（陜西省人民醫(yī)院 肝膽外科，陜西 西安 710068）

線粒體是細(xì)胞內(nèi)調(diào)控代謝、凋亡與氧化還原穩(wěn)態(tài)等多種重要生物學(xué)過程的細(xì)胞器[1]。線粒體并不是以孤立靜止的形式存在于細(xì)胞漿中，而是處在動態(tài)的分裂與融合平衡中，以此對自身的形態(tài)與功能進(jìn)行調(diào)控[2]。目前已在包括肝癌在內(nèi)的多種惡性腫瘤中證實了線粒體分裂與融合的異常及其在促進(jìn)腫瘤惡性增殖與轉(zhuǎn)移中的作用[3-4]。

MARCH5[membrane-associated ring finger（C3HC4）5]是線粒體外膜定位的E3泛素連接酶，可通過調(diào)控線粒體分裂與融合關(guān)鍵蛋白的泛素化降解而調(diào)控線粒體的分裂與融合[5]。但目前MARCH5在肝癌中的表達(dá)與生物學(xué)作用均尚不清楚。本項目首次用生物信息學(xué)方法分析了MARCH5在肝癌中的表達(dá)與臨床意義，并進(jìn)一步用體外細(xì)胞遷移與侵襲實驗分析了MARCH5在肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移中的調(diào)控作用。

1 材料和方法

1.1 生物信息分析

利用整合的在線分析網(wǎng)站UALCAN[6]對MARCH5在肝癌中的表達(dá)及其與患者預(yù)后的相關(guān)性進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)信息來源于TCGA（The Cancer Genome Atlas，癌癥基因組圖譜）數(shù)據(jù)庫。

1.2 細(xì)胞實驗分析

1.2.1 人肝癌細(xì)胞系：人肝癌細(xì)胞HLE購自日本JCRRB（Japanese Cancer Research Resources Bank）細(xì)胞庫，細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)于含10%胎牛血清（HyClone公司）的DMEM培養(yǎng)液中，細(xì)胞培養(yǎng)箱設(shè)定溫度為37 ℃，CO2濃度為5%。

1.2.2 轉(zhuǎn)染：siRNA下調(diào)或表達(dá)載體上調(diào)HLE細(xì)胞中MARCH5表達(dá)：首先，由上海吉瑪生物公司合成兩條靶向MARCH5的siRNA干擾片段，序列為：siRNA#1：5’-GCACUUGGGAGUAAUUUGA-3’；siRNA#2：5’-GCACACGUGUCCGAUUUAU-3’，隨后將siRNA轉(zhuǎn)染HLE細(xì)胞，大致流程為：將3×105個HLE細(xì)胞接種至6孔板內(nèi)培養(yǎng)12 h，隨后以Lip2000脂質(zhì)體為介質(zhì)進(jìn)行siRNA轉(zhuǎn)染，方法嚴(yán)格按Lip2000說明書，先用無血清培養(yǎng)液分別稀釋siRNA干擾片段與脂質(zhì)體Lip2000。隨后將二者混合后加入細(xì)胞中，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h后更換含10%胎牛血清的新鮮培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24 h。MARCH5表達(dá)載體由唐都醫(yī)院普通外科實驗室贈送，載體轉(zhuǎn)染同樣使用脂質(zhì)體Lip2000為介質(zhì)，轉(zhuǎn)染方法與siRNA轉(zhuǎn)染方法相同。

1.2.3 qRT-PCR檢測MARCH5 mRNA表達(dá)水平：RNA提取采用商品化RNA提取試劑盒（OMEGA公司，貨號R6688），操作嚴(yán)格按說明書進(jìn)行，提取獲得總RNA后進(jìn)一步用反轉(zhuǎn)錄試劑盒（TAKARA公司，貨號RR037A）反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，隨后進(jìn)行MARCH5與上皮間質(zhì)標(biāo)志分子E-cadherin、ZO-1、N-cadherin與Vimentin的表達(dá)檢測。上述分子PCR擴增引物序列為：MARCH5（F-5’-GTCCAGTGGTTTACGTCTT GG-3’；R-5’-CCGACCATTATTCCTGCTGC-3’），E-cadherin（F-5’-ATTTTTCCCTCGACACCCGAT-3’；R-5’-TCCCAGGCGTAGACCAAGA-3’），ZO-1（F-5’-CGACCAGATCCTCAGGGTAA-3’；R-5’-TCCATAG GGAGATTCCTTCTCA-3’），N-cadherin（F-5’-AGCT CCATTCCGACTTAGACA-3’；R-5’-CAGCCTGAGC ACGAAGAGTG-3’），Vimentin（F-5’-GACGCCATCA ACACCGAGTT-3’；R-5’-CTTTGTCGTTGGTTAGCT GGT-3’），內(nèi)參β-actin（F-5’-TCGCCTTTGCCGATCC G-3；R-5’-ATGATCTGGGTCATCTTCTCG-3’）。最終，上述分子在各組細(xì)胞中的相對表達(dá)量計算采用2-△△Ct法。

1.2.4 Western blotting檢測MARCH5蛋白表達(dá)水平：對HLE細(xì)胞中MARCH5表達(dá)進(jìn)行siRNA干涉或過表達(dá)處理后用含蛋白酶抑制劑的裂解液裂解細(xì)胞并離心收集蛋白上清，加入SDS上樣緩沖液煮沸5 min，然后將各組細(xì)胞蛋白加入聚丙烯酰胺凝膠中進(jìn)行電泳分離，將凝膠中電泳分離的蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上，5%脫脂牛奶中封閉1 h后加入1:1 000稀釋過的MARCH5抗體（Novus公司，貨號NBP2-21583）并于室溫孵育3 h，PBS洗膜3次后加入二抗繼續(xù)于室溫孵育2 h，PBS洗膜3次后即可在化學(xué)發(fā)光儀中對最終結(jié)果進(jìn)行觀察。

1.2.5 劃痕實驗檢測細(xì)胞遷移能力：對HLE細(xì)胞中MARCH5表達(dá)進(jìn)行siRNA干涉或過表達(dá)處理，之后消化并離心收集細(xì)胞，將3×105個細(xì)胞接種至6孔板內(nèi)，培養(yǎng)12 h后沿著直尺用槍頭劃線，顯微鏡下對細(xì)胞劃痕進(jìn)行拍照，隨后將細(xì)胞置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后再次對細(xì)胞劃痕進(jìn)行拍照。最后，用Image J圖像處理軟件對各組細(xì)胞的相對遷移距離進(jìn)行分析。

1.2.6 Transwell侵襲實驗檢測細(xì)胞侵襲能力：同樣，首先對HLE細(xì)胞中MARCH5表達(dá)進(jìn)行siRNA干涉或過表達(dá)處理，之后消化并離心收集細(xì)胞，將1×105個細(xì)胞接種至含基質(zhì)膠的Transwell小室內(nèi)，小室上層培養(yǎng)液不含血清，下層培養(yǎng)液含血清。將小室中細(xì)胞置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，取出后用結(jié)晶紫染色5 min并用PBS清洗3次，最后置于顯微鏡下對各組發(fā)生侵襲的細(xì)胞進(jìn)行計數(shù)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 肝癌組織中MARCH5表達(dá)顯著上調(diào)

對TCGA數(shù)據(jù)庫中肝癌與正常肝組織中MARCH5表達(dá)進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：MARCH5在肝癌組織中表達(dá)顯著高于正常肝組織（P＜0.001） （圖1A）。此外，MARCH5在發(fā)生淋巴轉(zhuǎn)移的腫瘤組織中表達(dá)顯著高于未發(fā)生淋巴轉(zhuǎn)移的肝癌組織（圖1B）。

圖1 生物信息學(xué)分析MARCH5在肝癌中的表達(dá)及其與患者預(yù)后的相關(guān)性分析

圖2 Western blotting檢測HLE細(xì)胞中MARCH5在蛋白表達(dá)水平的干涉（A）與過表達(dá)（B）效率

進(jìn)一步在TCGA數(shù)據(jù)庫中對MARCH5表達(dá)與肝癌患者預(yù)后相關(guān)性進(jìn)行分析后發(fā)現(xiàn)（圖1C）：MARCH5高表達(dá)肝癌患者較MARCH5低表達(dá)肝癌患者具有顯著更差的預(yù)后。

2.2 MARCH5可顯著促進(jìn)肝癌細(xì)胞的遷移能力

轉(zhuǎn)染兩條siRNA 24 h后，HLE細(xì)胞中MARCH5表達(dá)均顯著下調(diào) [siCtrl vs si-MARCH5#1 vs si-MARCH5#2：（1.37±0.03） vs （0.34±0.02） vs （0.35±0.01），F(xiàn)=698.3，P＜0.0001]（圖2A），而轉(zhuǎn)染MARCH5表達(dá)載體后，肝癌HLE細(xì)胞中MARCH5表達(dá)顯著升高[EV vs MARCH5：（0.30±0.02） vs （1.19±0.04），t=21.82，P＜0.0001]（圖2B），表明本試驗所采用的干涉與過表達(dá)細(xì)胞模型可用于后續(xù)MARCH5功能的研究。

首先，分別干涉或過表達(dá)MARCH5后，利用劃痕實驗分析對肝癌細(xì)胞遷移能力的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：與對照組相比，干涉MARCH5表達(dá)后HLE細(xì)胞的相對遷移距離顯著變短[siCtrl vs si-MARCH5#1 vs si-MARCH5#2：（1.00±0.05） vs （0.41±0.02） vs （0.39±0.03），F(xiàn)=104.2，P＜0.0001]（圖3A），而過表達(dá)MARCH5后HLE細(xì)胞的遷移距離顯著變長[EV vs MARCH5：（1.00±0.03） vs （1.51±0.05），t=8.895，P＜0.001]（圖3B），表明MARCH5促進(jìn)了肝癌細(xì)胞的遷移能力。

圖3 劃痕實驗分析干涉（A）與過表達(dá)（B）MARCH5對HLE細(xì)胞遷移能力的影響（×100）

2.3 MARCH5可顯著促進(jìn)肝癌細(xì)胞的侵襲能力

進(jìn)一步，分別干涉或過表達(dá)MARCH5后，利用Transwell侵襲實驗分析對肝癌細(xì)胞侵襲能力的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：干涉MARCH5表達(dá)后，侵襲至基質(zhì)膠底部HLE細(xì)胞的數(shù)顯著減少 [siCtrl vs si-MARCH5#1 vs si-MARCH5#2：（48.67±3.76） vs （15.33±1.45） vs（17.67±1.45），F(xiàn)=56.66，P=0.0001]（圖4A），而過表達(dá)MARCH5后，侵襲至基質(zhì)膠底部的HLE細(xì)胞數(shù)顯著增多 [EV vs MARCH5：（23.00±1.16） vs （39.67±2.33），t=6.402，P=0.0031]（圖4B），表明MARCH5促進(jìn)了肝癌細(xì)胞的侵襲能力。

2.4 MARCH5可誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化

上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化是腫瘤細(xì)胞獲得轉(zhuǎn)移潛能的重要因素之一，為初步探討MARCH5促進(jìn)肝癌細(xì)胞遷移與侵襲的分子機制，我們利用qRT-PCR實驗分析了干涉或過表達(dá)MARCH5對上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化標(biāo)志分子（上皮E-cadherin與ZO-1；間質(zhì)N-cadherin與Vimentin）表達(dá)的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：干涉MARCH5表達(dá)后，HLE細(xì)胞中上皮細(xì)胞標(biāo)志分子E-cadherin [siCtrl vs si-MARCH5#1 vs si-MARCH5#2：（1.00±0.05） vs（2.02±0.05） vs （2.07±0.07），F(xiàn)=110.3，P＜0.0001]與ZO-1 [siCtrl vs si-MARCH5#1 vs si-MARCH5#2：（1.00±0.02） vs （1.64±0.03） vs （1.64±0.05），F(xiàn)=114.3，P＜0.0001]表達(dá)顯著上調(diào)，而間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志分子N-cadherin [siCtrl vs si-MARCH5#1 vs si-MARCH5#2：（1.00±0.04） vs （0.39±0.02） vs （0.40±0.03），F(xiàn)=110.2，P＜0.0001]與Vimentin [siCtrl vs si-MARCH5#1 vs si-MARCH5#2：（1.00±0.03） vs （0.56±0.02） vs （0.57±0.04），F(xiàn)=60.65，P＜0.0001]表達(dá)顯著下調(diào)（圖5A）。相反，過表達(dá)MARCH5后HLE細(xì)胞中上皮細(xì)胞標(biāo)志分子E-cadherin [EV vs MARCH5：（1.00±0.05） vs（0.38±0.01），t=11.45，P=0.0003]與ZO-1[EV vs MARCH5：（1.00±0.05） vs （0.51±0.04），t=8.091，P=0.0013]表達(dá)顯著降低，而間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志分子N-cadherin [EV vs MARCH5：（1.00±0.05） vs （1.49±0.06），t=6.556，P=0.0028]與Vimentin [EV vs MARCH5：（1.00±0.05） vs （1.89±0.05），t=11.70，P=0.0003]表達(dá)顯著升高，表明MARCH5誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞發(fā)生了上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化。

圖4 Transwell侵襲實驗分析干涉（A）與過表達(dá)（B）MARCH5對HLE細(xì)胞侵襲能力的影響（×400）

圖5 qRT-PCR分析干涉（A）與過表達(dá)（B）MARCH5對HLE細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化標(biāo)志分子mRNA表達(dá)的影響

3 討論

線粒體是細(xì)胞內(nèi)參與物質(zhì)與能量代謝、細(xì)胞凋亡、鈣離子與氧化還原穩(wěn)態(tài)調(diào)控的重要細(xì)胞器，其主要通過動態(tài)的分裂與融合調(diào)控自身形態(tài)與功能[7]。線粒體動力相關(guān)蛋白DRP1與線粒體融合蛋白MFN1是調(diào)控線粒體分裂融合的關(guān)鍵蛋白[2]，以往已在多種惡性腫瘤中證實了DRP1與MFN1表達(dá)的異常[3-4]，其中包括肝癌[8]、乳腺癌[9]、大腸癌[10]、肺癌[11]、胰腺癌[12-13]及皮膚鱗癌[14]等，表明線粒體分裂融合關(guān)鍵蛋白及其介導(dǎo)的線粒體分裂融合異常與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)。

MARCH5是定位于線粒體外膜的E3泛素連接酶，其可通過泛素化調(diào)節(jié)DRP1與MFN1等線粒體分裂融合蛋白表達(dá)而參與細(xì)胞的線粒體分裂與融合調(diào)控[5，15]。乳腺癌組織中MARCH5表達(dá)顯著高于癌旁組織，MARCH5表達(dá)上調(diào)促進(jìn)了乳腺癌細(xì)胞的增殖與轉(zhuǎn)移[16]；MARCH5促進(jìn)了卵巢癌細(xì)胞的自噬與轉(zhuǎn)移[17]；miR-373表達(dá)下調(diào)可通過上調(diào)MARCH5表達(dá)而促進(jìn)鼻咽癌細(xì)胞的侵襲與轉(zhuǎn)移[18]；MARCH5具有促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞增殖與侵襲遷移的作用[19]。上述研究共同提示，MARCH5在促進(jìn)腫瘤惡性進(jìn)展中發(fā)揮了重要作用。但目前，MARCH5在肝癌中的表達(dá)與生物學(xué)作用均尚不十分清楚，有待系統(tǒng)研究。

本研究利用生物信息分析方法，首次在肝癌TCGA數(shù)據(jù)中分析了MARCH5的表達(dá)及其與患者預(yù)后的關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)肝癌中MARCH5表達(dá)顯著上調(diào)并與患者較差預(yù)后密切相關(guān)，提示MARCH5是肝癌中重要的癌基因并有望成為肝癌潛在的預(yù)后分子標(biāo)志物。此外還發(fā)現(xiàn)，MARCH5在發(fā)生淋巴轉(zhuǎn)移的腫瘤組織中表達(dá)顯著高于未發(fā)生淋巴轉(zhuǎn)移的腫瘤組織，表明MARCH5可能促進(jìn)了肝癌的轉(zhuǎn)移，與推測結(jié)果一致。隨后的細(xì)胞實驗發(fā)現(xiàn)，下調(diào)MARCH5表達(dá)可顯著抑制肝癌細(xì)胞的遷移與侵襲能力，而過表達(dá)MARCH5則可顯著促進(jìn)肝癌細(xì)胞的遷移與侵襲能力，進(jìn)一步證實了MARCH5在促進(jìn)肝癌轉(zhuǎn)移中的作用。對MARCH5促進(jìn)肝癌細(xì)胞遷移與侵襲分子機制的初步研究發(fā)現(xiàn)，下調(diào)MARCH5表達(dá)后肝癌細(xì)胞的上皮細(xì)胞標(biāo)志分子E-cadherin與ZO-1表達(dá)顯著上調(diào)，而間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志分子N-cadherin與Vimentin表達(dá)顯著下調(diào)。相反，過表達(dá)MARCH5后HLE細(xì)胞中上皮細(xì)胞標(biāo)志分子E-cadherin與ZO-1表達(dá)顯著降低，而間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志分子N-cadherin與Vimentin表達(dá)顯著升高，提示MARCH5可能通過誘導(dǎo)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化而促進(jìn)肝癌細(xì)胞的遷移與侵襲。以往在乳腺癌中研究也證實MARCH5通過誘導(dǎo)EMT促進(jìn)腫瘤的轉(zhuǎn)移[16]，表明上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化是MARCH5促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移的重要機制。與MARCH5功能類似，MARCH8也被證實具有促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞遷移、侵襲與增殖的作用[20]。卵巢癌中的研究發(fā)現(xiàn)，MARCH8在卵巢癌中表達(dá)明顯上調(diào)，下調(diào)MARCH8后卵巢癌細(xì)胞的增殖能力均被顯著抑制[21]。以上研究表明E3泛素連接酶MARCH家族成員表達(dá)異常在腫瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮了重要的促進(jìn)作用。

本研究存在三個尚未回答的科學(xué)問題：（1）是什么因素導(dǎo)致了肝癌組織中MARCH5的表達(dá)上調(diào)；（2）MARCH5是通過何種機制促進(jìn)了肝癌細(xì)胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化；（3）MARCH5是否是通過調(diào)控DRP1泛素化及線粒體分裂而參與對肝癌細(xì)胞侵襲遷移的調(diào)控。以上三個科學(xué)問題均有待未來研究中進(jìn)一步闡明。