白瑜，于銳，田密，何平，趙自霞，張蓓茹 中國醫(yī)科大學附屬盛京醫(yī)院，沈陽110004

腎小管損傷是慢性腎臟病(CKD)發(fā)生發(fā)展的一個重要機制，與患者的腎臟預后密切相關[1]，而蛋白尿導致的腎小管上皮細胞轉分化是腎小管損傷的重要病理機制之一。近年研究表明，腎損傷分子1(KIM-1)不僅可以作為急慢性腎損傷的早期生物學標志物，還參與了腎臟損傷與修復過程[2]。前期研究顯示，原發(fā)性腎小球腎炎患者腎小管間質損傷程度及蛋白尿嚴重程度與尿KIM-1水平呈正相關關系[3]，但KIM-1在白蛋白所致腎小管間質損傷中的病理機制尚不明確。2015年1月～2017年1月，本研究觀察了白蛋白對腎小管上皮細胞轉分化的影響，并探討其機制是否與KIM-1有關及其可能的調控途徑。現報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 細胞：人腎小管上皮細胞系HK-2購于廣州吉尼歐生物科技有限公司。主要試劑：DMEM/F12培養(yǎng)液、胎牛血清、Opti-MEM均購于美國Hyclone公司，LipofectamineTM2000購于美國Invitrogen公司，青-鏈霉素溶液、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒、細胞膜蛋白與胞漿蛋白提取試劑盒、BCA蛋白濃度測定試劑盒(增強型)均購于北京碧云天生物科技有限公司；人血清白蛋白(HSA)和HRP標記的山羊抗兔IgG抗體均購于美國Sigma公司，KIM-1和α平滑肌肌動蛋白(α-SMA)抗體均購于美國Abcam公司，p38、p-p38和E鈣黏素(E-cadherin)抗體均購于美國CST公司，p38分裂原激活蛋白激酶(p38 MAPK)通路特異性抑制劑SB203580購于美國Selleck Chemicals公司。

1.2 HSA對HK-2細胞轉分化及KIM-1表達影響的觀察

1.2.1 細胞培養(yǎng)及HSA處理 將HK-2細胞置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中，用含10%胎牛血清、100 U/mL青-鏈霉素的DMEM/F12培養(yǎng)基進行培養(yǎng)。當細胞生長至70%融合時進行細胞傳代，取3～5代對數生長期的HK-2細胞，加入5 mg/mL HSA作用24 h。

1.2.2 HSA作用前后細胞E-cadherin、α-SMA、KIM-1、p-p38、p38表達檢測 采用Western blotting法。收集1.2.1經HSA作用前后的HK-2細胞，按照提取試劑盒說明書提取蛋白，BCA蛋白定量試劑盒法測定蛋白濃度。加入蛋白上樣緩沖液并煮沸，取等量蛋白進行SDS-PAGE電泳，半干法轉膜及5% BSA封閉1 h。按照抗體說明書推薦比例對E-cadherin、α-SMA、KIM-1、p-p38和p38一抗進行稀釋，4 ℃條件下孵育過夜；加入HRP標記的二抗,室溫孵育1 h，TBST洗膜3次；加入ECL發(fā)光液顯影，采用Image J圖像分析系統(tǒng)進行灰度值分析。GAPDH為內參，以目的蛋白與內參蛋白灰度值的比值計算E-cadherin、α-SMA、KIM-1、p-p38、p38蛋白相對表達量。

1.3 KIM-1沉默對HSA作用后HK-2細胞轉分化影響的觀察

1.3.1 質粒轉染及細胞分組處理 取3～5代對數生長期的HK-2細胞，以5×105/孔接種于6孔板，細胞生長至70%～80%融合時，更換無血清培養(yǎng)液進行培養(yǎng)。將細胞隨機分為KIM-1沉默組和空載體對照組，參照LipofectamineTM2000轉染試劑盒說明書分別轉染KIM-1 siRNA及對照空載體；轉染48 h后加入5 mg/mL HSA處理24 h。

1.3.2 細胞E-cadherin、α-SMA、KIM-1表達檢測 參照1.2.2，采用Western blotting法檢測兩組細胞E-cadherin、α-SMA、KIM-1蛋白相對表達量。

1.4 KIM-1過表達對HSA作用后HK-2細胞轉分化及p38 MAPK通路影響的觀察

1.4.1 KIM-1過表達質粒轉染及細胞分組處理 取3～5代對數生長期的HK-2細胞，以5×105/孔接種于6孔板，細胞生長至70%～80%融合時，更換無血清培養(yǎng)液進行培養(yǎng)。將細胞隨機分為SB203580+KIM-1組、KIM-1組和HSA組，SB203580+KIM-1組、KIM-1組均參照LipofectamineTM2000轉染試劑盒說明書轉染KIM-1過表達質粒48 h，SB203580+KIM-1組給予10 μmol/L SB203580預處理1 h后再與5 mg/mL HSA共處理24 h，KIM-1組、HSA組給予5 mg/mL HSA處理24 h。

1.4.2 細胞E-cadherin、α-SMA、KIM-1、p-p38、p38表達檢測 參照1.2.2，采用Western blotting法檢測三組細胞KIM-1、E-cadherin、α-SMA、p-p38、p38蛋白相對表達量。

2 結果

2.1 HSA作用前后HK-2細胞E-cadherin、α-SMA、KIM-1、p-p38、p38表達比較 與HSA作用前比較，HSA作用后HK-2細胞E-cadherin表達降低，α-SMA、KIM-1、p-p38表達均升高(P均<0.05)，p38表達變化無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 HSA作用前后HK-2細胞E-cadherin、α-SMA、KIM-1、p-p38、p38表達比較

2.2 KIM-1沉默組和空載體對照組E-cadherin、α-SMA、KIM-1表達比較 與空載體對照組比較，KIM-1沉默組E-cadherin表達升高，α-SMA、KIM-1表達均降低(P均<0.05)。見表2。

表2 KIM-1沉默組和空載體對照組E-cadherin、α-SMA、KIM-1蛋白表達比較

2.3 SB203580+KIM-1組、KIM-1組和HSA組E-cadherin、α-SMA、KIM-1、p-p38、p38表達比較 KIM-1組、SB203580+KIM-1組和HSA組E-cadherin表達依次升高，α-SMA、p-p38表達均依次降低(P均<0.05)，三組p38表達比較均無統(tǒng)計學差異(P均>0.05)。SB203580+KIM-1組、KIM-1組KIM-1表達均高于HSA組，SB203580+KIM-1組、KIM-1組KIM-1表達比較無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。見表3、圖1。

表3 SB203580+KIM-1組、KIM-1組和HSA組E-cadherin、α-SMA、KIM-1、p-p38、p38蛋白表達比較

圖1 SB203580+KIM-1組、KIM-1組和HSA組KIM-1、E-cadherin、α-SMA、p-p38、p38蛋白表達條帶圖(Western blotting法)

3 討論

白蛋白尿導致的腎小管上皮細胞轉分化是造成腎小管損傷、促進CKD進展的重要因素[4]，探究其病理機制及干預策略也是CKD治療領域備受關注的方向。KIM-1是在腎小管上皮細胞表達的一種跨膜蛋白，在正常腎臟組織中幾乎不表達，但是在各種急性腎損傷時腎組織KIM-1表達明顯升高。目前，KIM-1已經成為判斷急性腎損傷的一種特異性生物標志物[5]，能夠有效預測急性腎損傷的病情和預后，且與急性腎損傷進展至CKD具有一定的相關性[6,7]。除了與急性腎損傷相關，KIM-1與CKD也具有一定的相關性，是CKD進展至終末期腎臟病的獨立危險因素[8,9]。本研究結果顯示，HSA可導致HK-2細胞發(fā)生轉分化及KIM-1蛋白表達增加。這一結果也再次證明KIM-1的升高能夠參與腎小管損傷。

KIM-1不僅僅是急性腎損傷或CKD的生物標志物之一，其在腎臟病進展中也具有重要的病理作用。Humphreys等[10]建立了腎小管上皮細胞持續(xù)表達KIM-1的轉基因小鼠，發(fā)現即使在沒有外界任何促進腎小管間質損傷的因素存在下，4周后轉基因小鼠也會自發(fā)出現腎臟炎癥反應和腎小管間質纖維化，且進行性加重；該實驗提示KIM-1在CKD腎小管損傷中具有重要的病理作用，可能與促進局部炎癥反應或腎小管損傷等因素有關。而在蛋白超負荷腎病大鼠模型以及在阿霉素所致伴有大量蛋白尿的腎病模型中，均可發(fā)現尿中KIM-1排泄增多，與尿蛋白和腎間質損傷呈正相關關系，且KIM-1僅在炎癥、纖維化及腎小管損傷區(qū)域表達[11,12]。因此，本研究進一步探討KIM-1是否參與了白蛋白所致的腎小管上皮細胞轉分化過程。本研究結果顯示，當KIM-1沉默時伴隨著KIM-1水平降低、白蛋白所致腎小管上皮細胞轉分化程度減輕，這一結果提示在白蛋白所致腎小管上皮細胞轉分化過程中KIM-1不僅僅是腎小管損傷的標志物，而且在這個損傷過程中發(fā)揮了重要的病理作用。

目前，KIM-1參與腎臟損傷的病理機制尚不明確。MAPK是真核生物細胞主要信號轉導通路，而p38 MAPK是其中功能最為廣泛的分支之一，在人體組織中廣泛存在，參與調控細胞凋亡、氧化應激及炎癥反應等。有研究證實，p38 MAPK通路活化能夠加速腎小管上皮細胞轉分化[13]。Tian等[14]研究發(fā)現，CKD組織尤其是腎小管間質纖維化組織KIM-1表達明顯增加，而且KIM-1會通過MAPK通路而促進腎臟局部巨噬細胞遷移及炎癥進展。因此，本研究進一步探討了在KIM-1促進白蛋白所致腎小管上皮細胞轉分化過程中是否有p38 MAPK的參與。結果顯示，HSA作用HK-2細胞發(fā)生轉分化的過程中p38 MAPK磷酸化增強，而KIM-1沉默可減輕p38 MAPK的磷酸化程度、KIM-1過表達可促進p38 MAPK的磷酸化程度；p38 MAPK特異性抑制劑預處理HK-2細胞可有效抑制p38 MAPK磷酸化、減輕HK-2細胞的轉分化程度，但并不影響KIM-1表達；這表明p38 MAPK作為下游通路，至少部分介導了KIM-1促進白蛋白導致腎小管上皮細胞轉分化的病理過程。

綜上所述，白蛋白可促進腎小管上皮細胞轉分化，其機制可能與促進KIM-1表達進而激活p38 MAPK通路有關。本研究也再次證明KIM-1并不僅僅是急性或慢性腎損傷的生物標志物，而是具有重要的病理作用，對KIM-1病理機制的探索可能為將來有效防治CKD提供有效手段。