陶昭君,成 軍，戴玉柱

(中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第九〇三醫(yī)院a.醫(yī)學(xué)工程科；b.檢驗(yàn)科，杭州 310013)

甲狀腺球蛋白(thyroglobulin, Tg)是一種隱蔽性自身抗原，在正常人血清中的含量較低(1～50μg/L)[1]，一般情況下不會(huì)刺激機(jī)體產(chǎn)生抗甲狀腺球蛋白抗體(Tg-Ab)。因Tg 的半衰期為4～6 天，所以短時(shí)間內(nèi)Tg 升高不會(huì)刺激機(jī)體，而長時(shí)間則會(huì)刺激機(jī)體產(chǎn)生Tg-Ab，此時(shí)異常升高的Tg 與刺激機(jī)體產(chǎn)生的Tg-Ab 相結(jié)合形成甲狀腺球蛋白免疫復(fù)合物(Tg-CIC)[2]。

自從1974年KONISHI[3]首次報(bào)道在橋本甲狀腺炎患者血清中發(fā)現(xiàn)甲狀腺球蛋白免疫復(fù)合物(Tg-CIC)后，Tg-CIC 在甲狀腺疾病中的病理機(jī)制和血清Tg-CIC 檢測，一直是臨床內(nèi)分泌學(xué)、流行病學(xué)專家關(guān)注的焦點(diǎn)[4-5], Tg-CIC 的檢測主要有放射免疫分析法(RIA)[6]、酶免法(EIA)[7-8]兩大類。RIA 優(yōu)點(diǎn)甚多如：重復(fù)性好、測量的方法簡單、靈敏度高并且成本低等。不足的地方是比較難以實(shí)現(xiàn)測量和操作的自動(dòng)化。EIA 是目前實(shí)驗(yàn)室和臨床常規(guī)工作中最常用的方法，雙特異性抗體ELISA 法靈敏度低，特異性、重復(fù)性差等，在檢測自身免疫性甲狀腺疾病患者時(shí)實(shí)際陽性檢出率并不高，C1q 法是非特異方法，陽性結(jié)果無法判斷是否是Tg-CIC 形成的。迄今為止還沒有一種針對甲狀腺疾病患者血清Tg-Ab 陽性時(shí)，可以靈敏、特異地定量檢測血清中的Tg-CIC。

但由于甲狀腺患者多伴有血清Tg-Ab 陽性及Tg-CIC 檢測方法學(xué)的局限性[9]，Tg-CIC 在甲狀腺疾病患者中的陽性分布、血清Tg-CIC 含量與疾病進(jìn)展的相關(guān)性研究報(bào)道甚少[10]，使Tg-CIC 在甲狀腺患者的病理機(jī)制、臨床意義及流行病學(xué)特征等方面，一直未得到深入、系統(tǒng)的研究。因此，我們采用自主研制的免疫復(fù)合物解離技術(shù)對甲狀腺患者血清Tg-CIC 進(jìn)行分離、解離，通過檢測Tg-CIC 解離后的Tg-Ab 含量來確定甲狀腺患者血清中Tg-CIC水平，并結(jié)合甲狀腺疾病患者相關(guān)的臨床資料進(jìn)行比較分析，從而闡明Tg-CIC 在甲狀腺疾病中的臨床以及流行病學(xué)意義。

1 材料與方法

1.1 研究對象 收集自 2017年11月～2018年1月，來我院門診就診甲狀腺疾病患者血清標(biāo)本187例，其中甲狀腺功能亢進(jìn)46 例，甲狀腺功能減退35 例，甲狀腺腫瘤40 例，甲狀腺結(jié)節(jié)33 例，甲狀腺炎33 例；男性74 例，女性113 例，年齡49±11.7 歲；患者的血清標(biāo)本根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要進(jìn)行離心分離后分裝，-70℃凍存?zhèn)溆?，并且避免反?fù)凍融。

1.2 儀器與試劑 四硼酸鈉(Na2B4O7·10H2O)分析純( 重慶市科龍化工有限公司)，三( 羥甲基)氨基甲烷生化試劑(生工生物)，聚乙二醇6000(PEG600)(上海合成洗滌劑二廠)，氯化鈉(NaCl)分析純(成都市科龍化工試劑廠)，濃鹽酸(HCl)(蘭溪市六洞山試劑廠)，硼酸(H3BO3)分析純(重慶市科龍化工試劑廠)，甘氨酸(C2H5NO2)分析純(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司)、抗甲狀腺球蛋白抗體測定試劑盒(雅培貿(mào)易有限公司)。I 2 000 免疫分析儀(美國雅培)，SHA-EA 低溫水浴恒溫振蕩器(金壇市精達(dá)儀器制造有限公司)恒溫范圍：5～100℃ ，振蕩頻率：0～300r/min。試劑配制：依據(jù)自主專利配制免疫復(fù)合物解離技術(shù)對所用的相關(guān)試劑進(jìn)行配制[11-13]。

1.3 方法

1.3.1 分離：向2 支1.5ml Ependoff 管分別加入150μl 血清標(biāo)本和150μl 免疫復(fù)合物(Circulating immune complex, CIC)分離劑，混勻后置4℃至少6h 或過夜，12 000×g 離心5min 棄上清；向含沉淀物管中加入150μl 復(fù)溶劑和150μl CIC 分離劑，混勻后置4℃至少6h 或過夜，1 2000×g 離心5min棄上清，并瀝干。

1.3.2 復(fù)溶：向含有瀝干的CIC 沉淀物Ependoff管中分別加入10μl CIC 復(fù)溶劑，振蕩至溶液中無塊狀沉淀物。

1.3.3 空白樣品檢測：將一支Ependoff 管標(biāo)記為空白管，加入70μl 緩沖液解離劑和70μl 緩沖液解離中和劑，混勻后檢測Tg-Ab 含量作為空白值。

1.3.4 CIC 解離：將另一支Ependoff 管標(biāo)記為測定管，加入70μl 緩沖液解離劑，于15℃放置30min，加入70μl 緩沖液解離中和劑，混勻后檢測Tg-Ab 含量作為測定值；

1.3.5 結(jié)果判斷：空白值＞Cutoff，測定值＞Cutoff，且測定值＜110%空白值，即血清標(biāo)本中不存在CIC；反之則存在CIC，含量=測定值-空白值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 數(shù)據(jù)的處理采用SPSS22.0軟件，計(jì)數(shù)資料用率(%)表示，采用χ2檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。計(jì)量資料為正態(tài)分布采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，為非正態(tài)分布時(shí)采用M (Q1 ～ Q3)表示，非正態(tài)分布多組定量樣本數(shù)據(jù)間比較采用Kruskal-Wallis H 檢驗(yàn)，兩組數(shù)據(jù)相關(guān)性評價(jià)采用線性回歸分析，P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 甲狀腺疾病患者血清中Tg-CIC 陽性率調(diào)查187 例患者血清標(biāo)本中有174 例檢出Tg-CIC，Tg-CIC 總陽性率高達(dá)93.05%。陽性患者中甲狀腺功能亢進(jìn)患者44 例(95.65%,44/46)，甲狀腺功能減退患者31 例(88.57%,31/35)，甲狀腺腫瘤患者38 例(95.0%,38/40)，甲狀腺結(jié)節(jié)患者32 例(96.97%,32/33)，甲狀腺炎患者29 例(87.88%,29/33)，其中甲狀腺結(jié)節(jié)陽性率最高，高達(dá)96.97%，甲狀腺炎患者陽性率最低，為87.88%，各組間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=3.950, P ＞0.05)。

2.2 各甲狀腺疾病患者血清游離及其CIC 中Tg-Ab 含量情況 見表1，圖1。在各種甲狀腺疾病患者血清中游離Tg-Ab 含量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(H=3.882，P＞0.05)。另檢測各種甲狀腺疾病患者血清CIC中Tg-Ab 含量，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(H=5.58，P＞0.05)。

2.3 各組甲狀腺疾病患者血清中游離Tg-Ab 含量與CIC 中Tg-Ab 含量的相關(guān)性分析 見圖2。對各組甲狀腺疾病患者血清游離Tg-Ab 與Tg-CIC 中Tg-Ab 含量進(jìn)行相關(guān)性分析，甲狀腺功能亢進(jìn)、甲狀腺炎以及甲狀腺結(jié)節(jié)患者血清中游離Tg-Ab 含量與CIC 中Tg-Ab 含量的相關(guān)性r2值分別為0.22,0.29, 0.157，為正相關(guān)(P＜0.05)。甲狀腺功能減退、甲狀腺腫瘤血清中游離Tg-Ab 含量與CIC 中Tg-Ab 含量的相關(guān)性r2值分別為0.009 和0.004，均P＞0.05，無相關(guān)性。

圖1 各組甲狀腺患者CIC 中Tg-Ab 含量測定結(jié)果

圖2 各組甲狀腺疾病患者血清游離Tg-Ab 與CIC 中Tg-Ab 含量相關(guān)性分析圖

3 討論

人體最重要的內(nèi)分泌腺之一就是甲狀腺，甲狀腺主要有分泌功能，可以分泌甲狀腺球蛋白(Tg)，Tg 在正常范圍內(nèi)(1～50μg/L)不會(huì)刺激機(jī)體產(chǎn)生抗甲狀腺球蛋白抗體(Tg-Ab)，但當(dāng)甲狀腺分泌Tg超過50μg/L 或當(dāng)Tg 釋放過多時(shí)，便會(huì)刺激機(jī)體產(chǎn)生Tg-Ab。此時(shí)Tg 與Tg-Ab 則發(fā)生抗原抗體反應(yīng)，在體內(nèi)形成Tg-CIC。有文獻(xiàn)報(bào)道Tg-CIC 測定在臨床上對評估甲狀腺疾病的發(fā)生、發(fā)展具有重要的意義[14]，因此本文對各種甲狀腺疾病患者血清游離Tg-Ab 和Tg-CIC 中Tg-Ab 進(jìn)行檢測，經(jīng)過統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)，Tg-CIC 在各組甲狀腺疾病中均可出現(xiàn)，并且陽性率較高。另外結(jié)果顯示疾病組間的陽性率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=2.917, P＞0.05)，說明在不同的甲狀腺疾病中都存著Tg-CIC，而且和甲狀腺疾病的種類無關(guān)。

對不同甲狀腺疾病患者血清游離Tg-Ab 和Tg-CIC 中的Tg-Ab 含量進(jìn)行檢測并比較，結(jié)果顯示：不同甲狀腺疾病患者間血清中游離Tg-Ab 含量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(H=3.882, P＞0.05)，不同甲狀腺疾病患者間血清CIC 中Tg-Ab 含量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(H=5.5842, P＞0.05)。說明在不同的甲狀腺疾病間，其血清中的游離Tg-Ab 含量以及CIC 中Tg-Ab 含量與疾病的類型無關(guān)，且分布呈現(xiàn)偏態(tài)，因此，在發(fā)生甲狀腺疾病時(shí)雖然產(chǎn)生了相應(yīng)的抗體，但這些抗體及其免疫復(fù)合物的含量與疾病的種類無關(guān)，我們推測其產(chǎn)生的量不僅和血清Tg 含量有關(guān)，還和個(gè)體免疫應(yīng)答能力密切相關(guān)。

對不同甲狀腺疾病患者血清中游離Tg-Ab 與其CIC 中的Tg-Ab 含量進(jìn)行相關(guān)性評價(jià)發(fā)現(xiàn)：甲狀腺功能亢進(jìn)、甲狀腺炎以及甲狀腺結(jié)節(jié)患者血清游離Tg-Ab 與其CIC 中的Tg-Ab 含量呈現(xiàn)正相關(guān)，從側(cè)面說明了Tg-CIC 含量的高低和機(jī)體產(chǎn)生Tg-Ab 的含量存在關(guān)聯(lián)性，間接的說明了Tg-CIC的產(chǎn)生和機(jī)體免疫應(yīng)答能力的關(guān)聯(lián)性。而甲狀腺功能減退、甲狀腺腫瘤患者血清游離Tg-Ab 與其CIC中的Tg-Ab 含量無相關(guān)性，其中腫瘤患者可能其甲狀腺已經(jīng)被腫瘤細(xì)胞完全破壞[16]，血清中的Tg 釋放不連續(xù)，導(dǎo)致產(chǎn)生Tg-Ab 量不穩(wěn)定，從而出現(xiàn)了Tg-Ab 與其CIC 中的Tg-Ab 含量呈現(xiàn)無相關(guān)的現(xiàn)象。

綜上所述，甲狀腺疾病患者血清中大多數(shù)可檢出Tg-CIC 與疾病的類型無關(guān)，不同的甲狀腺疾病間，其血清中的游離Tg-Ab 含量以及CIC 中Tg-Ab含量與疾病的類型無關(guān)。甲狀腺功能亢進(jìn)、甲狀腺炎以及甲狀腺結(jié)節(jié)患者血清游離Tg-Ab 與其CIC 中的Tg-Ab 含量呈現(xiàn)正相關(guān)，而甲狀腺功能減退、甲狀腺腫瘤患者血清游離Tg-Ab 與其CIC 中的Tg-Ab含量無相關(guān)性，為我們進(jìn)一步了解Tg-CIC 與甲狀腺疾病的發(fā)生、發(fā)展的相關(guān)性研究奠定了基礎(chǔ)，提供了新的研究視角。