景德龍，姜秋燕，肖園園，許瑩，田虎 濟(jì)南市濟(jì)鋼醫(yī)院，濟(jì)南500；臨沂金鑼醫(yī)院；山東第一醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院(山東省千佛山醫(yī)院)

自21世紀(jì)以來(lái)，隨著全民生活水平的不斷提高，高油脂、高鹽飲食日益成為人民生活的常態(tài)，由此引發(fā)的心血管疾病發(fā)病率也不斷升高[1]。動(dòng)脈粥樣硬化是一個(gè)由多種免疫細(xì)胞、炎癥細(xì)胞共同參與的不可逆轉(zhuǎn)的病理生理學(xué)過(guò)程，最終導(dǎo)致目標(biāo)血管狹窄閉塞，引起相應(yīng)組織、器官缺血壞死[2]。特洛細(xì)胞是20世紀(jì)初期發(fā)現(xiàn)的間質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源的新型細(xì)胞，具有形成三維網(wǎng)狀支架結(jié)構(gòu)的功能，在多種組織器官中發(fā)揮支撐作用；還具有為組織內(nèi)實(shí)質(zhì)細(xì)胞傳遞細(xì)胞間信號(hào)物質(zhì)的作用，參與調(diào)節(jié)實(shí)質(zhì)細(xì)胞的增殖、修復(fù)和凋亡過(guò)程[3,4]。已有研究在小鼠主動(dòng)脈和頸動(dòng)脈中發(fā)現(xiàn)特洛細(xì)胞的存在，并證實(shí)在多個(gè)特洛細(xì)胞之間可以形成三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，在維持血管壁正常結(jié)構(gòu)方面發(fā)揮關(guān)鍵作用[5]。在臨床外科實(shí)際工作中，我們發(fā)現(xiàn)動(dòng)脈粥樣硬化的患者術(shù)后血管壁恢復(fù)時(shí)間更長(zhǎng)。而特洛細(xì)胞作為動(dòng)脈血管壁內(nèi)維持三維結(jié)構(gòu)的重要細(xì)胞群，在動(dòng)脈粥樣硬化過(guò)程中是否出現(xiàn)形態(tài)結(jié)構(gòu)的改變，是否參與粥樣硬化的病理過(guò)程均尚未可知。為了深入了解特洛細(xì)胞在動(dòng)脈粥樣硬化血管銳性損傷修復(fù)過(guò)程中的變化，我們于2019年1月～2020年3月進(jìn)行了如下研究。

1 材料與方法

1.1 材料 動(dòng)物：雄性Apo E基因敲除(Apo E-/-)小鼠30只，6周齡，無(wú)特殊病原體級(jí)，體質(zhì)量(39±6)g；正常SPF級(jí)小鼠30只，6周齡，體質(zhì)量(40±9)g；實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均購(gòu)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，每5只小鼠放于一個(gè)飼養(yǎng)箱內(nèi)飼養(yǎng)，室溫23 ℃、相對(duì)濕度55%，保證小鼠飲食飲水自由。主要試劑：二甲苯購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；檸檬酸抗原修復(fù)液(pH 6.0，G1202)、BSA試劑(G5001)、CD117(1∶500稀釋，GB11073)、血小板衍生生長(zhǎng)因子受體(PDGFR，1∶200稀釋，GB11261)、山羊抗兔二抗(1∶200稀釋，G23303)均購(gòu)于武漢賽維爾生物科技有限公司，CD34抗體(1∶3 000稀釋，AB81289)購(gòu)于美國(guó)Abcam公司。主要儀器：病理切片機(jī)(RM2016)購(gòu)于上海徠卡儀器有限公司，動(dòng)物便攜式超聲顯像(CCS2022)購(gòu)于北京Palmary電子儀器有限公司，熒光顯微鏡(XSP-C204)購(gòu)于中國(guó)CIC公司。

1.2 動(dòng)物分組及動(dòng)脈粥樣硬化建模 選擇Apo E-/-小鼠30只作為觀察組，采用高脂飲食的方法建立動(dòng)脈粥樣硬化小鼠模型[6]。高脂飲食10周后，應(yīng)用動(dòng)物便攜式超聲顯像儀對(duì)小鼠頸動(dòng)脈形成的粥樣斑塊進(jìn)行測(cè)量，并確定動(dòng)脈血管的狹窄程度，以小鼠頸動(dòng)脈血管壁內(nèi)粥樣硬化斑塊占據(jù)血管管徑至少35%作為建模成功的標(biāo)準(zhǔn)。選擇正常SPF級(jí)小鼠30只作為對(duì)照組，正常飲食喂養(yǎng)10周。

1.3 頸動(dòng)脈損傷及修復(fù)處理 兩組均保留3只小鼠作為術(shù)前對(duì)照，其余小鼠給予吸入性異氟烷進(jìn)行全身麻醉前的誘導(dǎo)麻醉，待小鼠安靜后，應(yīng)用1%硫噴托納注射液0.1 mL(0.9%生理鹽水稀釋，維持麻醉時(shí)間約20 min)進(jìn)行腹腔內(nèi)注射麻醉。麻醉成功后將小鼠置于無(wú)菌解剖臺(tái)上，固定四肢及頭部，常規(guī)消毒小鼠頸部，鋪無(wú)菌巾?？v行切開小鼠頸部皮膚及皮下胸腺，裸露頸動(dòng)脈血管，使用無(wú)損傷血管夾夾住動(dòng)脈血管的兩端，銳性切開部分頸動(dòng)脈血管壁。在40倍電子顯微鏡下用10-0絲線將損傷血管縫合，確?？p合血管的血流通暢性，然后逐層縫合切口。術(shù)后切口處應(yīng)用碘伏消毒，并涂抹托芬那酸膏和紅霉素軟膏。將小鼠放于溫毯(約42 ℃)上進(jìn)行麻醉復(fù)蘇，術(shù)后均正常飲食，其他飼養(yǎng)條件不變。

1.4 頸動(dòng)脈獲取與處理 觀察組和對(duì)照組術(shù)后存活數(shù)分別為24、26只，不明原因死亡分別為3、1只。術(shù)后8 h、48 h、21 d，觀察組分別取7、8、9只，對(duì)照組分別取8、9、9只，參照1.3的方法進(jìn)行麻醉。在小鼠氣管旁鈍性分離粘連組織，找到有縫合線結(jié)的頸動(dòng)脈，在距離線結(jié)0.1 cm處上、下各放置血管夾，剪取血管夾之間的頸動(dòng)脈血管，隨即將標(biāo)本放入通用標(biāo)本固定液中保存。兩組術(shù)前對(duì)照小鼠參照1.3的方法麻醉后取頸動(dòng)脈標(biāo)本。將小鼠頸部術(shù)口簡(jiǎn)單縫合，在麻醉狀態(tài)下放入裝有CO2的密閉瓶中處死。標(biāo)本在固定液中保存6 h后取出，采用梯度乙醇脫水的方法對(duì)標(biāo)本進(jìn)行脫水處理，二甲苯和氯仿除去標(biāo)本中的脫水劑。選取軟石蠟對(duì)標(biāo)本進(jìn)行浸蠟和包埋，病理切片機(jī)將石臘塊切成10 μm厚度的單張切片。

1.5 特洛細(xì)胞形態(tài)及數(shù)量觀察 采用雙標(biāo)記免疫熒光染色法[7]。將兩組頸動(dòng)脈石蠟切片進(jìn)行洗滌，置于盛滿EDTA抗原修復(fù)緩沖液(pH 9.0)的修復(fù)盒中，于微波爐內(nèi)進(jìn)行抗原修復(fù)。使用組化筆在組織周圍畫圈(防止抗體流走)，在圈內(nèi)滴加自發(fā)熒光淬滅劑A液；常溫孵育、滴加自發(fā)熒光淬滅劑B液，甩干后在圈內(nèi)滴加10%正常兔血清均勻覆蓋組織。室溫封閉30 min，加入CD34、CD117、PDGFR一抗進(jìn)行染色，最后經(jīng)DAPI復(fù)染細(xì)胞核(表現(xiàn)為藍(lán)色)。封片后熒光顯色顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)并進(jìn)行拍照。CD34、CD117、PDGFR染色情況：對(duì)照組術(shù)后8 h標(biāo)本CD34、CD117、PDGFR抗體熒光顯色分別為紅色、綠色、綠色，術(shù)后48 h、21 d均分別為綠色、紅色、綠色；觀察組術(shù)后8 h分別為綠色、紅色、綠色，術(shù)后48 h分別為紅色、紅色、綠色，術(shù)后21 d分別為紅色、綠色、綠色。同時(shí)選取面積大小為10 μm2的血管圖像，對(duì)CD34陽(yáng)性染色(CD34+)的特洛細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，每個(gè)圖像重復(fù)兩次，取平均值。

2 結(jié)果

2.1 兩組小鼠損傷后不同時(shí)間點(diǎn)頸動(dòng)脈血管中特洛細(xì)胞形態(tài)變化比較 觀察組和對(duì)照組術(shù)前綠色熒光的CD34+和PDGFR+特洛細(xì)胞均集中位于血管壁的外膜層中。術(shù)后8 h，觀察組CD34+特洛細(xì)胞(綠色熒光)聚集在血管壁外膜損傷處，對(duì)照組血管壁外膜損傷處的CD34+特洛細(xì)胞(紅色熒光)數(shù)量明顯多于觀察組，CD117+和PDGFR+特洛細(xì)胞也有相同表現(xiàn)，但細(xì)胞形態(tài)改變不明顯。術(shù)后48 h，觀察組CD117+特洛細(xì)胞(紅色熒光)數(shù)量明顯減少，細(xì)胞體扁平，由圓形或橢圓形變?yōu)榧?xì)長(zhǎng)的梭形，端足細(xì)長(zhǎng)如絲；對(duì)照組CD34+(綠色熒光)和CD117+(紅色熒光)特洛細(xì)胞形態(tài)較術(shù)后8 h無(wú)明顯差別，端足形態(tài)無(wú)明顯改變。術(shù)后21 d，觀察組CD117+(綠色熒光)特洛細(xì)胞形態(tài)恢復(fù)至術(shù)前和術(shù)后8 h的形態(tài)，但特洛細(xì)胞數(shù)量較術(shù)后8 h明顯減少；對(duì)照組CD34+(綠色熒光)、CD117+(紅色熒光)和PDGFR+(綠色熒光)特洛細(xì)胞形態(tài)較術(shù)前無(wú)明顯差別，數(shù)量無(wú)明顯改變。

2.2 兩組小鼠損傷后不同時(shí)間點(diǎn)頸動(dòng)脈血管中特洛細(xì)胞數(shù)量比較 隨著時(shí)間的推移，兩組術(shù)后特洛細(xì)胞數(shù)量均呈現(xiàn)先升高后降低趨勢(shì)。兩組術(shù)前特洛細(xì)胞數(shù)量比較無(wú)明顯差異(P>0.05)。觀察組術(shù)后8 h特洛細(xì)胞數(shù)量高于術(shù)前，術(shù)后48 h和術(shù)后21 d特洛細(xì)胞數(shù)量均低于術(shù)前(P均<0.05)；對(duì)照組術(shù)后8、48 h特洛細(xì)胞數(shù)量均高于術(shù)前(P均<0.05)，術(shù)后21 d與術(shù)前比較無(wú)明顯差異(P>0.05)。觀察組術(shù)后8 h、48 h、21 d特洛細(xì)胞數(shù)量均低于對(duì)照組(P均<0.05)。見表1。

表1 兩組小鼠損傷后不同時(shí)間點(diǎn)頸動(dòng)脈血管中特洛細(xì)胞數(shù)量比較(個(gè),

3 討論

自特洛細(xì)胞被發(fā)現(xiàn)至今已有50余年的歷史，目前研究重點(diǎn)多聚焦在這種特殊細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)以及組織分布上[8, 9]，關(guān)于特洛細(xì)胞在病理生理學(xué)方面的研究較少。雖然近幾年來(lái)特洛細(xì)胞在皮膚免疫性硬化癥、子宮肌瘤和肺纖維化的病理研究中有些進(jìn)展，但是并沒(méi)有從分子生物學(xué)的角度完全解釋特洛細(xì)胞在疾病發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中的各種改變[10, 11]。特洛細(xì)胞存在于動(dòng)脈血管壁內(nèi)，在動(dòng)脈血管壁的外膜層和中膜層形成三維立體框架結(jié)構(gòu)，支撐和維持血管的正常形態(tài)功能[12, 13]。目前，國(guó)內(nèi)外關(guān)于特洛細(xì)胞免疫生物學(xué)指標(biāo)的研究集中在CD34、CD117、PDGFR、VEGFR、CD28、CD31、Vimentin、Nanog和Sca-1等免疫標(biāo)記抗體上，應(yīng)用免疫熒光技術(shù)將標(biāo)本中的組織染色后可以將組織中的特洛細(xì)胞和成纖維細(xì)胞、上皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等常見細(xì)胞分離開來(lái)，再根據(jù)標(biāo)記后細(xì)胞表現(xiàn)出的特殊形態(tài)結(jié)構(gòu)將特洛細(xì)胞區(qū)分出來(lái)[14, 15]。雖然在不同的組織器官中，特洛細(xì)胞陽(yáng)性表達(dá)的免疫生物學(xué)指標(biāo)有所不同，但在小鼠動(dòng)脈血管壁中特洛細(xì)胞陽(yáng)性表達(dá)的免疫指標(biāo)為CD34、CD117和PDGFR，這也是本研究應(yīng)用CD34/CD117和CD34/PDGFR雙標(biāo)記免疫熒光染色法的理論基礎(chǔ)。

動(dòng)脈粥樣硬化是發(fā)生于動(dòng)脈血管壁的常見病理改變，粥樣硬化斑塊從動(dòng)脈血管的損傷內(nèi)膜開始，逐漸不可逆地向動(dòng)脈外膜層進(jìn)展。動(dòng)脈粥樣硬化過(guò)程中從內(nèi)皮細(xì)胞開始發(fā)生細(xì)胞水樣變性、脂肪樣變性及泡沫樣變性等病理學(xué)改變，變性的細(xì)胞逐漸增多并深達(dá)血管壁肌層，導(dǎo)致血管壁正常結(jié)構(gòu)的退變及消失，彈性減弱甚至失去彈性[3，16,17]。在動(dòng)脈粥樣硬化疾病發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，存在著大量正常細(xì)胞的變性壞死和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，而特洛細(xì)胞作為一種維持正常血管壁形態(tài)結(jié)構(gòu)的功能性細(xì)胞，在動(dòng)脈粥樣硬化的病理發(fā)展過(guò)程中出現(xiàn)了細(xì)胞體脂肪樣變性和水樣變性，失去了細(xì)胞間廣泛的連接。此時(shí)的血管如果受到損傷，在修復(fù)過(guò)程中受到脂質(zhì)體侵蝕的細(xì)胞會(huì)因失去正常功能而影響血管壁修復(fù)[6]。

本研究結(jié)果顯示，兩組術(shù)前頸動(dòng)脈血管中的特洛細(xì)胞數(shù)量無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，說(shuō)明動(dòng)脈粥樣硬化并不會(huì)影響頸動(dòng)脈血管中的特洛細(xì)胞數(shù)量。頸動(dòng)脈血管損傷后修復(fù)過(guò)程中，對(duì)照組特洛細(xì)胞數(shù)量在術(shù)后8 h明顯升高后又緩慢降低至損傷前水平，而觀察組特洛細(xì)胞數(shù)量雖然也在術(shù)后8 h出現(xiàn)了升高趨勢(shì)，但隨著時(shí)間推移其數(shù)量明顯降低，且觀察組術(shù)后8 h、48 h和21 d特洛細(xì)胞數(shù)量均明顯低于對(duì)照組。這說(shuō)明在動(dòng)脈粥樣硬化小鼠頸動(dòng)脈血管損傷修復(fù)的過(guò)程中，其特洛細(xì)胞數(shù)量明顯少于正常小鼠。因此，特洛細(xì)胞參與了動(dòng)脈粥樣硬化小鼠的頸動(dòng)脈血管損傷修復(fù)。本研究結(jié)果顯示，觀察組血管損傷修復(fù)過(guò)程中伴隨著特洛細(xì)胞和端足形態(tài)改變，在損傷修復(fù)初期特洛細(xì)胞的細(xì)胞體由圓形或橢圓形變?yōu)榧?xì)長(zhǎng)的梭形，端足變得更加細(xì)長(zhǎng)或消失，直到損傷修復(fù)后期(術(shù)后21 d)其細(xì)胞形態(tài)恢復(fù)至術(shù)前狀態(tài)；但在正常動(dòng)脈血管中，未發(fā)現(xiàn)上述特洛細(xì)胞形態(tài)的改變。分析原因，這可能與動(dòng)脈粥樣硬化過(guò)程中高血脂對(duì)血管壁的影響有關(guān);在脂質(zhì)體的影響下，特洛細(xì)胞的數(shù)量可能無(wú)法恢復(fù)到正常水平，從而延長(zhǎng)了血管損傷后修復(fù)的時(shí)間。

綜上所述，動(dòng)脈粥樣硬化并不會(huì)影響小鼠頸動(dòng)脈血管中的特洛細(xì)胞數(shù)量，但動(dòng)脈粥樣硬化小鼠在頸動(dòng)脈血管損傷修復(fù)過(guò)程中存在特洛細(xì)胞數(shù)量降低及形態(tài)異常。本研究?jī)H從宏觀角度闡述了特洛細(xì)胞在血管損傷修復(fù)過(guò)程中的數(shù)量變化規(guī)律，應(yīng)用免疫生物學(xué)原理觀察特洛細(xì)胞在血管修復(fù)不同階段的形態(tài)改變，但只有應(yīng)有透射電鏡技術(shù)才能觀察到特洛細(xì)胞內(nèi)各種細(xì)胞器的種類改變及其在疾病不同階段的超微結(jié)構(gòu)改變[18, 19]，這也是本研究的不足之處。在接下來(lái)的研究中，我們將從小鼠動(dòng)脈粥樣硬化血管的活體標(biāo)本中分離特洛細(xì)胞，進(jìn)行原代細(xì)胞培養(yǎng)，以達(dá)到從微觀角度分析研究特洛細(xì)胞的目的。