許冰馨，王琪珊，李 欽，范凱健，朱靜艷，王婷玉

(上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院1.藥劑科、2.藥劑科靜脈藥物配置中心，上海 200011)

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種自身免疫性疾病，常出現(xiàn)多個(gè)關(guān)節(jié)的持續(xù)性疼痛，嚴(yán)重時(shí)還可導(dǎo)致骨破壞、骨質(zhì)侵蝕、關(guān)節(jié)畸形和功能喪失。長(zhǎng)期的慢性關(guān)節(jié)疼痛常發(fā)生在手、足小關(guān)節(jié)中，是影響患者生存質(zhì)量的重要因素。RA疼痛可能由不同病因造成，如外周炎癥、中樞神經(jīng)系統(tǒng)失調(diào)以及精神因素等。盡管目前對(duì)于RA疼痛的治療有抗風(fēng)濕藥、鎮(zhèn)痛藥、抗抑郁藥和抗癲癇藥，但仍有許多患者的疼痛未能治愈[1]。因此，只有了解RA疼痛的根本原因，才能有效地進(jìn)行疼痛治療。

背根神經(jīng)節(jié)(dorsal root ganglion，DRG)是連接在脊髓背根兩側(cè)的膨脹結(jié)節(jié)，負(fù)責(zé)接收身體感受器的神經(jīng)沖動(dòng)，再將信號(hào)傳遞到脊髓。DRG在神經(jīng)性疼痛的產(chǎn)生與持續(xù)中發(fā)揮重要作用，故研究DRG中與疼痛機(jī)制密切相關(guān)的離子通道及其受體、相關(guān)神經(jīng)生長(zhǎng)因子都是實(shí)現(xiàn)DRG靶向鎮(zhèn)痛的關(guān)鍵[2]。

地塞米松(dexamethasone，DEX)屬于長(zhǎng)效的糖皮質(zhì)激素，具有強(qiáng)大的抗炎、抗風(fēng)濕和免疫抑制作用?，F(xiàn)有臨床數(shù)據(jù)表明，DEX可以迅速緩解RA患者關(guān)節(jié)腫脹和疼痛，減少骨侵蝕、降低炎癥因子的表達(dá)，且治療效果長(zhǎng)久且安全[3]。雖然DEX聯(lián)合抗風(fēng)濕藥物治療的臨床研究有很多，但是關(guān)于DEX治療RA動(dòng)物模型的DRG疼痛的作用機(jī)制的研究相對(duì)較少。故本文通過在Wistar大鼠上建立膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎(collagen-induced arthritis， CIA)模型，并給予DEX(1 mg·kg-1)腹腔注射。通過觀察大鼠后足機(jī)械痛閾改變、檢測(cè)血清中炎癥因子水平、檢測(cè)DRG中炎癥因子、疼痛相關(guān)的神經(jīng)生長(zhǎng)因子、離子通道受體表達(dá)水平的改變，來確定DEX對(duì)CIA大鼠疼痛與炎癥的調(diào)節(jié)作用和潛在的機(jī)制。

1 材料

1.1 動(dòng)物32只SPF級(jí)Wistar大鼠，♂，6～8周齡,體質(zhì)量(160±20)g，購(gòu)買和飼養(yǎng)于上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。動(dòng)物生產(chǎn)許可證編號(hào)：SCXK(滬)2013-0016，使用許可證編號(hào)：SYXK(滬)2016-0016。除10只正常組外，其余22只被隨機(jī)、平均分成模型組和給藥組，于溫度(22±2)℃，相對(duì)濕度為50%～60%， 12 h明暗交替的通風(fēng)環(huán)境中適應(yīng)喂養(yǎng)1周。本實(shí)驗(yàn)已通過上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 試劑牛Ⅱ型膠原(Chondrex公司，批號(hào)170606)、弗氏不完全佐劑(Chondrex公司,170594)、地塞米松(Stemcell technologies, 批號(hào)BX27114)、TRIzol(美國(guó)Ambion公司，批號(hào)184608)。PCR引物(上海生工生物科技有限公司)、SYBR Green qPCR Master Mix(日本TaKaRa公司，批號(hào)522072)、大鼠IL-17A ELISA試劑盒(Multisciences公司，批號(hào)031780133)、大鼠TGF-β1 ELISA試劑盒(Multisciences公司，批號(hào)181711151)。

1.3 儀器旋渦混懸儀(海門其林貝爾，型號(hào)VORTEX-5)、離心機(jī)(德國(guó)Beckman,型號(hào)Microfuge 20R)、電子天平(上海浦春計(jì)量有限公司，型號(hào)JE2001)、實(shí)時(shí)定量PCR儀美國(guó)Thermo Scientific公司，型號(hào)7500)、酶標(biāo)儀(澳大利亞Tecan公司，型號(hào)Infinite 200 Pro)、Von Frey纖維絲測(cè)痛儀(美國(guó)Danmic公司，型號(hào)Aesthesio)。

2 方法

2.1 CIA造模方法牛Ⅱ型膠原和弗氏不完全佐劑按照1 ∶1混勻成乳劑。d 0，將乳劑環(huán)繞多點(diǎn)注射于大鼠尾根部，每只注射乳劑0.1 mL。d 7，將相同乳劑以同樣方式注射于大鼠尾根部，每只注射0.1 mL。

2.2 實(shí)驗(yàn)分組與給藥方法將32只Wistar雄鼠分組。除正常組(NC組)10只外，其余大鼠造模成功后又隨機(jī)平均分成模型組(Model組)和給藥組(DEX組)。d 8開始，給藥組腹腔注射地塞米松1 mg·kg-1，每周給藥3次，連續(xù)給藥4周。同時(shí)，正常組和模型組腹腔注射等體積生理鹽水。

2.3 疼痛行為學(xué)測(cè)試造模后，每周2次，在明亮、安靜環(huán)境下，使用Von-Frey測(cè)痛儀，通過up and down法[4]檢測(cè)各組大鼠有后足機(jī)械性縮足反射閾值(mechanical withdrawal threshold，MWT)。先將每只大鼠置于底部為金屬篩網(wǎng)的透明塑料籠內(nèi)適應(yīng)環(huán)境15 min，待其平靜后，用Von Frey纖維絲從籠底垂直刺激大鼠后足底中部位置。當(dāng)大鼠出現(xiàn)快速縮足即視作陽(yáng)性反應(yīng)，若時(shí)間大于5 s仍無(wú)縮足反應(yīng)則視作陰性。每次間隔至少5 min，連續(xù)測(cè)3次，取平均值。根據(jù)Dixon公式計(jì)算50%縮足閾值。[50%縮足閾值=10(Xf+κδ)/10 000]Xf為末次刺激纖維絲力度的對(duì)數(shù)值，κ為不同刺激方式的系數(shù)，δ為各刺激力度取對(duì)數(shù)值后相鄰間距的平均數(shù)。

2.4 ELISA法測(cè)定血清中炎癥因子IL-17A和TGF-β1水平末次給藥24 h后，將大鼠麻醉后經(jīng)腹主動(dòng)脈取血。離心(3 600 r·min-1×10 min)后將血清凍存于-80 ℃。試劑與血清樣本平衡至室溫后，按照ELISA試劑盒說明書檢測(cè)步驟操作。使用酶標(biāo)儀進(jìn)行450 nm與630 nm雙波長(zhǎng)檢測(cè)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣本OD值。

2.5 Real-time PCR檢測(cè)滑膜炎癥因子mRNA的表達(dá)情況剝離大鼠后肢膝關(guān)節(jié)周圍皮毛、筋膜與肌肉，剪開韌帶并剝離髕下脂肪墊，用眼科剪刀取出大鼠滑膜組織。研碎后，TRIzol法提RNA，并在PCR擴(kuò)增儀逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。PCR擴(kuò)增程序：95 ℃高溫變性，60 ℃低溫退火并延伸，共40個(gè)循環(huán)，65 ℃適溫延伸[5]。引物序列見Tab 1。

2.6 Real-time PCR檢測(cè)DRG相關(guān)炎癥因子和疼痛指標(biāo)NPY、NGF、BDNF、TRPV1的mRNA表達(dá)情況大鼠處死后，沿背部正中線剪開皮膚、分離脊柱側(cè)邊肌肉，咬骨鉗或剪刀打開脊柱，分離脊髓后，在左右對(duì)稱的椎間孔內(nèi)可見淡黃色透明卵狀的DRG[6]。取出L4-L6雙側(cè)DRG并研碎，TRIzol法提RNA，并在PCR擴(kuò)增儀逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。PCR擴(kuò)增程序同2.5，引物序列見Tab 1。

3 結(jié)果

3.1 地塞米松對(duì)CIA大鼠MWT的影響造模初期，3組大鼠MWT沒有明顯差異。d12-19，模型組MWT值呈快速下降趨勢(shì)，隨后一直維持在較低水平。d19模型組MWT較正常組明顯變小(P<0.01)，而地塞米松組較模型組明顯升高(P<0.05)，見Fig 1。

Tab 1 Primer sequences in PCR

Fig 1 Measurement results of MWT of rats

3.2 地塞米松對(duì)CIA大鼠血清中炎癥因子含量的影響連續(xù)給藥4周后，取血清，采用ELISA方法對(duì)3組大鼠的促炎因子IL-17A、抗炎因子TGF-β1表達(dá)量分別進(jìn)行檢測(cè)。模型組IL-17A表達(dá)量明顯高于正常組(P<0.01)，給藥組IL-17A表達(dá)量較模型組有明顯降低(P<0.05)。模型組TGF-β1表達(dá)量明顯低于常組(P<0.05)，給藥組TGF-β1表達(dá)量較模型組有明顯升高(P<0.01)。表明地塞米松可以降低CIA大鼠血清中促炎因子表達(dá)量，同時(shí)提高抑炎因子的表達(dá)量，具有整體抗炎功效。見Fig 2。

3.3 地塞米松對(duì)滑膜中炎癥因子mRNA表達(dá)的影響從Fig 3的Real-time PCR結(jié)果可見，相較正常組，模型組滑膜組織中的癥因子IL-1β、IL-6、IL-17、TNF-α mRNA的相對(duì)表達(dá)量上升；給藥組中這些炎癥因子的相對(duì)表達(dá)量較模型組減少，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。表明地塞米松具有抗炎作用，可以抑制滑膜中的炎癥因子，減輕滑膜炎癥。

3.4 地塞米松對(duì)DRG中炎癥因子mRNA表達(dá)的影響從Fig 4A的Real-time PCR結(jié)果可見，相較正常組，模型組DRG中的癥因子IL-1β、IL-6、IL-17、TNF-α mRNA的相對(duì)表達(dá)量上升；給藥組中這些炎癥因子的相對(duì)表達(dá)量較模型組減少，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。表明地塞米松可以抑制DRG中炎癥因子，具有抗炎作用。

Fig 2 Effect of dexamethasone on expression of IL-17A

Fig 3 Effect of dexamethasone on inflammatory factors

3.5 地塞米松對(duì)DRG中疼痛相關(guān)指標(biāo)的影響從Fig 4B、4C的Real-time PCR結(jié)果可見，相對(duì)于正常組，模型組DRG中的疼痛相關(guān)的神經(jīng)生長(zhǎng)因子：神經(jīng)肽Y(neuropeptide Y，NPY)、神經(jīng)生長(zhǎng)因子(nerve growth factor，NGF)、腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor, BDNF)以及疼痛指標(biāo)：瞬時(shí)感受器電位香草酸受體1(transient receptor potential vanilloid-1,TRPV1)的mRNA的相對(duì)表達(dá)量上升；而在給藥組中NPY、NGF、BDNF、TRPV1的mRNA的相對(duì)表達(dá)量較模型組減少，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。表明地塞米松可以抑制DRG中這些疼痛相關(guān)的受體和神經(jīng)生長(zhǎng)因子的含量，具有緩解疼痛的作用。

Fig 4 Effect of dexamethasone on mRNA expression of

4 討論

RA是一類以滑膜炎為特征的自身免疫性疾病，常出現(xiàn)手足小關(guān)節(jié)滑膜炎、關(guān)節(jié)腫痛。晚期還會(huì)造成骨和軟骨破壞、關(guān)節(jié)變形、疼痛加劇、勞動(dòng)力喪失[7]。CIA和RA相似，均會(huì)出現(xiàn)炎癥因子介導(dǎo)的組織損傷、滑膜炎癥和關(guān)節(jié)疼痛變形。地塞米松是一類強(qiáng)效糖皮質(zhì)激素，具有抗炎、抑制免疫和穩(wěn)定神經(jīng)膜的作用。臨床常單獨(dú)或聯(lián)合其他鎮(zhèn)痛藥物用于治療神經(jīng)根病變、神經(jīng)阻滯疼痛、神經(jīng)炎性疼痛，術(shù)后疼痛，甚至是中重度癌癥疼痛[8-9]。因此，本實(shí)驗(yàn)通過建立CIA大鼠模型，進(jìn)一步研究DEX對(duì)于緩解CIA局部炎癥和關(guān)節(jié)疼痛的作用機(jī)制。

炎癥因子在機(jī)體內(nèi)的含量也與疾病嚴(yán)重程度緊密相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，炎癥因子IL-1β、IL-6、IL-17、TNF-α在RA患者體內(nèi)大量存在，會(huì)造成滑膜炎、關(guān)節(jié)軟骨破壞和疼痛[2]。而TGF-β1則具有炎癥抑制、免疫抑制作用和促進(jìn)纖維細(xì)胞、成骨細(xì)胞增殖的作用，在RA中可以減少滑膜細(xì)胞增生、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、血管增生和肉芽組織的形成，對(duì)防止滑膜增生、浸潤(rùn)及關(guān)節(jié)破壞有重要作用[10]。局部注射TGF-β1不僅能促使傷口愈合，還能促進(jìn)骨和軟骨的修復(fù)。本實(shí)驗(yàn)通過ELISA法測(cè)得大鼠血清中致炎因子IL-17A的含量明顯高于正常組大鼠，而抗炎因子TGF-β1的含量則低于正常組大鼠。在DEX治療后，給藥組血清內(nèi)IL-17A含量較模型組下降明顯，TGF-β1含量明顯回升。說明DEX可以有效降低CIA大鼠血清內(nèi)的炎癥因子IL-17A，提高TGF-β1的作用，具有抑制整體促炎因子、增加抗炎因子，進(jìn)而減少機(jī)體免疫應(yīng)答、緩解局部滑膜炎癥和增生的作用。

滑膜炎是RA基本病理改變之一。早期控制滑膜炎可以有效緩解病情，阻止關(guān)節(jié)破壞、僵硬變形，還能減少殘疾的發(fā)生。PCR結(jié)果顯示大鼠滑膜組織中炎癥因子IL-1β、IL-6、IL-17、TNF-α的mRNA表達(dá)水平均高于正常組；而給藥組的炎癥因子水平較模型組均降低。說明地塞米松對(duì)膝關(guān)節(jié)滑膜組織的局部炎癥可以起到明顯的緩解作用。

DRG由脊髓神經(jīng)節(jié)內(nèi)的感覺神經(jīng)元的軸突組成，對(duì)稱地連接于在脊髓背根左右兩側(cè)。它作為痛覺傳入神經(jīng)元在疼痛調(diào)節(jié)機(jī)制中有非常重要的作用，在神經(jīng)病理性疼痛的機(jī)制研究中具有重要意義。DRG中的炎癥因子參與疼痛的形成，還會(huì)導(dǎo)致疼痛表達(dá)上調(diào)[11-12]。這些炎癥因子不僅能引起急慢性疼痛、觸誘發(fā)痛，還與神經(jīng)源性痛緊密相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)通過Real-time PCR法檢測(cè)大鼠DRG中炎癥因子IL-1β、IL-6、IL-17、TNF-α的mRNA的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，模型組大鼠炎癥因子mRNA的表達(dá)量相較正常組均有不同程度的升高，而給藥組較模型組炎癥因子mRNA的表達(dá)量均有降低。表明地塞米松可以降低DRG中的炎癥因子的表達(dá)，這可能也與給藥后痛閾的降低有關(guān)。

NPY是存在于外周和中樞神經(jīng)元中的一類內(nèi)源性物質(zhì)，參與疼痛調(diào)制。研究表明，脊髓Y1受體的激活和DRGY2受體的拮抗都能達(dá)到緩解機(jī)械痛的作用[13]。神經(jīng)生長(zhǎng)因子NGF可影響外周和中樞神經(jīng)病理性疼痛，且NGF在RA患者的滑膜中含量與關(guān)節(jié)痛敏程度有關(guān)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)，經(jīng)過抗NGF治療后疼痛得到明顯緩解[14]。BDNF作為一類腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，與中樞神經(jīng)的發(fā)育分化以及神經(jīng)病理性疼痛緊密相關(guān)。多種疼痛動(dòng)物模型中發(fā)現(xiàn)，阻斷BDNF可以有效抑制痛敏現(xiàn)象的發(fā)生[15]。TRPV1在三叉神經(jīng)節(jié)和DRG中均有表達(dá)，可參與慢性的外周和中樞敏感化，也與急性炎癥痛敏相關(guān)，在熱痛敏和機(jī)械痛敏起重要作用[16]。 本實(shí)驗(yàn)通過Real-time PCR法檢測(cè)大鼠DRG中神經(jīng)生長(zhǎng)因子NPY、NGF、BDNF和疼痛相關(guān)的額離子通道受體TRPV1的mRNA 的表達(dá)水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)模型組大鼠的NPY、NGF、BDNF、TRPV1的mRNA的表達(dá)量較正常組均有不同程度的升高，而給藥組較模型組均有降低。說明地塞米松可以有效降低CIA大鼠DRG中NPY、NGF、BDNF、TRPV1的表達(dá)，對(duì)調(diào)節(jié)CIA中的疼痛反應(yīng)有很好療效。

綜上，地塞米松治療CIA大鼠滑膜炎癥和關(guān)節(jié)疼痛有明顯的療效。DEX可以降低CIA大鼠血清中促炎因子水平，同時(shí)提高促炎因子水平。此外，DEX還能通過改善滑膜內(nèi)炎癥因子和DRG中炎癥因子、疼痛相關(guān)的神經(jīng)生長(zhǎng)因子NPY、NGF、BDNF以及香草酸受體TRPV1的水平以達(dá)到減輕滑膜炎癥和緩解關(guān)節(jié)疼痛的治療目的。