徐 揚(yáng)， 趙 文

（榆林市第一醫(yī)院口腔科，陜西 榆林 719000）

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs）由于取材方便、成骨分化潛能高、免疫原性低等優(yōu)點(diǎn)，已成為骨組織再生和修復(fù)優(yōu)良的種子細(xì)胞，其可有效解決齲病、牙周病等疾病引起的牙槽骨缺損問(wèn)題， 從而促進(jìn)牙疾病的預(yù)后[1-2]。 牙槽骨缺損的修復(fù)受到骨誘導(dǎo)性生長(zhǎng)因子、成骨前體細(xì)胞、血供等因素的影響。 BMSCs 作為良好的成骨前體細(xì)胞， 其增殖需要多種骨誘導(dǎo)性生長(zhǎng)因子的調(diào)控， 而富血小板纖維蛋白（platelet-rich fibrin,PRF）自身含有的多種生長(zhǎng)因子如轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β），血小板衍生生長(zhǎng)因子（platelet derived growth factor，PDGF），可有效刺激成骨細(xì)胞的增殖和分化，PRF 中的血小板則可分泌纖維蛋白原， 保證BMSCs 遷移并促進(jìn)組織再生[3]。同時(shí)，研究報(bào)道顯示，雌激素（EST）可調(diào)控骨代謝過(guò)程中成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的增殖、分化等生物學(xué)行為，從而促進(jìn)骨組織修復(fù)，最終達(dá)到骨重建的目的[4]。 BMSCs 的生長(zhǎng)、增殖、分化受到多種因素的影響， 其中Runt 家族相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2（Runx2）、骨形態(tài)發(fā)生蛋白（bone morphogenetic protein 2,BMP2）是正性調(diào)節(jié)因子，可誘導(dǎo)成骨細(xì)胞分化、細(xì)胞基質(zhì)鈣化、骨組織形成等[5]；而miR-17 是一種高度保守的內(nèi)源性非編碼單鏈小分子RNA， 可抑制Runx2蛋白表達(dá)及堿性磷酸酶（alkaline phosphatase, ALP）活性，從而抑制牙周膜干細(xì)胞的骨向分化[6]。 目前關(guān)于雌激素、PRF 對(duì)于BMSCs 及調(diào)節(jié)性因子的作用差異，文獻(xiàn)報(bào)道并不多。 因此，本文將通過(guò)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步比較，從而為臨床治療方案的選擇提供指導(dǎo)。

1 材料和方法

1.1 材料及儀器

1.1.1 試劑 胰蛋白酶（北京索萊寶生物科技有限公司，中國(guó)）；DMEM 培養(yǎng)基、胰蛋白酶、胎牛血清（Gibco 公司，美國(guó)）；BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒（碧云天公司，中國(guó)）；鏈霉素、青霉素、磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline, PBS）、3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴鹽（MTT）、二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide, DMSO, Sigma 公司，美國(guó)）；CCK-8 試劑購(gòu)自于日本株式會(huì)社；TRIzol 試劑（Invitrogen公司，美國(guó)）；人抗兔 CD14、CD29、CD34、CD44 抗體（Biolegend 公司，美國(guó)）；羊抗人骨形態(tài)發(fā)生蛋白2一抗（Santa Cruz 公司，美國(guó)）；鼠抗人 β-actin 一抗（Sigma 公司， 美國(guó)）； 聚偏二氟乙烯（pdyvinylidene fluoride, PVDF）膜（Invitrogen 公司，美國(guó)）；17β-雌二醇（Sigma-Aldrich 公司，美國(guó)）。 堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）顯色試劑盒（碧云天，中國(guó)）；TRIzol 試劑盒（北京華邁科生物技術(shù)有限責(zé)任公司，中國(guó)）；TaqMan MicroRNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Gene Copoeia 公司，美國(guó)）等。

1.1.2 儀器 低速離心機(jī)（Thermo 公司，美國(guó)）；酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀（Molecular Devices 公司，美國(guó)）；倒置顯微鏡（Olympus 公司，日本），CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱（Forma Scientifis 公司， 美國(guó)）；PCR 擴(kuò)增儀 （ABI 公司，美國(guó)）；酶標(biāo)儀（Thermo Fisher Scientific 公司，美國(guó)），4 ℃、-20 ℃、-80 ℃冰箱（Haier 公司，中國(guó)）；凝膠成像儀（Bio-Rad 公司，美國(guó)）等。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 BMSCs 獲取 選取 2019 年 2 月—2019 年 4 月于我院口腔科拔牙過(guò)程中收集的牙槽骨骨屑（患者年齡20~30 歲，無(wú)牙根尖周疾病、無(wú)齲壞，所有供者對(duì)本次實(shí)驗(yàn)知情且同意，且本次實(shí)驗(yàn)獲得我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)），于超凈臺(tái)剝離軟組織、骨膜后，反復(fù)用磷酸緩沖鹽溶液洗滌，去除骨組織表面血液等成分，胰酶消化后將細(xì)胞去除胰酶，加入PBS，然后將細(xì)胞液滴加在等量的Percoll 分離液中，經(jīng)密度梯度離心獲得BMSCs。 并置入含有5 mL PBS、1%青霉素/鏈霉素的 15 mL 離心管，1 500 r/min 離心 5 min，隨后加入DMEM 培養(yǎng)基（含有100 μg/mL 鏈霉素、100 mg/mL 青霉素、2 mmol/L 谷氨酰胺以及15%胎牛血清）重懸細(xì)胞，接著轉(zhuǎn)入細(xì)胞培養(yǎng)皿中，于5%CO2、37 ℃條件下培養(yǎng)，2~3 d 更換1 次培養(yǎng)基，待細(xì)胞達(dá)到80%～90%融合時(shí)，用0.25 %胰蛋白酶消化、傳代，直至細(xì)胞傳至第3 代時(shí)備用。 對(duì)第3 代細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞表面抗原檢測(cè)，按照說(shuō)明書(shū)要求加入抗兔CD14、CD29、CD34、CD44 抗體， 并于流式細(xì)胞儀上檢測(cè)。

1.2.2 PRF 制備 血液來(lái)源于6 名健康志愿者（充分溝通并簽署知情同意書(shū)），每名志愿者于清晨空腹抽取 20 mL 外周靜脈血，3 000 r/min 離心 15 min。可見(jiàn)管內(nèi)血液分為3 層， 由上至下依次為血清層、白色凝膠狀PRF 層及紅細(xì)胞層，用無(wú)菌鑷子夾取中間 PRF 層，備用。 將 PRF 制成 4 mm×6 mm 大小后置入DMEM 培養(yǎng)基中，并于4 ℃下放置7 d，獲得PRF 浸出液。

1.2.3 細(xì)胞增殖 采用MTT 法檢測(cè)細(xì)胞增殖。將獲取的第 3 代 BMSCs 接種于 96 孔板中，100 μL/孔，細(xì)胞接種密度為 5×103個(gè)/mL。 培養(yǎng) 24 h 后對(duì)照組換用 10%胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）的DMEM 完全培養(yǎng)基，PRF 組換用含10% FBS 的PRF浸出液培養(yǎng)，而雌激素（EST）組換用含有10-8mol/L雌激素的10% FBS DMEM 完全培養(yǎng)基。 分別于1、3、5、7、9 d 時(shí)每孔加入 10 μL CCK-8 溶液后繼續(xù)溫孵育1 h，隨后采用酶標(biāo)儀測(cè)定每孔吸光度值，λ 為 450 nm 處吸光度值，平行 6 份，取其平均值。抑制率（%）=（實(shí)驗(yàn)組吸光度值-對(duì)照組吸光度值）/對(duì)照組吸光度值×100%。

1.2.4 ALP 活性 細(xì)胞接種密度為 5×103個(gè)/mL，培養(yǎng)24 h 后對(duì)照組換用10% FBS 的DMEM 完全培養(yǎng)基，PRF 組換用含10% FBS 的PRF 浸出液培養(yǎng)，而EST 組換用含有10-8mol/L 雌激素的10% FBS DMEM 完全培養(yǎng)基。 分別于 1、3、5、7、9 d 時(shí)收集各組細(xì)胞培養(yǎng)液，按照ALP 活性比色法定量檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)操作處理，并于405 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定硝基苯酚的吸光度值，并換算ALP 活性。計(jì)量單位為U/μg，ALP 活性=（樣品吸光度值-對(duì)照組吸光度值）/對(duì)照組吸光度值/Cp×100%， 其中樣品吸光度值為PRF組、EST 組實(shí)測(cè)值， 對(duì)照組吸光度值對(duì)照為對(duì)照組實(shí)測(cè)值，Cp 為樣品蛋白濃度。

1.2.5 BMP2 以及Runx2 蛋白表達(dá)水平 于第0、7 天抽提蛋白，并用 BCA （Bicin choninic acid）法進(jìn)行蛋白定量，于-20 ℃ 保存待用。 取樣品20 μg 進(jìn)行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophorsis, SDSPAGE，10%）實(shí)驗(yàn)，待蛋白電泳分離后轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜（polyvinglidene fluoride，PDVF）膜上，加入封閉液（5%脫脂牛奶），并于搖床上置室溫放置1 h，隨后用TBST 漂洗3 次，將膜取出，清洗，進(jìn)行一抗孵育和二抗孵育，溫孵育1 h 后，TBST 洗滌3 次。最后滴加電化學(xué)發(fā)光（electrochemi luminescence, ECL）進(jìn)行曝光顯影， 調(diào)整曝光時(shí)間直至出現(xiàn)最佳條帶，并檢測(cè)蛋白質(zhì)條帶，以 β-actin 為內(nèi)參，用Bandscan軟件分析各條帶灰度值，檢測(cè)BMP2 及Runx2 蛋白含量。

1.2.6 Runx2、miR-17 轉(zhuǎn)錄水平 細(xì)胞培養(yǎng)處理與細(xì)胞增殖相同，并于第0、7 天收集細(xì)胞，用PBS 洗2 次，使用 TRIzol 試劑盒提取血清總 RNA，以 5 μL血清總RNA 為模板， 按TaqMan MicroRNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)的要求將提取的總RNA 逆轉(zhuǎn)錄成cDNA（表 1）。 以 U6 作為內(nèi)參基因，使用熒光定量PCR 擴(kuò)增儀檢測(cè) Runx2、BMP2 mRNA 及 miR-17 相對(duì)表達(dá)量（2-ΔCt）[7]，其中 ΔCT=CTmRNA-CTU6。

表1 引物序列Table 1 Sequence of primers

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)分析軟件對(duì)不同組別各項(xiàng)指標(biāo)間差異進(jìn)行評(píng)價(jià)， 實(shí)驗(yàn)結(jié)果均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，同一指標(biāo)不同時(shí)間點(diǎn)的比較應(yīng)采用重復(fù)測(cè)量方差分析， 兩兩比較行LSD-t檢驗(yàn)或者SNK-q 檢驗(yàn)，以P<0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞表型鑒定

抗原檢測(cè)結(jié)果顯示CD29、CD44 高表達(dá)， 分別為97.23%、92.23%；CD14、CD34 低表達(dá)，分別為 4.15%、0.53%。 同時(shí)倒置顯微鏡下觀(guān)察顯示細(xì)胞呈梭形或多邊形，見(jiàn)圖1。

圖 1 原代 BMS Cs 形態(tài)（×200）Figure 1 Morphology of primary BMSCs （×200）

2.2 細(xì)胞增殖情況

3 組細(xì)胞隨著培養(yǎng)持續(xù)， 細(xì)胞數(shù)量均逐漸增加，于第7 天達(dá)到最高水平，隨后增殖逐漸減慢。 其中PRF 組、EST 組細(xì)胞于第3 天開(kāi)始細(xì)胞增殖速率顯著高于對(duì)照組，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)圖2。

圖2 3 組細(xì)胞增殖情況Figure 2 Comparison of cell proliferation in three groups

2.3 堿性磷酸酶活性

3 組細(xì)胞隨著培養(yǎng)持續(xù)， 堿性磷酸酶活性均逐漸增加，并于第7 天達(dá)到最高水平，隨后堿性磷酸酶活性增長(zhǎng)逐漸減慢。 PRF 組、EST 組細(xì)胞于第3天開(kāi)始，堿性磷酸酶活性均顯著高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)圖 3。

2.4 BMP-2 以及Runx2 蛋白表達(dá)水平

培養(yǎng) 7 d 后，PRF 組、EST 組 BMP-2 以及 Runx2蛋白表達(dá)水平均顯著高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)圖 4、5。

2.5 Runx2、miR-17 水平

BMSCs 經(jīng)處理后， 培養(yǎng) 7 d 的 miR-17 水平顯著降低，而Runx2 水平顯著增加，其中PRF 組、EST組在7 d 時(shí)表達(dá)水平顯著優(yōu)于對(duì)照組， 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表 2。

圖3 3 組細(xì)胞堿性磷酸酶活性Figure 3 Alkaline phosphatase activities in three groups

圖4 蛋白表達(dá)水平Figure 4 Protein expression level in three groups

圖5 3 組細(xì)胞培養(yǎng)7 d 后Western blot 檢測(cè)蛋白表達(dá)水平Figure 5 Western blot analysis of protein expression level in three groups after 7 days

3 討論

口腔種植過(guò)程中容易出現(xiàn)骨缺損、牙槽骨骨量不足等問(wèn)題， 牙齒被拔除后可導(dǎo)致牙槽骨吸收，引起牙槽嵴高度降低，從而影響手術(shù)效果。 骨組織工程的快速發(fā)展為骨組織的再生和修復(fù)提供了新的方法。 BMSCs 是常見(jiàn)的干細(xì)胞，由于具有多向分化潛能，在適宜條件下可分化為成骨細(xì)胞，促進(jìn)骨組織的修復(fù)，同時(shí)還能避免免疫排斥、組織配型等問(wèn)題[7]。 研究發(fā)現(xiàn)，雌激素、PRF 均可促進(jìn)骨組織的修復(fù)， 其中雌激素水平與骨組織代謝活動(dòng)密切關(guān)聯(lián)，可通過(guò)降低骨轉(zhuǎn)換、 抑制骨丟失從而提高骨密度，降低骨質(zhì)疏松性骨折的風(fēng)險(xiǎn)[8]，還能促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖、抑制破骨活性等，從而促進(jìn)骨修復(fù)，活化牙周膜干細(xì)胞中的 Wnt/β-catenin 信號(hào)通路[9]，誘導(dǎo)牙周膜干細(xì)胞的成骨分化。而PRF 是全血經(jīng)過(guò)離心后獲得的富含血小板、生長(zhǎng)因子（TGF-β、PDGF）的血漿，可有效促進(jìn)細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖、分化等生物學(xué)行為，已被用于人牙槽骨成骨細(xì)胞、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的修復(fù)[2-3]。 本文通過(guò)將獲取的人牙槽骨BMSCs 經(jīng)過(guò)雌激素、PRF 處理后發(fā)現(xiàn)， 兩組細(xì)胞隨著培養(yǎng)時(shí)間增加，細(xì)胞數(shù)量均逐漸增加，并于第7 天達(dá)到最高水平，且各時(shí)間點(diǎn)增殖水平均顯著高于對(duì)照組，表明雌激素、PRF 均可有效促進(jìn)BMSCs 的增殖。 同時(shí)，通過(guò)觀(guān)察不同時(shí)間點(diǎn)ALP 活性后發(fā)現(xiàn)， 經(jīng)雌激素、PRF 處理后，ALP 活性均顯著增加， 進(jìn)一步證實(shí)PRF 可有效地促進(jìn)細(xì)胞增殖。 ALP 是BMSCs 成骨分化最早表達(dá)的一種基因， 可評(píng)價(jià)成骨細(xì)胞功能，其水平的顯著增加可促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)磷酸含量增加，從而使得基質(zhì)鈣化，促進(jìn)成骨細(xì)胞生物礦化的過(guò)程，故而誘導(dǎo)骨組織的修復(fù)[10]。

表 2 3 組 BMSCs 經(jīng)處理后 Runx2、miR-17 表達(dá)水平（>）Table 2 Expression level of Runx2 and miR-17 in BMSCs of three groups after treatment

表 2 3 組 BMSCs 經(jīng)處理后 Runx2、miR-17 表達(dá)水平（>）Table 2 Expression level of Runx2 and miR-17 in BMSCs of three groups after treatment

注：* 表示與 0 d 對(duì)比，P<0.05。

Runx-2 mRNA 0 d 0 d 7 d EST 組 1.164±0.113 0.582±0.149* 0.893±0.087 1.863±0.156*PRF 組 1.147±0.126 0.483±0.134* 0.871±0.089 2.064±0.172*對(duì)照組 1.117±0.085 0.868±0.136* 0.883±0.077 1.637±0.148*F 2.168 14.130 19.415 10.833 P 0.143 0.000 0.000 0.001組別 miR-17 7 d

破骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨吸收與成骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨形成是一個(gè)動(dòng)態(tài)平衡的過(guò)程， 當(dāng)骨吸收強(qiáng)于骨形成時(shí)，則可導(dǎo)致骨質(zhì)疏松、骨缺損等[11]。 骨缺損修復(fù)受到人體多種因子（BMP2、ALP、TGF-β1）和信號(hào)通路（BMP/Runx2/Osx 等）的調(diào)控[5]，其中 BMP2 是目前已知的成骨活性最強(qiáng)的骨形態(tài)發(fā)生蛋白，具有較強(qiáng)的骨組織形成誘導(dǎo)能力， 可促使BMSCs 向成骨細(xì)胞分化，從而促進(jìn)細(xì)胞基質(zhì)鈣化[12]，加速骨重建。 Runx2 則是骨發(fā)育過(guò)程中激活、啟動(dòng)BMSCs 向成骨細(xì)胞分化及促進(jìn)成骨細(xì)胞成熟的轉(zhuǎn)錄因子之一[13]，還能調(diào)控多種成骨相關(guān)基因的表達(dá)，如miR-17、BMP2 等。 本研究顯示， 培養(yǎng) 7 d 后，BMP-2、Runx2 蛋白表達(dá)水平及Runx2 水平均顯著增加，表明PRF 可顯著提高BMSCs 分化、 增殖相關(guān)因子水平，從而促進(jìn)細(xì)胞增殖、分化，可加速牙槽骨骨組織的修復(fù)。 MicroRNA 作為高度保守序列，其在干細(xì)胞的自我更新和組織分化的過(guò)程中扮演著重要的角色，可通過(guò)調(diào)控細(xì)胞的增殖、分化，從而影響疾病的發(fā)生、發(fā)展。 本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)處理后，miR-17 表達(dá)顯著降低， 表明雌二醇、PRF 均可下調(diào)miR-17 的表達(dá)， 其中miR-17 表達(dá)的下調(diào)可一定程度促進(jìn)Runx2、ALP 等的表達(dá)，與鄧超等[6]的報(bào)道一致，即miR-17 可與特定的靶基因結(jié)合而抑制BMSCs 向成骨細(xì)胞的分化，進(jìn)而導(dǎo)致牙槽骨組織、牙周膜無(wú)法改建，延緩疾病的預(yù)后。 據(jù)報(bào)道PRF 含有大量的與成骨相關(guān)的生長(zhǎng)因子（如血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子、血小板源性生長(zhǎng)因子、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1 等）以及營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，可促進(jìn) BMP2、Runx2 的表達(dá)，其中 BMP2 可激活Smads 信號(hào)傳導(dǎo)及調(diào)節(jié)成骨基因轉(zhuǎn)錄。 Runx2 作為BMP2 的靶基因，可直接促進(jìn)成骨細(xì)胞特異性基因的表達(dá)（堿性磷酸酶、Osterix 等），進(jìn)一步促進(jìn)骨鈣素、骨橋素、Ⅰ型膠原蛋白等的表達(dá)，故而發(fā)揮其成骨作用[2,14]。 另一方面PRF 的超微網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)可將生長(zhǎng)因子、血小板通過(guò)化學(xué)鍵結(jié)合起來(lái)[15]，從而保證其穩(wěn)定的釋放，可有效延長(zhǎng)生長(zhǎng)因子作用時(shí)間。 同時(shí)，網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)作為細(xì)胞支架，為細(xì)胞的增殖分化提供良好的場(chǎng)所，促進(jìn)新骨形成，有利于骨組織的修復(fù)。

綜上所述，雌激素、富血小板纖維蛋白均可有效促進(jìn)人牙槽骨BMSCs 中Runx2、miR-17 及BMP2的表達(dá)，從而有利于BMSCs 的增殖、分化。