時(shí)銘鴻， 劉 鑫 ， 謝勉姣 ， 王冬梅， 李金蓮 ， 王美青 ,

（1. 新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院口腔科，河南 新鄉(xiāng) 453000；2. 第四軍醫(yī)大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院口腔解剖生理學(xué)教研室，陜西 西安 710032；3. 中國人民解放軍第960 醫(yī)院口腔科，山東 濟(jì)南 250031；4. 第四軍醫(yī)大學(xué)人體解剖與組織胚胎學(xué)教研室，陜西 西安 710032）

異常咬合的主要神經(jīng)生理、病理學(xué)特征之一為牙周本體感受器異常興奮。 牙周本體覺主要是由分布在牙周組織中的力感受器感受，其信號可以通過三叉神經(jīng)中腦核（trigeminal mesencephalic nucleus，Vme）向中樞傳遞，口腔頜面部本體感覺信息的初級神經(jīng)元位于Vme。 本課題組的前期試驗(yàn)證明，單側(cè)前牙反（unilateral anterior crossbite，UAC）可經(jīng)牙周-Vme-多個運(yùn)動性神經(jīng)核團(tuán)回路，激活多個運(yùn)動相關(guān)神經(jīng)核團(tuán)的神經(jīng)元。 Vme 神經(jīng)軸突由到三叉神經(jīng)感覺主核背內(nèi)側(cè)部（dorsomedial part of the trigeminal nucleus，Vpdm）的神經(jīng)纖維投射，繼而將咀嚼肌本體覺的信息傳導(dǎo)至對側(cè)丘腦腹后內(nèi)側(cè)核（ventral posteromedial thalamic nucleus，VPM）[1-4]，所以Vpdm 和VPM 可能是口腔頜面部本體感覺傳導(dǎo)通路的重要組成部分。 囊泡膜谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體1，2（vesicular glutamate transporter1，2，VGLUT1，2）被視為谷氨酸能軸突終末的特異性興奮性神經(jīng)遞質(zhì)標(biāo)識物[5-7]。近年來，本課題組建立了可導(dǎo)致顳下頜關(guān)節(jié)出現(xiàn)退行性變的單側(cè)前牙反（UAC）動物模型[8-9]。研究表明，UAC 可以導(dǎo)致Vme 高表達(dá) VGLUT1[10-11]。那么UAC 是否可以引起Vpdm 及VPM 神經(jīng)元的興奮性變化、 及高表達(dá) VGLUT1，2 呢？ 本文檢測了UAC 大鼠 Vpdm 及 VPM 中 VGLUT1，2 的表達(dá)變化情況，以探討異常咬合的興奮性沖動在三叉神經(jīng)傳導(dǎo)通路相關(guān)神經(jīng)核團(tuán)的神經(jīng)投射傳遞情況及其臨床意義。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

42 只 6 周齡雌性 SD 大鼠，體質(zhì)量 160~180 g，由第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物管理中心提供，動物飼養(yǎng)方式相同。 實(shí)驗(yàn)方法與操作均符合第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物管理中心使用規(guī)定。 6 只大鼠于下牙槽注射霍亂毒素 B 亞單位 （cholera toxin B subunit，CTb，Sigma 公司，美國），跨節(jié)追蹤實(shí)驗(yàn)，分為 UAC 組和對照組（n=3）。 將其余 36 只大鼠隨機(jī)分為 UAC 組和對照組，分為2、4 和8 周3 個時(shí)間點(diǎn)，每個時(shí)間點(diǎn)設(shè)3 只大鼠用于組織形態(tài)學(xué)觀察，3 只用于實(shí)時(shí)定量 PCR 和 Western blot 檢測。

1.2 UAC 模型的建立

采用本課題組此前報(bào)道的方法[10-11]。 UAC 組大鼠用戊巴比妥鈉（上海信然生物科技公司，中國）麻醉后，在左側(cè)上、下頜切牙處分別進(jìn)行不良修復(fù)體的粘接：上頜不良修復(fù)體使用25 號通乳針，切割成 3 mm 的金屬短管； 用20 號通乳針制成一端有3~4 mm 長導(dǎo)板的下頜不良修復(fù)體， 用鉗子將導(dǎo)板壓扁，導(dǎo)板與主管（5 mm 長）做成 45°角。 用牙科粘接劑分別將上下頜不良修復(fù)體（套筒冠）粘接在左側(cè)上下頜切牙上，上下修復(fù)體呈反關(guān)系。 實(shí)驗(yàn)期間定期觀察，確保不良修復(fù)體沒有脫落。

對照組大鼠進(jìn)行相同的操作，但不粘接不良修復(fù)體。 所有動物給予相同的飼養(yǎng)條件。

1.3 束路追蹤

1.3.1 CTb 下牙槽神經(jīng)注射 UAC 組3 只大鼠造模1 周后，采用本課題組報(bào)道的方法[10-11]，麻醉后切開大鼠左側(cè)頜面部皮膚并切斷咬肌， 暴露出下頜支。 用牙鉆在下頜支鉆開一個長寬約3 mm 的小骨窗， 找到下牙槽神經(jīng)， 用微量進(jìn)樣器抽取6~8 μL 1%的CTb 水溶液， 緩慢注入所暴露出的下牙槽神經(jīng)內(nèi)。 蓋住骨窗，縫合咬肌及皮膚。 動物存活5 d 后取材。 對照組動物在同一時(shí)間作相同處理。

1.3.2 生物素化葡聚糖胺注射 采用本課題組報(bào)道的方法[10-11]，大鼠麻醉后，在立體定位儀上固定頭部，鉆開動物顱骨，將10%的生物素化葡聚糖胺（biotinylated dextran， BDA，Molecular Probes 公司 ，美國）用微量進(jìn)樣器注射入大鼠Vpdm 內(nèi)，原位留針30 min，動物存活7 d 取材。

1.4 組織取材

免疫熒光組織切片標(biāo)本取材，大鼠用戊巴比妥鈉腹腔麻醉后， 左心室插管進(jìn)入升主動脈，300 mL 0.01 mol/L 磷酸鹽緩沖液沖洗血液，用含4%多聚甲醛及15%飽和苦味酸的0.1 mol/L 磷酸緩沖液（pH 7.2~7.4）約 500 mL 動物灌注固定。 迅速取腦，并在上述相同的固定液中固定4 h（4 ℃），將其放置于含30% 蔗糖的 0.1 mol/L PB 中。 制備厚度 25 μm 的冰凍組織切片， 收集在含有適量0.01 mol/L 磷酸鹽緩沖液的6 孔板中。 Western blot 大鼠深度麻醉，迅速斷頭取腦，冰上迅速取出含有Vpdm、VPM 平面的組織，-80 ℃?zhèn)溆谩?進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR、Western blot 組織檢測。

1.5 免疫熒光染色

取下牙槽神經(jīng)注射CTb 動物的Vpdm 平面，做VGLUT1、CTb、神經(jīng)元特異性標(biāo)識物NeuN 的免疫熒光三標(biāo)。 兔抗 VGLUT1 IgG （1∶500，Synaptic System公司，德國）、小鼠抗 NeuN IgG（1∶1 000, Millipore 公司，美國）和山羊抗 CTb IgG（1∶2 000, List Biological公司，美國），室溫條件下進(jìn)行切片孵育，過夜；生物素標(biāo)記的驢抗山羊 IgG （1∶200, Chemicon 公司，美國），室溫條件下孵育切片3 h；Alexa488 結(jié)合的驢抗山羊 IgG（1∶300, Abcam 公司，美國）、Alexa594 結(jié)合的驢抗兔 IgG（1∶300, Abcam 公司，美國）和 Alexa647結(jié)合的驢抗小鼠 IgG（1∶300, Abcam 公司，美國）混合孵育切片6 h。所用稀釋液是含5%驢血清、0.25%角叉菜膠、0.05%疊氨鈉及 0.5% Triton X-100 的0.05 mol/L PBS。 每只動物的切片每隔3 張選取1 張片子染色，反應(yīng)結(jié)束后，裱片、封片，用激光共聚焦顯微鏡（Olympus 公司，日本）觀察 CTb 注射同側(cè)Vpdm 染色情況并拍照。隨機(jī)選取10 張片子進(jìn)行陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)。

BDA 準(zhǔn)確注射到Vpdm 的動物，取Vpdm 層面切片在加入 FITC-Avidin IgG（10 μg/mL,Molecular prbes公司，美國）的稀釋液中孵育6 h。 VPM 層面切片兔抗 VGLUT1 IgG（1∶500, Synaptic System 公司，德國）、小鼠抗 NeuN IgG（1∶1 000, Millipore 公司，美國）室溫過夜；FITC-Avidin IgG，Alexa594 結(jié)合的驢抗兔IgG（1∶300, Abcam 公司，美國）和 Alexa647 結(jié)合的驢抗小鼠 IgG（1∶300, Abcam 公司，美國）混合孵育切片6 h。用共聚焦顯微鏡觀察BDA 注射對側(cè)VPM染色情況并拍照。 陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)方法同上。

1.6 Western blot

動物深度麻醉后，冰上取Vpdm 和VPM 平面的組織放到含有蛋白酶及磷酸酶抑制劑緩沖液的離心管中，超聲裂解后靜置。4 ℃，12 000 g 離心10 min，吸出上清液。 用BCA 試劑盒進(jìn)行蛋白含量的測定。配制分離膠和濃縮膠，每個孔緩慢加入30 μg 蛋白的樣品；恒壓80 V 跑膠30 min 后，調(diào)至恒壓120 V，繼續(xù)電泳，直到溴酚藍(lán)跑到底部，電泳結(jié)束。4 ℃，恒流300 mA，轉(zhuǎn)膜2 h。將轉(zhuǎn)移膜放置在含有5% 脫脂奶粉的TBST 溶液中封閉1 h。 孵育抗體，小鼠抗 VGLUT1（1∶500, Millipore 公司，美國），小鼠抗VGLUT2（1∶500,Millipore 公司，美國），小鼠抗 β-actin（1∶5 000, Abcam 公司，美國）。4 ℃過夜。TBST 溶液洗膜10 min，共3 次。 用辣根過氧化物酶結(jié)合的山羊抗小鼠 IgG（1∶5 000, Abcam 公司，美國），室溫?fù)u床慢搖孵育1~2 h。TBST 溶液洗膜10 min，共3 次。用ECL 試劑盒顯示蛋白條帶，進(jìn)行最終的曝光和拍照。 Image J 軟件分析所得到條帶的密度。

1.7 實(shí)時(shí)定量PCR

移液器槍頭和離心管去除RNA 降解酶處理。將Vpdm 和VPM 組織充分碎裂， 加入1 mL TRIzol溶液， 混勻置冰上2 h 后加入200 μL 三氯甲烷，震蕩后靜置 15 min。 4 ℃，12 000 g 離心 15 min，吸取上層水相至另一干凈的離心管中。 加入500 μL 異丙醇，震蕩后靜置 20 min。 4 ℃，12 000 g 離心 15 min，棄上清液，加入1 mL、4 ℃ 的75%乙醇, 輕輕震蕩，4 ℃，7 500 g 離心 10 min 后去除乙醇，對 RNA 充分干燥。 用焦碳酸二乙酯（dieth ylpyoo carbonate，DEPC）水溶解RNA，測定濃度。RNA 反轉(zhuǎn)錄的cDNA產(chǎn)物溶液最終用于實(shí)時(shí)定量PCR 檢測。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 下牙槽神經(jīng)-Vme-Vpdm-VPM 通路

在激光共聚焦顯微鏡下觀察可見，CTb 標(biāo)記的Vme 神經(jīng)元軸突終末在Vpdm 神經(jīng)元周圍表現(xiàn)為VGLUT1 免疫陽性，UAC 組 VGLUT1 的表達(dá)高于對照組（圖1）。 陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果表明：UAC 組 CTb單標(biāo)陽性細(xì)胞、CTb 和NeuN 雙標(biāo)陽性細(xì)胞數(shù)，CTb、VGLUT1 和 NeuN 三標(biāo)陽性細(xì)胞數(shù)， 以及 CTb、VGLUT1 和NeuN 三標(biāo)陽性細(xì)胞占CTb 單標(biāo)陽性細(xì)胞數(shù)的百分比均顯著高于對照組（圖2）。 在Vpdm 成功注射BDA 大鼠（圖 3A）的對側(cè) VPM，可觀察到BDA 標(biāo)記的軸突終末投射（圖3B），BDA 軸突分布在VPM 神經(jīng)元周圍， 與表達(dá)VGLUT1 免疫陽性的Vpdm 神經(jīng)元有軸突終末接觸； 但是陽性細(xì)胞觀察結(jié)果和計(jì)數(shù)結(jié)果， 均未顯示UAC 組和對照組之間有明顯的差異（圖 4、5）。

圖 1 下牙槽神經(jīng)注射CTb 動物的Vpdm 處CTb、VGLUT1 和NeuN三標(biāo)情況Figure 1 Triple-immunofluorescence histochemistry for cholera toxin B subunit (CTb), vesicular glutamate transporter 1 (VGLUT1) and NeuN in Vpdm from animals injected with CTb in the inferior alveolar nerve

2.2 Vpdm 和 VPM 內(nèi) VGLUT1，2 的表達(dá)

圖3 Vpdm 定點(diǎn)注射BDA（A）后 對側(cè)VPM 處BDA 的表達(dá)情況（B）Figure 3 Injection of biotinylated dextran BDA at Vpdm (A) and the BDA positive fibers at the contra-lateral VPM(B)

圖4 UAC 實(shí)驗(yàn)組和對照組之間Vpdm 處注射BDA 后對側(cè)VPM處 BDA、VGLUT1 和 NeuN 三標(biāo)圖比較Figure 4 Triple-immunofluorescence histochemistry for biotinylated dextran (BDA), vesicular glutamate transporter 1(VGLUT1)and neuronal nuclei (NeuN)at contralateral side VPM,which were compared between the UAC group and the control group after BDA injected at Vpdm

圖2 UAC 實(shí)驗(yàn)組和對照組Vpdm 染色結(jié)果比較Figure 2 Comparison of the Vpdm staining between UAC and control group

實(shí)時(shí)定量PCR 結(jié)果表明，2~8 周的各時(shí)間點(diǎn)，UAC 組 Vpdm 中VGLUT1 mRNA 表達(dá)水平均高于同期對照組（P<0.05），VGLUT2 mRNA 表達(dá)水平則沒有顯著差異 （圖 6）；UAC 組 VPM 中 VGLUT1，2 的mRNA 表達(dá)與對照組均無顯著差異（圖7）。

Western blot 檢測結(jié)果顯示，2~8 周的各時(shí)間點(diǎn)，UAC 組Vpdm 中VGLUT1 蛋白表達(dá)在各個時(shí)間點(diǎn)均高于同期對照組 （P<0.01， 圖 8）； 但 VPM 的VGLUT1,2 蛋白表達(dá)與對照組相比， 均無顯著差異（圖 9）。

3 討論

圖5 UAC 實(shí)驗(yàn)組和對照組VPM 染色結(jié)果比較Figure 5 Comparison of the VPM staining between UAC and control groups

圖6 2、4 和8 周時(shí)間點(diǎn)對照組和UAC 組的Vpdm 中實(shí)時(shí)定量PCR 檢測的VGLUT1，2 的mRNA 表達(dá)水平比較Figure 6 Comparison of the mRNA expression level of VGLUT1,2 in Vpdm between control and UAC group at 2, 4, and 8 weeks detected by real-time PCR

圖7 2、4 和8 周時(shí)間點(diǎn)對照組和UAC 組的VPM 中實(shí)時(shí)定量PCR 檢測的VGLUT1，2 mRNA 表達(dá)水平比較Figure 7 Comparison of the mRNA expression level of VGLUT1,2 in VPM between control and UAC group at 2, 4, and 8 weeks detected by real-time PCR

圖8 2、4 和 8 周時(shí)間點(diǎn)對照組和UAC 組的Vpdm 中 Western blot檢測的VGLUT1 蛋白表達(dá)水平比較Figure 8 Comparison of the expression level of VGLUT1,2 protein in Vpdm between control and UAC group at 2,4,and 8 weeks detected by Western blot assay

圖9 2、4 和 8 周時(shí)間點(diǎn)對照組和 UAC 組的 VPM 中 Western blot檢測的VGLUT1，2 蛋白表達(dá)水平比較Figure 9 Comparison of the expression level of VGLUT1,2 protein in VPM between control and UAC group at 2, 4,and 8 weeks detected by Western blot assay

牙周本體覺是一種非常重要的咬合感覺，咬合本體覺信息主要通過Vme 神經(jīng)元向中樞傳遞。Vme 神經(jīng)元是唯一位于中樞的初級神經(jīng)元，Vme 軸突有向同側(cè)Vpdm 的投射。VPM 是感覺信息向皮層傳遞的重要中繼站[12]，接受來自Vpdm 的傳入纖維[13]。在UAC 的刺激下，Vpdm 是否可以被激活， 進(jìn)而將興奮性信號傳遞至VPM，以VGLUT1,2 的途徑導(dǎo)致其興奮，影響口腔頜面部感覺信息的傳遞，是學(xué)研究所關(guān)注的重要內(nèi)容之一。 谷氨酸在三叉系統(tǒng)各級神經(jīng)元間興奮性突觸傳遞中發(fā)揮了重要作用。VGLUT 可分為 VGLUT1、VGLUT2 和 VGLUT3 3 種亞型，VGLUT1 和VGLUT2 被視為谷氨酸能軸突終末的特異性標(biāo)識物， 其表達(dá)水平的變化可用來說明谷氨酸能神經(jīng)元興奮性突觸傳遞的變化。 Vme表達(dá) VGLUT1 而不表達(dá) VGLUT2[2]；Vpdm 則既表達(dá) VGLUT1，又表達(dá)VGLUT2[13]。 本課題組以往的研究發(fā)現(xiàn)，UAC 可以促進(jìn)Vme 神經(jīng)元表達(dá)VGLUT1，即產(chǎn)生興奮性信號，被激活的Vme 通過興奮三叉神經(jīng)運(yùn)動核、面神經(jīng)核、副神經(jīng)核、舌下神經(jīng)核等處的神經(jīng)元，導(dǎo)致咀嚼肌、鐙骨肌、胸鎖乳突肌及舌肌等相關(guān)肌活動異常[10-11]。

本文通過采用下牙槽神經(jīng)注射CTb 及在Vpdm注射BAD 的束路追蹤技術(shù)， 以免疫熒光三標(biāo)的方法， 印證了文獻(xiàn)中所報(bào)道的下牙槽神經(jīng)-Vme-Vpdm傳導(dǎo)通路以及Vpdm-VPM 傳導(dǎo)通路的存在[1-4]。 同時(shí)采用形態(tài)學(xué)、 陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)合Western blot 和實(shí)時(shí)定量PCR 等方法進(jìn)行研究。 結(jié)果表明：UAC 異常咬合可以上調(diào)Vpdm 中VGLUT1 的蛋白表達(dá)水平，使其興奮， 表現(xiàn)為VGLUT1 的mRNA 表達(dá)水平增高。 本文 CTb 注射實(shí)驗(yàn)顯示，Vpdm 有來自 Vme 的投射， 而且CTb+VGLUT+NeuN 的三標(biāo)陽性細(xì)胞數(shù)在UAC 組明顯增加， 這說明UAC 可能通過興奮Vme（表現(xiàn)為該部VGLUT1 的mRNA 表達(dá)水平增高），并通過VGLUT1（蛋白）使Vpdm 神經(jīng)元興奮（表現(xiàn)為該部VGLUT1 的mRNA 表達(dá)水平增高）。 本課題組曾預(yù)期， 興奮的Vpdm 神經(jīng)元可將興奮性信號通過VGLUT1（蛋白）傳遞到對側(cè)VPM，但通過形態(tài)學(xué)和陽性細(xì)胞統(tǒng)計(jì)、Western blot 檢測，在蛋白水平上，沒有發(fā)現(xiàn) UAC 組 VPM 中 VGLUT1 和 VGLUT2 的高表達(dá)，進(jìn)一步采用實(shí)時(shí)定量PCR 檢測方法研究顯示，UAC 組 VPM 中 VGLUT1,2 的 mRNA 表達(dá)水平均未見明顯增高， 這說明UAC 可通過Vme 興奮導(dǎo)致Vpdm 興奮， 但該興奮性信號可能并沒有通過VGLUT1,2 繼續(xù)上傳到 VPM。 因此，UAC 異常咬合所引起的由VGLUT1 介導(dǎo)的興奮性信號，可能主要在與Vme 有直接突觸聯(lián)系的神經(jīng)核團(tuán)（如上文所述三叉神經(jīng)運(yùn)動核、面神經(jīng)核、副神經(jīng)核、舌下神經(jīng)核）之間傳遞，有關(guān)結(jié)論尚需要采取電生理等方法進(jìn)一步研究證實(shí)。

本文及本課題組之前報(bào)道的研究結(jié)果[1-2]提示：UAC 所致Vme 興奮性神經(jīng)沖動可能更多地導(dǎo)致與低級中樞信號傳遞相關(guān)癥狀的出現(xiàn)，而向高一級中樞傳遞的情況尚待進(jìn)一步論證（圖10）。 這提示：在臨床診療一些與異常咬合所致神經(jīng)活動相關(guān)問題時(shí)，需要重點(diǎn)關(guān)注與低級中樞支配相關(guān)的癥狀。

圖10 本文針對Vme-Vpdm-VPM 神經(jīng)傳導(dǎo)通路研究的結(jié)論示意圖Figure 10 Diagram for the obtaining from the present data focusing on Vme-Vpdm-VPM pathway

綜上所述，UAC 促進(jìn)了Vpdm 的VGLUT1 表達(dá)，但對VPM 的VGLUT1,2 表達(dá)水平?jīng)]有顯著影響。