陳元菁，艾紅軍，王湘云，吳 瓊，常 雁，劉錦銘（上海市楊浦區(qū)控江醫(yī)院呼吸科，上海 200090）

慢性阻塞性肺疾?。╟hronic obstructive pulmonary disease，COPD）是一種多因素參與、多機(jī)制介導(dǎo)的全身性慢性炎癥性疾病，具有明顯的肺外效應(yīng)，其中骨骼肌功能障礙（skeletal muscle dysfunction，SMD）因其對預(yù)后的嚴(yán)重影響而愈發(fā)引起重視[1-2]。COPD 并發(fā)SMD 的機(jī)制尚不十分清楚，普遍認(rèn)為與全身系統(tǒng)性炎癥、營養(yǎng)不良、運(yùn)動(dòng)量不足、缺氧、激素使用等所致患者肌肉損失有關(guān)，從而造成患者運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度、耐力下降，甚至誘發(fā)COPD 急性發(fā)作[3-4]。近年來，研究發(fā)現(xiàn)線粒體作為機(jī)體代謝與活動(dòng)所需能量及自由氧重要提供者，其功能變化可能與COPD 并發(fā)SMD 存在聯(lián)系[5]，但相關(guān)研究較少且缺乏足夠循證學(xué)依據(jù)。本研究通過檢測COPD患者外周血單核細(xì)胞（peripheral blood mononuclear cells，PMBCs）線粒體功能、代謝水平變化，分析其與骨骼肌功能的相關(guān)性，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 研究對象 回顧性分析2018年12月～2019年12月楊浦區(qū)控江醫(yī)院呼吸內(nèi)科門診就診的60 例COPD 患者的臨床資料。入組標(biāo)準(zhǔn)：①均符合中華醫(yī)學(xué)會發(fā)布的《慢性阻塞性肺疾病診治指南（2013年修訂版）》的診斷標(biāo)準(zhǔn)[6]；②年齡18～70 歲；③排除支氣管擴(kuò)張、哮喘、肺癌等嚴(yán)重肺部疾病，或并發(fā)重要器官功能障礙者。其中男性37 例，女性33 例；年齡48～70（52.8±4.6）歲；COPD 病程2～15（9.3±2.5）年。根據(jù)患者是否并發(fā)SMD，分為COPD-SMD 組（n=21）和COPD 組（n=39）。另選擇本院同期健康體檢者30 例作為對照組，排除心腦肝腎等疾病。其中男性15 例，女性15 例；年齡45～70（51.6±4.3）歲。各組年齡、性別構(gòu)成比等基本資料比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。本研究獲所有患者或家屬知情同意。

1.2 儀器與試劑 人外周血淋巴細(xì)胞分離液（Solarbio），TGL-16B 臺式離心機(jī)（上海安亭），QIAamp DNA 提取試劑盒（德國QIAGEN），BriCyte E6 流式細(xì)胞儀（邁瑞）及JC-1（美國sigma）、熒光探針DCFH-DA（美國Thermo）試劑盒，科斯邁SMART 300 全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光測定儀，試劑盒由福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司提供。

1.3 方法

1.3.1 線粒體功能檢測：抽取患者空腹外周靜脈血3 ml，肝素抗凝，按密度梯度離心法用淋巴細(xì)胞分離液分離出PBMCs，分裝后于-80℃保存。采用QIAamp DNA 提取試劑盒提取線粒體DNA（mitochondrial DNA, mtDNA），采用實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR 檢測mtDNA 拷貝數(shù)。采用流式細(xì)胞術(shù)檢測線粒體膜電位和細(xì)胞內(nèi)活性氧（reactive oxide species，ROS），試劑盒分別為JC-1、熒光探針DCFH-DA。二者均以平均熒光強(qiáng)度（MFI）表示，激發(fā)波長、發(fā)射波長分別為488nm，520 nm。

1.3.2 代謝指標(biāo)檢測：取2ml 外周靜脈血，分離血清，采用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測血清胰島素樣生長因子-1( insulin-like growth factor-1，IGF-1)及瘦素(LP)水平，采用化學(xué)發(fā)光免疫法檢測空腹胰島素(fasting insulin，F(xiàn)INS)水平，試劑盒均由福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司提供，所有操作嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。

1.3.3 骨骼肌功能檢測：采用Nicolet Viking Quest型肌電誘發(fā)電位儀，陽極置于髕骨上緣與髂前上棘連線的中點(diǎn)，刺激電極沿肌肉纖維走形2 cm 處，刺激肌肉收縮后觀察股神經(jīng)傳導(dǎo)時(shí)間及動(dòng)作電位幅度。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 17.0 軟件包對研究數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t 檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組PBMCs 線粒體功能比較 見表1。與對照組比較，COPD 組、COPD-SMD 組PBMCs 中mtDNA 拷貝數(shù)、膜電位顯著下降，ROS 則顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。上述指標(biāo)在COPD-SMD 組與COPD 組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表1 各組PBMCs 線粒體功能比較(±s)

表1 各組PBMCs 線粒體功能比較(±s)

注：t1：COPD 組vs 對照組；t2：對照組vs COPD-SMD 組；t3：COPD 組vs COPD-SMD 組。

項(xiàng)目 對照組（n=30） COPD 組（n=39） COPD-SMD 組（n=21） t1 t2 t3 P mtDNA（copies） 2.38±0.23 2.07±0.37 1.36±0.49 4.03 10.26 9.97 ＜0.05 ROS 36.33±9.25 40.45±10.18 48.14±12.27 2.73 5.28 3.92 ＜0.05膜電位 2 386.88±651.90 1 980.67±505.47 1 352.63±306.61 2.92 9.24 6.75 ＜0.05

2.2 各組機(jī)體代謝水平比較 見表2。COPD-SMD組、COPD 組LP，F(xiàn)INS 顯著高于對照組，IGF-1較對照組顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。COPD-SMD 組LP，F(xiàn)INS 顯著高于COPD 組，IGF-1 較COPD 組顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表2 各組機(jī)體代謝水平比較(±s)

表2 各組機(jī)體代謝水平比較(±s)

注：t1：COPD 組vs 對照組；t2：對照組vs COPD-SMD 組；t3：COPD 組vs COPD-SMD 組。

項(xiàng)目 對照組（n=30） COPD 組（n=39） COPD-SMD 組（n=21） t1 t2 t3 P LP(μg/L) 13.37±2.38 21.06±7.25 40.39±10.23 5.57 10.25 8.50 ＜0.05 IGF-1(μg/L) 45.33±9.15 38.45±8.26 16.14±4.18 3.27 14.26 11.57 ＜0.05 FINS(mIU/L) 12.83±3.93 18.34±4.57 24.93±6.34 5.27 8.01 6.64 ＜0.05

2.3 線粒體功能、代謝水平與股神經(jīng)功能相關(guān)性 見表3。Pearson 線性相關(guān)分析顯示，股神經(jīng)傳導(dǎo)時(shí)間與mtDNA、膜電位、LP 均呈顯著負(fù)相關(guān)，與ROS，IGF-1 呈顯著正相關(guān)性（P＜0.05）。股神經(jīng)動(dòng)作電位幅度與mtDNA，膜電位、LP，F(xiàn)INS 均呈顯著正相關(guān)，與ROS，IGF-1呈顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05）。

表3 線粒體功能、代謝水平與股神經(jīng)功能相關(guān)性

3 討論

SMD作為COPD患者最重要的肺外表現(xiàn)之一，因其在發(fā)病早期缺乏典型癥狀易被忽略，隨著病情進(jìn)展可出現(xiàn)肌肉體積減小、運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度減弱、運(yùn)動(dòng)耐力下降，嚴(yán)重影響患者生存質(zhì)量與預(yù)后[7]。最新指南強(qiáng)調(diào)，穩(wěn)定期COPD 患者的綜合評估中應(yīng)納入SMD，代謝綜合征等并發(fā)癥的評估。目前，COPD患者并發(fā)SMD 尚無特殊有效治療方法，多局限于運(yùn)動(dòng)鍛煉、營養(yǎng)支持方面，但效果并不明顯。現(xiàn)研究已證實(shí)，氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡增加是導(dǎo)致肌肉丟失、萎縮進(jìn)而誘發(fā)SMD 的主要機(jī)制之一，線粒體結(jié)構(gòu)與功能障礙在COPD 并發(fā)SMD 中發(fā)揮著重要作用[8-9]。

線粒體作為骨骼肌運(yùn)動(dòng)所需能量的主要合成場所，可通過其通透性轉(zhuǎn)換孔調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡，且線粒體呼吸鏈在氧化磷酸化反應(yīng)產(chǎn)生ATP 的同時(shí)產(chǎn)生大量ROS，可能導(dǎo)致DNA 損傷，進(jìn)而引起呼吸鏈相關(guān)蛋白質(zhì)合成障礙，形成缺陷呼吸鏈[10]。mtDNA是真核細(xì)胞除核DNA 外唯一的遺傳物質(zhì)，每個(gè)線粒體中約有2～10 拷貝mtDNA，近年來在肺部疾病的診治及預(yù)后評估中的應(yīng)用愈發(fā)廣泛，被視為線粒體功能的敏感指標(biāo)。本研究中，COPD 患者PBMCs中mtDNA 拷貝數(shù)、膜電位顯著下降，ROS 則顯著升高（P＜0.05），而COPD 并發(fā)SMD 患者線粒體功能損傷更為突出，從而加劇對線粒體呼吸功能及細(xì)胞內(nèi)氧化磷酸化過程的抑制，導(dǎo)致細(xì)胞產(chǎn)能持續(xù)下降[11]。KONOKHOVA 等[12]研究發(fā)現(xiàn)，與健康對照組相比，COPD 患者肌肉組織中DNA 氧化損傷產(chǎn)物羥脫氧鳥苷（8-OHdG）水平顯著高于健康人群，且mtDNA 分布密度下降，缺失率升高。戶元元等[13]報(bào)道稱，ROS 的大量釋放可通過影響肌質(zhì)網(wǎng)功能、肌球蛋白ATP 酶功能及肌細(xì)胞線粒體呼吸功能等途徑引起肌組織萎縮、肌纖維類型轉(zhuǎn)換導(dǎo)致骨骼肌消耗增加。

骨骼肌是胰島素介導(dǎo)的葡萄糖攝取、代謝的重要靶器官，COPD 患者在長期反復(fù)炎癥、氧化應(yīng)激狀態(tài)刺激下，下丘腦-垂體-腎上腺皮質(zhì)系統(tǒng)激活后促進(jìn)糖皮質(zhì)激素、兒茶酚胺等升血糖激素釋放，易導(dǎo)致骨骼肌出現(xiàn)胰島素抵抗（IR）[2]。研究認(rèn)為，骨骼肌IR 與ROS 含量密切相關(guān)，生理水平ROS有助于維持骨骼肌強(qiáng)度，而過量ROS 通過損害線粒體功能、葡萄糖攝取導(dǎo)致骨骼肌IR[14]。本研究結(jié)果顯示，隨著SMD 的發(fā)生，COPD 患者血清LP，F(xiàn)INS 顯著升高，IGF-1 顯著降低（P＜0.05），與朱木林等[15]研究結(jié)果相似，表明COPD 并發(fā)SMD患者機(jī)體代謝水平升高，對脂肪合成抑制作用增強(qiáng)，能量消耗增加，促進(jìn)骨骼肌蛋白質(zhì)的分解。相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，股神經(jīng)傳導(dǎo)時(shí)間及動(dòng)作電位幅度與mtDNA，膜電位、LP 存在顯著相關(guān)性（P＜0.05），進(jìn)一步證實(shí)了SMD 嚴(yán)重程度與線粒體功能、代謝水平密切相關(guān)。

綜上所述，COPD 患者存在線粒體功能減退，代謝水平異常，且與SMD 的發(fā)生密切相關(guān)，線粒體功能、代謝水平有望成為COPD 患者骨骼肌功能的評估指標(biāo)。鑒于本研究樣本較少，且未對不同病情COPD 進(jìn)行分層分析，所得結(jié)論尚需大樣本、更為完善的研究設(shè)計(jì)深入驗(yàn)證。