宋熙雯， 唐 燚， 宋朝卉， 胡 秀， 洪超越， 蔡 昀， 康非吾

（上海牙組織修復(fù)與再生工程技術(shù)研究中心，同濟(jì)大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院，同濟(jì)大學(xué)附屬口腔醫(yī)院口腔頜面外科，上海 200072）

骨細(xì)胞由于深嵌于細(xì)胞外基質(zhì)中，所以盡管其含量在骨組織細(xì)胞中最為豐富， 但被了解程度卻較低[1]。 在骨細(xì)胞被認(rèn)為是骨骼健康所必需的活性細(xì)胞之前， 人們認(rèn)為所有的活動(dòng)都發(fā)生在骨骼表面，而不是骨骼內(nèi)部[2]。 然而，由于骨細(xì)胞在骨基質(zhì)中的位置，以及其廣泛的樹突狀網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，使得它們能夠與血管和骨表面相互溝通。 因此，在合成和分解代謝2 種情況下，骨細(xì)胞都非常適合對(duì)破骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞進(jìn)行適當(dāng)?shù)陌邢蛘{(diào)控。 隨著研究的深入，骨細(xì)胞被認(rèn)為是一種機(jī)械感覺細(xì)胞，其負(fù)責(zé)將骨內(nèi)受到的機(jī)械力轉(zhuǎn)化為化學(xué)信號(hào)，并通過連接成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的方式來調(diào)控骨內(nèi)平衡[3]。 有研究表明，骨骼去負(fù)荷降低了組織液的流量造成病理或生理上的局部循環(huán)不足， 這些都減少了氧的輸送，使骨細(xì)胞處于缺氧環(huán)境中[4]。 骨折造成斷端及鄰近的骨膜和血管受損或中斷， 導(dǎo)致骨皮質(zhì)血液循環(huán)降低約一半，骨組織血供減少，斷端周圍氧濃度可降低至0~2%[5]。 面對(duì)低氧環(huán)境，骨細(xì)胞可通過自身調(diào)節(jié)以適應(yīng)低氧狀態(tài)，從而調(diào)節(jié)骨骼的穩(wěn)態(tài)[6]。

骨質(zhì)疏松、骨關(guān)節(jié)炎、正畸牙移動(dòng)和牙周炎的骨組織中均發(fā)現(xiàn)骨細(xì)胞凋亡，提示凋亡骨細(xì)胞可能參與骨改建[7-9]。凋亡骨細(xì)胞可以增加腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、 白介素-1（interleukin-1，IL-1）及IL-6 等促炎癥因子的產(chǎn)生來促進(jìn)破骨細(xì)胞生成， 也可通過刺激正常骨細(xì)胞分泌核因子κB 受體活化因子配體（RANKL）來招募破骨細(xì)胞[10]。

作為骨骼相關(guān)組織和細(xì)胞在低氧條件下的主要調(diào)控因子，HIF-1α 可引發(fā)下游10 種基因的轉(zhuǎn)錄，包括血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子 （vascular endothelial growth factor，VEGF）和整合素 β2（CD18）等，以幫助細(xì)胞適應(yīng)缺氧環(huán)境[11]。例如，促紅細(xì)胞生成素和血管生成化合物可導(dǎo)致血管生成增加，以便向缺氧組織輸送氧氣；糖酵解酶可以增加葡萄糖轉(zhuǎn)化為能量的能力[12-13]。因此，HIF-1α 被認(rèn)為是在缺氧條件下必不可少的細(xì)胞保護(hù)因子。 但HIF-1α 對(duì)骨細(xì)胞的影響目前仍然知之甚少， 本文擬探討低氧狀態(tài)下HIF-1α 對(duì)骨細(xì)胞系MLO-Y4 凋亡的影響。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)對(duì)象及主要試劑

小鼠長(zhǎng)骨骨細(xì)胞系MLO-Y4 （中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)）， 小牛血清 （calf serum，CS，Gibco 公司,美國(guó)）、胎牛血清（fetal bovine serum, FBS, Gibco 公司,美國(guó)），α-MEM 培養(yǎng)基（南京凱基公司，中國(guó)），Optic-MEM 培養(yǎng)基（Gibco 公司，美國(guó)），Cocl2（Sigma 公司，美國(guó)），細(xì)胞增殖/毒性檢測(cè)試劑盒（cell counting Kit-8，CCK-8， 碧云天生物技術(shù)研究所， 中國(guó)），Lipofectamine 3 000 轉(zhuǎn)染試劑盒 （L3 000 015，Invitrogen 公司，美國(guó)），TRIzol 試劑（Takara 公司，日本）、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Takara 公司，日本），RT-qPCR 試劑盒（上海翊圣生物科技有限公司，中國(guó)），Western blot 試劑盒（碧云天生物技術(shù)研究所，中國(guó)）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與處理

取適量CoCl2粉末， 用去離子水將其濃度溶解至100 mmol/L，隨后用完全培養(yǎng)液稀釋至所需實(shí)驗(yàn)濃度（100、200、300、400 μmol/L）， 刺激 MLO-Y4 細(xì)胞，建立體外低氧骨細(xì)胞培養(yǎng)體系。 將MLO-Y4 細(xì)胞接種于 α-MEM 完全培養(yǎng)液 （含 5%FBS、5%CS、1%雙抗）中，并置于 5%CO2、20%O2、飽和濕度、37 ℃的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育，每48 h 換液，待細(xì)胞匯合至70%~80%融合時(shí)， 用 0.25%胰蛋白酶消化并以1∶3傳代。 將實(shí)驗(yàn)對(duì)象分為3 組， 分別是低氧轉(zhuǎn)染組（CoCl2+siHIF-1α）、Cocl2組及對(duì)照組。

1.3 CCK-8 實(shí)驗(yàn)

將MLO-Y4 細(xì)胞按每孔2×103個(gè)的密度接種于96 孔板中，細(xì)胞貼壁24 h 后，分別設(shè)置復(fù)孔加入含100、200、300、400 μmol/L CoCl2的完全培養(yǎng)液，將孔板置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。 24 h 及48 h 后，按照說明書，于每孔加入10 μL 的CCK-8 試劑后在細(xì)胞培養(yǎng)箱中避光孵育2 h， 酶標(biāo)儀檢測(cè)細(xì)胞在450 nm 處的吸光度值。 對(duì)照組加入等體積不含CoCl2的完全培養(yǎng)液。 根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果篩選出體外模擬低氧環(huán)境合適的藥物濃度。

1.4 siRNA 轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)

選擇對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞并按照2×104個(gè)/孔的密度種板，培養(yǎng)24 h，待細(xì)胞密度達(dá)80%時(shí)，用Optic-MEM 培養(yǎng)基分別稀釋Lipofectamine 3 000 和siRNA，并按 1∶1 的比例充分混勻， 室溫孵育 5 min。 在 200 μmol/L CoCl2的作用下，MLO-Y4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 siHIF-1α，培養(yǎng)孵育 24 h。

1.5 RT-qPCR

MLO-Y4 細(xì)胞在細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h 貼壁后，用 200 μmol/L CoCl2刺激 24 h，利用 TRIzol 試劑提取細(xì)胞總RNA， 并測(cè)定樣品的濃度和純度，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA， 然后通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR 反應(yīng)，檢測(cè)MLO-Y4 細(xì)胞HIF-1α 及相關(guān)凋亡基因的表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)所需PCR 引物均由上海生工生物工程公司設(shè)計(jì)合成，PCR 引物設(shè)計(jì)見表1。 加入100 nmol/L HIF-1α siRNA 轉(zhuǎn)染， 并用 200 μmol/L CoCl2刺激24 h 后，提取總RNA 并進(jìn)行RT-qPCR，檢測(cè) CoCl2作用下HIF-1α 對(duì)MLO-Y4 細(xì)胞凋亡相關(guān)基因表達(dá)的影響。

1.6 Western blot 分析

用200 μmol/L CoCl2化學(xué)模擬低氧刺激MLOY4 細(xì)胞 24 h， 加入 100 nmol/L HIF-1α siRNA 轉(zhuǎn)染24 h，收集各組細(xì)胞，提取總蛋白。 細(xì)胞培養(yǎng)皿中加入 2×上樣緩沖液（loading buffer）裂解細(xì)胞，金屬浴100 ℃煮沸 5 min， 于 4 ℃、12 000 r/min 條件下離心10 min，取上清液于-80 ℃保存待用。 十二烴基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳 （sodium dodecyl sulfate polyacryla mide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分離蛋白， 濕轉(zhuǎn)法將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜（nitrocellulose filter membrane，NCM） 上，5%脫脂牛奶室溫封閉 2 h 后，加入鼠抗 HIF-1α（1∶300）、兔抗Caspase-3（1∶500）、兔抗 cleaved-Caspase-3（1∶500）、兔抗 JNK（1∶500）、鼠抗 β-actin（1∶1 000）4 ℃下孵育過夜。 TBST 振蕩洗膜3 次，分別加入二抗抗鼠和抗兔的辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標(biāo)記的 IgG（1∶1 000），室溫孵育 1 h，洗膜后 ECL 顯影、成像。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次， 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0和GraphPad Prism 7.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。 數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，采用單因素方差分析比較多組間差異，P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 基因引物序列Table 1 Primer sequences

2 結(jié)果

2.1 低氧對(duì)MLO-Y4 細(xì)胞增殖的影響

MLO-Y4 細(xì)胞被作用以不同濃度的CoCl2在不同時(shí)間點(diǎn)的CCK-8 實(shí)驗(yàn)結(jié)果（圖1）表明，當(dāng)作用24 h時(shí)，200 μmol/L CoCl2處理組與對(duì)照組相比，可顯著降低MLO-Y4 細(xì)胞的增殖率，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；當(dāng)作用 48 h 時(shí)，100 μmol/L CoCl2處理組與對(duì)照組相比， 可以顯著降低MLO-Y4 細(xì)胞的增殖率，差異具有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001）?？紤]到CoCl2細(xì)胞毒性的影響， 后續(xù)實(shí)驗(yàn)中選取200 μmol/L CoCl2作用24 h 作為主要的實(shí)驗(yàn)條件。

2.2 低氧狀態(tài)下MLO-Y4 細(xì)胞的凋亡情況

Hoechst 33 342 染色結(jié)果（圖 2A）顯示，與對(duì)照組相比，MLO-Y4 細(xì)胞在 200 μmol/L CoCl2作用下表現(xiàn)為細(xì)胞核固縮，鏡下呈強(qiáng)藍(lán)色熒光，凋亡比例高于對(duì)照組，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖2B，P<0.01）。TUNEL 染色結(jié)果（圖 2A）顯示，200 μmol/L CoCl2組MLO-Y4 細(xì)胞中深染棕黃色細(xì)胞核較多， 凋亡比例高于對(duì)照組，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001，圖2C）。 結(jié)果表明 200 μmol/L CoCl2可誘導(dǎo) MLO-Y4細(xì)胞凋亡。

2.3 低氧狀態(tài)下MLO-Y4 細(xì)胞表達(dá)HIF-1α 及凋亡相關(guān)基因的mRNA 和蛋白表達(dá)情況

RT-qPCR 結(jié)果（圖 3A）顯示，在 200 μmol/L CoCl2作用下，MLO-Y4 細(xì)胞促凋亡基因Caspase-3 mRNA 表達(dá)量增加 （P<0.01）， 抑凋亡基因 Bcl-2 mRNA 表達(dá)量低于對(duì)照組（P<0.01），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 細(xì)胞免疫熒光結(jié)果 （圖3B-D） 顯示，在200 μmol/L CoCl2作 用 下 ，MLO-Y4 細(xì) 胞 HIF-1α、Caspase-3 蛋白熒光明顯強(qiáng)于對(duì)照組， 蛋白熒光陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯高于對(duì)照組， 且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001）。 Western blot 結(jié)果（圖 3E、F）顯示，200 μmol/L CoCl2組細(xì)胞 HIF-1α 蛋白表達(dá)量高于對(duì)照組（P<0.05），且 Caspase-3 及 cleaved-Caspase-3的蛋白表達(dá)量也高于對(duì)照組（P<0.01）。 結(jié)果表明低氧能夠使HIF-1α 表達(dá)上調(diào)，同時(shí)增加促凋亡基因的表達(dá)。

2.4 低氧狀態(tài)下siRNA 轉(zhuǎn)染對(duì)MLO-Y4 細(xì)胞HIF-1α、Caspase-3 表達(dá)的影響

RT-qRCR 結(jié)果（圖 4A、B）顯示，低氧轉(zhuǎn)染組的HIF-1α 的 mRNA 表達(dá)低于低氧組（P<0.01），表明轉(zhuǎn)染成功； 低氧轉(zhuǎn)染組Caspase-3 的表達(dá)量也顯著低于低氧組（P<0.001）。 Western blot 結(jié)果顯示（圖 4C-F）， 低氧轉(zhuǎn)染組的 HIF-1α、Caspase-3 及 cleaved-Caspase-3 蛋白均表達(dá)低于低氧組。結(jié)果表明低氧狀態(tài)下 siHIF-1α 轉(zhuǎn)染可以降低 HIF-1α 的表達(dá) （P<0.01）、Caspase-3 的表達(dá)（P<0.01）和活化（P<0.001），減少M(fèi)LO-Y4 細(xì)胞凋亡。

圖1 不同濃度CoCl2 作用不同時(shí)間后對(duì)MLO-Y4 細(xì)胞增殖活性的影響Figure 1 Effects of concentration of CoCl2 and time on proliferation activity of MLO-Y4 cells

圖2 CoCl2 對(duì)MLO-Y4 細(xì)胞凋亡的影響Figure 2 Effect of CoCl2 on apoptosis of MLO-Y4 cells

3 討論

作為機(jī)械感應(yīng)和傳導(dǎo)細(xì)胞，骨細(xì)胞缺氧主要由非負(fù)載和骨折引起，骨細(xì)胞廢用后會(huì)快速缺氧。 在正畸-正頜聯(lián)合治療中，“外科先行”正頜手術(shù)治療方法較傳統(tǒng)“正畸-正頜-正畸”治療方法能明顯加速正頜術(shù)后正畸牙的移動(dòng)，縮短治療療程[14]。在正頜手術(shù)中，骨切開術(shù)創(chuàng)造了局部類骨折的環(huán)境，阻斷了手術(shù)區(qū)域的局部血液供應(yīng)。 此外，在骨質(zhì)疏松、骨關(guān)節(jié)炎等疾病中骨髓腔內(nèi)血流量灌注減少，這些都減少了骨組織中的氧氣運(yùn)輸[15-16]。 體內(nèi)截骨術(shù)模型顯示，骨切開后局部HIF-1α 陽(yáng)性骨細(xì)胞比例快速增加[17]。體外實(shí)驗(yàn)也證明， 在體外缺氧環(huán)境下類骨細(xì)胞系MLO-Y4 細(xì)胞 HIF-1α 表達(dá)上調(diào)[18]。 Co2+作為亞鐵螯合酶的底物，在細(xì)胞中能取代Fe2+，從而競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合血紅蛋白，使HIF-1α 的表達(dá)穩(wěn)定上調(diào)。 因此，本研究使用CoCl2體外模擬低氧環(huán)境[19]。 本研究用CoCl2體外模擬骨細(xì)胞系MLO-Y4 細(xì)胞的缺氧環(huán)境，發(fā)現(xiàn)200 μmol/L CoCl2可顯著降低 MLO-Y4 細(xì)胞的增殖率，并呈濃度和時(shí)間依賴性。

無論在生理還是病理情況下，骨改建均初始于破骨細(xì)胞的募集，被募集的破骨細(xì)胞清除局部死亡細(xì)胞，介導(dǎo)骨吸收，開始周圍骨基質(zhì)的重塑[20]。 在破骨細(xì)胞形成過程中， 骨細(xì)胞作為RANKL 必不可少的細(xì)胞來源，其表達(dá)量高于成骨細(xì)胞和骨髓基質(zhì)細(xì)胞[21]。在骨切開術(shù)中，凋亡骨細(xì)胞的迅速增加甚至早于破骨細(xì)胞出現(xiàn)，提示骨細(xì)胞凋亡可引發(fā)破骨細(xì)胞前體募集，開始骨吸收[22]。骨細(xì)胞凋亡增加導(dǎo)致可生成骨保護(hù)素（osteoproteg erin，OPG）的骨細(xì)胞數(shù)量減少，并刺激相鄰的活性骨細(xì)胞生成更多的RANKL 和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子[23]。隨著研究的深入，凋亡骨細(xì)胞在骨重建中的作用越來越受到關(guān)注。 骨細(xì)胞凋亡主要由骨骼卸載、雌激素缺乏、疲勞損傷及缺氧引起。本研究發(fā)現(xiàn)， 在 200 μmol/L CoCl2作用下，MLO-Y4細(xì)胞TUNEL 染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)多于對(duì)照組， 細(xì)胞凋亡增加， 促凋亡基因Caspase-3 的mRNA 和蛋白表達(dá)均上調(diào)，抑凋亡基因Bcl-2 表達(dá)下降，表明200 μmol/L CoCl2體外模擬低氧環(huán)境可增加MLO-Y4細(xì)胞凋亡。 凋亡相關(guān)基因和酶可調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡，Caspase-3 作為天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶家族中的一員，能降解多種關(guān)鍵的細(xì)胞內(nèi)蛋白，還能激活其他潛在的酶，促使細(xì)胞凋亡[24]。

圖 3 CoCl2 對(duì) MLO-Y4 細(xì)胞 HIF-1α、Caspase-3 mRNA 及蛋白表達(dá)的影響Figure 3 Effect of CoCl2 on the expression of mRNA and protein of HIF-1α and Caspase-3 in MLO-Y4 cells

圖 4 200 μmol/L CoCl2 作用下 siRNA 轉(zhuǎn)染對(duì) MLO-Y4 細(xì)胞表達(dá) HIF-1α、 Caspase-3 的影響Figure 4 Effect of siRNA transfection with 200 μmol/L CoCl2 on expression of HIF-1α and Caspase-3 in MLO-Y4 cells

HIF-1α 被廣泛認(rèn)為在骨形成中起正向保護(hù)作用，其可通過下游上百種基因的表達(dá)，應(yīng)對(duì)局部組織和細(xì)胞的缺氧、缺血，并改變糖代謝和氧代謝的平衡[25]。 然而，HIF-1α 的部分缺失會(huì)導(dǎo)致軟骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞凋亡的減少[26]。 骨細(xì)胞作為成骨細(xì)胞系的終末細(xì)胞，深埋于骨陷窩內(nèi)。 研究表明，骨陷窩內(nèi)氧濃度低于10%，而這一氧濃度正是HIF-1α 的脯氨酸羥基化酶（prolyl hydroxylase, PHD）活性的關(guān)鍵閾值， 提示HIF 通路在普通骨細(xì)胞功能中的重要性[26]。在骨細(xì)胞中敲除 PHD 后， 其 HIF-1α 表達(dá)上調(diào)，細(xì)胞體積與表面積減小，并有明顯的凋亡特征[27]。本研究發(fā)現(xiàn)，siHIF-1α 轉(zhuǎn)染后，MLO-Y4 細(xì)胞 HIF-1α 表達(dá)下降， 促凋亡基因Caspase-3 的表達(dá)量也表現(xiàn)為下降趨勢(shì)， 細(xì)胞凋亡減少。 當(dāng)敲除骨細(xì)胞中的von Hippel-Lindau（VHL）時(shí)，骨細(xì)胞形態(tài)改變，凋亡增加，這與本研究結(jié)果一致[28]。 HIF-1α 在其他細(xì)胞中對(duì)細(xì)胞凋亡的正向調(diào)控作用也有報(bào)道，其可通過線粒體途徑誘導(dǎo)人子宮骶韌帶成纖維細(xì)胞凋亡[29]。

由于體外給予CoCl2不能真實(shí)地反映體內(nèi)細(xì)胞在低氧環(huán)境下的復(fù)雜氧變化，且骨細(xì)胞在體內(nèi)深埋于骨基質(zhì)中， 其復(fù)雜的三維結(jié)構(gòu)在體外難以模擬；同時(shí)，在體內(nèi)低氧環(huán)境下，細(xì)胞還受到炎癥、滲透壓、 酸堿度等其他復(fù)雜因素的影響，HIF-1α 對(duì)骨組織環(huán)境下其他骨組織細(xì)胞的影響十分復(fù)雜。 因此，HIF-1α 在骨細(xì)胞凋亡中的影響還需要進(jìn)一步的研究。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)表明低氧可上調(diào)骨細(xì)胞HIF-1α表達(dá)，促進(jìn)骨細(xì)胞凋亡，且 HIF-1α 在MLO-Y4 細(xì)胞凋亡中起正向調(diào)節(jié)作用。 這加深了對(duì)骨改建局部低氧環(huán)境中低氧作用的了解， 為全面了解HIF-1α 對(duì)骨組織細(xì)胞多方面的作用提供了依據(jù)，從骨細(xì)胞角度為臨床上探究正頜術(shù)后正畸牙加速移動(dòng)提供可能的內(nèi)在機(jī)制，對(duì)認(rèn)識(shí)骨切開術(shù)、骨質(zhì)疏松、骨關(guān)節(jié)炎等生理和病理現(xiàn)象提供了一定的指導(dǎo)。