醚、乙醚或乙醇洗滌，低溫干燥的過程，方可得到包合物，其包合過程耗時又耗能，丹皮酚的包合率大都在70%～80%[6-8，27]。本研究基于噴霧干燥法對丹皮酚-β-CD包合工藝進行研究，優(yōu)選出最佳包合工藝為：β-CD與丹皮酚的用量比為10∶1、β-CD與水的用量比為1∶6、包合時間為2 h、噴霧干燥的進出風溫度為185/90 ℃，驗證試驗的包合物得率與丹皮酚包合率的平均值均可達80%以上。

熱穩(wěn)定性考察過程中，在80 ℃下放置3 d后，裝有物理混合物樣品的瓶壁附著有明顯淡黃色物質(zhì)，淡黃色物質(zhì)的生成可能是丹皮酚結(jié)晶受熱升華后再凝華在瓶壁上，包合物樣品無明顯變化。在60 ℃下放置10 d內(nèi)，包合物和物理混合物樣品均無明顯變化。濕穩(wěn)定性考察過程中，在75.0%和92.5%濕度下放置5 d后，物理混合物樣品均有明顯結(jié)塊現(xiàn)象，包合物樣品均無明顯變化。結(jié)合穩(wěn)定性考察結(jié)果的丹皮酚含量變化情況，說明丹皮酚-β-CD包合物的穩(wěn)定性較物理混合物有顯著提高，結(jié)果顯示，丹皮酚與β-CD物理混合物的制劑產(chǎn)品穩(wěn)定性可能會存在一定風險。

本研究優(yōu)選的丹皮酚包合物制備工藝避免了有機溶劑的使用、環(huán)境友好、操作簡便[6]，且采用噴霧干燥的干燥方式制備包合物，極大地簡化了工藝流程，所得包合物的包合率較高、穩(wěn)定性好，提高了生產(chǎn)效率和產(chǎn)品質(zhì)量，更適于工業(yè)化生產(chǎn)，為丹皮酚包合物制備工藝的優(yōu)選提供試驗依據(jù)與參考。