甄艷杰，劉靚靚，趙雨薇，鐘 明，沈麗霞

(河北北方學(xué)院藥學(xué)系，河北省神經(jīng)藥理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北 張家口 075000)

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)屬于一種典型的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，臨床表現(xiàn)為進(jìn)行性的記憶的減退以及認(rèn)知功能的損害[1]。目前認(rèn)為AD有兩個(gè)比較明顯的病理學(xué)特征：由β-淀粉樣蛋白(amyloid-β protein，Aβ)沉積形成的老年斑(senile plaques)在大腦皮層和海馬神經(jīng)元細(xì)胞外大量出現(xiàn)；由神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)高度磷酸化的tau蛋白所導(dǎo)致的神經(jīng)纖維纏結(jié)(neurofibrillary tangles)。而研究發(fā)現(xiàn)AD最終都表現(xiàn)著相同的病理改變，即大腦皮層、海馬、額顳葉中的神經(jīng)元突觸大量缺失和神經(jīng)元的細(xì)胞凋亡，這些神經(jīng)元突觸和神經(jīng)細(xì)胞與認(rèn)知功能密切相關(guān)[1]。由于其發(fā)病機(jī)制尚不清楚，目前臨床治療藥物只能短期改善癥狀，而不能阻止或延緩疾病的進(jìn)展，因此尋找能夠治療AD的有效藥物是當(dāng)前亟待解決的難點(diǎn)。

雌激素對(duì)大腦中神經(jīng)元有明確的保護(hù)作用，可對(duì)抗Aβ誘導(dǎo)的神經(jīng)退行性病變[2-4]，雌二醇可通過(guò)上調(diào)Bcl-2 mRNA的表達(dá)以及下調(diào)Bax mRNA的表達(dá)從而減少Aβ25-35對(duì)PC12細(xì)胞的神經(jīng)毒性[5]。女性進(jìn)入絕經(jīng)期后，體內(nèi)雌激素水平明顯下降，長(zhǎng)期以來(lái)臨床采用人工合成的雌激素替代治療(estrogen replacement treatment，ERT)，使患阿爾茨海默病危險(xiǎn)下降50%。然而ERT所帶來(lái)的如生殖系統(tǒng)腫瘤及乳腺癌的發(fā)生等不良反應(yīng)影響其推廣應(yīng)用。人們致力于尋求雌激素的替代物，期望這種替代物能保留雌激素的保護(hù)作用，同時(shí)避免上述的不良影響，來(lái)源于植物而且結(jié)構(gòu)類(lèi)似雌激素的植物雌激素(phytoestrogen)正是其中的重要一類(lèi)，有望成為預(yù)防和治療AD的雌激素替代物。如金雀異黃素(genistein，Gen)可通過(guò)與胞膜胞內(nèi)的雌激素受體(estrogen receptor，ER)結(jié)合從而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用，可以明顯提高Aβ31-35損傷后的皮層神經(jīng)元活性，并減少彗星細(xì)胞的數(shù)量及其拖尾長(zhǎng)度[6]。

槲皮素(quercetin，Que)屬天然黃酮類(lèi)物質(zhì)，與雌激素有著相似的化學(xué)結(jié)構(gòu)，具有雌激素樣作用。目前已有研究發(fā)現(xiàn)，槲皮素可以減少SH-SY5Y細(xì)胞中淀粉樣前體蛋白(amyloid precursor protein)的成熟，可以減少AD模型大鼠中Aβ所占的比例。課題組前期研究表明，槲皮素可通過(guò)經(jīng)典的ER途徑，影響PI3K/Akt/GSK-3β 信號(hào)通路的激活，并且對(duì)Aβ25-35誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞的損傷具有類(lèi)雌激素樣神經(jīng)保護(hù)作用[7]。本研究將從槲皮素對(duì)大鼠皮層神經(jīng)元細(xì)胞的保護(hù)作用入手，對(duì)槲皮素介導(dǎo)雌激素受體途徑影響大皮層神經(jīng)元進(jìn)行研究。同時(shí)利用ER完全拮抗劑，進(jìn)一步探索槲皮素發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用的相關(guān)途徑，并為神經(jīng)系統(tǒng)疾病藥物的開(kāi)發(fā)提供新的思路和策略，從而探索植物雌激素能夠替代雌激素作為未來(lái)參與治療AD藥物的可行性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1動(dòng)物 Sprague Dawley(SD)大鼠,許可證號(hào)：SYXK(京)2014-0037，新生24 h內(nèi)的SD大鼠(乳鼠)

1.1.2藥物與試劑 槲皮素(中國(guó)藥品生物制品檢定研究所，批號(hào)：100081-200907)、金雀異黃素(中國(guó)藥品生物制品檢定研究所，批號(hào)：111704-201302)、17β-雌二醇(abcam 公司，批號(hào)：APN11282-1-1)、ER完全拮抗劑(ICI182,780，abcam 公司，批號(hào)：APN07104-1-1)、Neurobasal-A Medium培養(yǎng)基(Gibco 公司，批號(hào)：1645623)、B-27 Supplement(50×)(Gibco 公司，批號(hào)：1674937)、DMEM/高糖培養(yǎng)基(HyClone 公司，批號(hào)：SH30284.01)、胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司，批號(hào)：20150715)、MTT(Sigma 公司，批號(hào)：MKBS4732V)、Neuronal ClassⅢ β-Tubulin (Tuj1)抗體(碧云天生物技術(shù)公司)、CyTM3-conjugated Affinipure Goat Anti-Mouse IgG(Jackson Immuno Research 公司，批號(hào)：101887)、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記羊抗鼠二抗IGG(H+L)(Novus Biologicals 公司，批號(hào)：4103945)、β-actin(Santa Cruz 公司，批號(hào)：C2014)、ERβ抗體(Novus Biologicals 公司，批號(hào)：2100-1P140905)、ERα抗體(Novus Biologicals 公司，批號(hào)：2100-1P140905)

1.1.3儀器 CO2培養(yǎng)箱(Thermo 公司)，超速冷凍離心機(jī)(Sigma公司)，熒光倒置顯微鏡(Nikon公司)，體視學(xué)顯微鏡(Leica公司)，多功能酶標(biāo)儀(Tecan公司)，化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)(ProteinSimple公司)。

1.2 方法

1.2.1大鼠皮層神經(jīng)元的原代培養(yǎng) 在低溫條件下取乳鼠的大腦皮層組織，小心剝?nèi)ツX膜及血管，剪碎成小塊，大小為1 mm3左右，加入0.125%的胰蛋白酶，加入離心管中，在37 ℃水浴10 min。用含10%胎牛血清的高糖培養(yǎng)基終止消化，離心除去上清，重復(fù)上述操作兩次。加入培養(yǎng)基吹散，通過(guò)200目篩，預(yù)先用多聚賴(lài)氨酸包被培養(yǎng)板，而后將細(xì)胞懸液移入包被完成的培養(yǎng)板中，并在37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中孵育培養(yǎng)，6 h后，將培養(yǎng)基改為Neuronbasal +B27的神經(jīng)元專(zhuān)用無(wú)血清無(wú)酚紅培養(yǎng)基，繼續(xù)在此培養(yǎng)基中培養(yǎng)。培養(yǎng)6 d后，通過(guò)免疫熒光染色法鑒定神經(jīng)元純度。將培養(yǎng)至6 d的細(xì)胞用Tuj1抗體和DAPI進(jìn)行標(biāo)記，倒置顯微鏡下觀(guān)察，鏡下可見(jiàn)所有細(xì)胞核均發(fā)出藍(lán)色熒光，而Tuj1陽(yáng)性細(xì)胞則顯示紅色熒光，將兩圖進(jìn)行重疊可計(jì)算出神經(jīng)元細(xì)胞所占的比例，將計(jì)算出的比例用作神經(jīng)元細(xì)胞的純度。

1.2.2MTT檢測(cè)槲皮素對(duì)神經(jīng)元細(xì)胞活性的影響 以合適的細(xì)胞密度在包被后的96孔板中接種皮層神經(jīng)元細(xì)胞，培養(yǎng)6 d后，按如下分組加入不同的含藥培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h，DMSO空白對(duì)照組(體積含量比不超過(guò)0.1%)、17β-E2陽(yáng)性藥對(duì)照組(0.02 μmol·L-1)、Gen陽(yáng)性藥對(duì)照組(25 μmol·L-1)、Que低劑量組(50 μmol·L-1)、Que中劑量組(100 μmol·L-1)、Que高劑量組(200 μmol·L-1)，每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔。同時(shí)完全拮抗ER的皮層神經(jīng)元細(xì)胞模型，以檢測(cè)槲皮素對(duì)完全拮抗ER的皮層神經(jīng)元細(xì)胞活性的影響，在藥物干預(yù)前每孔加入ER完全拮抗劑ICI182,780(每孔中的ICI182,780終濃度為1 μmol·L-1)，置于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中孵育2 h。孵育完成后棄去板中含拮抗劑的培養(yǎng)基，并按依次加入上述含藥培養(yǎng)基，每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，每孔加入100 μL含藥培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h和48 h。采用MTT法測(cè)定OD值并計(jì)算細(xì)胞存活率(實(shí)驗(yàn)組OD值/DMSO空白對(duì)照組OD值×100%，survival rate，SR)。

1.2.3免疫熒光檢測(cè)槲皮素對(duì)神經(jīng)元細(xì)胞形態(tài)的影響 在包被后的24孔板將皮層神經(jīng)元接種后培養(yǎng)6 d，按照以下不同的分組添加不同的含藥培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h，DMSO空白對(duì)照組(體積含量比不超過(guò)0.1%)、17β-E2陽(yáng)性藥對(duì)照組(0.02 μmol·L-1)、Gen陽(yáng)性藥對(duì)照組(25 μmol·L-1)、Que低劑量組(50 μmol·L-1)、Que中劑量組(100 μmol·L-1)、Que高劑量組(200 μmol·L-1)。培養(yǎng)24h后棄去培養(yǎng)基，加入新鮮配制的4% 多聚甲醛在室溫下固定30 min，用體積分?jǐn)?shù)為0.2%的TritonX-100在室溫下進(jìn)行透化處理20 min，使用5%的牛血清白蛋白封閉30 min，將稀釋后的Tuj1抗體加入孔板中，并在4 ℃下孵育過(guò)夜，再加入熒光二抗(CyTM3-conjugated affinipure goat anti-mouse IgG，1 ∶800 PBS稀釋)，于暗盒中在室溫條件下孵育1 h。去除移去熒光二抗，滴加完成稀釋的DAPI染色工作液(1 ∶80 PBS稀釋)，于暗盒避光對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行復(fù)染15 min。在熒光倒置顯微鏡下觀(guān)察細(xì)胞形態(tài)，并拍照采集圖像，采集的圖像使用Image-Pro Plus軟件進(jìn)行分析處理。

1.2.4Western blot檢測(cè)槲皮素對(duì)神經(jīng)元細(xì)胞ER蛋白表達(dá)的影響 將皮層神經(jīng)元細(xì)胞接種在包被后的6孔板中培養(yǎng)6 d。根據(jù)“1.2.2”中的實(shí)驗(yàn)組，添加不同含藥培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h。收集培養(yǎng)后的細(xì)胞，添加細(xì)胞裂解液，置于冰上，裂解30 min，用移液槍不斷吹打以確保細(xì)胞充分裂解，4 ℃，12 000 r·min-1離心5 min。用BCA法測(cè)定蛋白含量，裂解液調(diào)整蛋白濃度，使各不同分組的蛋白濃度一致，按4 ∶1的比例混合蛋白樣品和蛋白上樣緩沖液，在95 ℃金屬浴中10 min，以確保蛋白充分變性。確保每孔蛋白上樣量20-25 μg，使用10% SDS-PAGE凝膠進(jìn)行蛋白分離，轉(zhuǎn)膜，5 %脫脂牛奶封閉2 h后，加入一抗β-action(1 ∶500)、雌激素受體α/β一抗(1 ∶300)，4℃孵育過(guò)夜。第二天將膜用TBST洗3次，每次洗10 min。室溫孵育二抗(Goat anti-mouse IgG/HRP，1 ∶4 000)2 h。用TBST將膜清洗3次，每次清洗10 min，發(fā)光，拍照，成像，分析條帶灰度。

2 結(jié)果

2.1 原代培養(yǎng)皮層神經(jīng)元細(xì)胞純度神經(jīng)元培養(yǎng)5 d后，神經(jīng)細(xì)胞生長(zhǎng)較好，細(xì)胞突觸進(jìn)一步伸長(zhǎng)和增粗，具有雙極、多極突起，并交織成網(wǎng)絡(luò)；在培養(yǎng)7 d后，細(xì)胞體較大，周?chē)梢?jiàn)明顯光暈，細(xì)胞突觸延長(zhǎng)、增粗且分支較多，突觸間、突觸與胞體之間聯(lián)系增多，形成密集的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)；培養(yǎng)9 d后，神經(jīng)元細(xì)胞開(kāi)始退化，大量細(xì)胞體團(tuán)聚成簇，且折光性降低，突觸減少、縮短，以及胞質(zhì)內(nèi)空泡或顆粒增多；結(jié)果顯示培養(yǎng)5-8 d的細(xì)胞處于最佳狀態(tài)，可將其用于后續(xù)試驗(yàn)。用Tuj1抗體和DAPI進(jìn)行標(biāo)記后，隨機(jī)選取6個(gè)視野中Tuj1陽(yáng)性神經(jīng)元細(xì)胞的數(shù)目占總細(xì)胞的比例，顯示培養(yǎng)的細(xì)胞中神經(jīng)元純度在95%左右。

2.2 槲皮素對(duì)大鼠皮層神經(jīng)元細(xì)胞活性的影響與溶劑對(duì)照組相比，17β-E2(0.02 μmol·L-1)、Gen(25 μmol·L-1)處理細(xì)胞24 h、48 h時(shí)可以提高大鼠皮層神經(jīng)元細(xì)胞的活性，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；而與17β-E2(0.02 μmol·L-1)、Gen(25 μmol·L-1)相似，Que濃度為50 μmol·L-1、100 μmol·L-1時(shí)，在處理24 h、48 h后也可以明顯提高皮層神經(jīng)元的活性，差異有顯著性(P<0.01)，而Que(200 μmol·L-1)組僅在藥物干預(yù)24 h時(shí)才可提高皮層神經(jīng)元的細(xì)胞活性，并且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(Tab 1)。不同濃度的Que對(duì)大鼠皮層神經(jīng)元的活性有不同的影響，通過(guò)組間兩兩比較發(fā)現(xiàn)Que(50、100 μmol·L-1)處理組的大鼠皮層神經(jīng)元的細(xì)胞活性均高于Que(200 μmol·L-1)處理組(P<0.05)，而Que(50 μmol·L-1)和Que(100 μmol·L-1)兩組之間僅在藥物進(jìn)行干預(yù)48 h時(shí)才會(huì)顯示出差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(Tab 1)。使用ICI182,780拮抗劑孵育后，再使用藥物干預(yù)，發(fā)現(xiàn)孵育組與未孵育組比較，17β-E2(0.02 μmol·L-1)、Gen(25 μmol·L-1)、Que(50、100 μmol·L-1、200 μmol·L-1)，神經(jīng)元活性存在明顯差異(P<0.05)(Tab 2、3)，皮層神經(jīng)元細(xì)胞活性的影響均可被ICI182,780完全拮抗。但是溶劑對(duì)照組與使用拮抗劑的對(duì)照組相比差異無(wú)顯著性(Tab 2、3)。

Tab 1 Effect of Que on activity of cortical neurons n=6 )

Tab 2 Effect of Que treatment for 24 h on activity of antagonist estrogen receptor in cortical neurons (positive control group: 17β-estradiol) n=6)

Tab 3 Effect of Que treatment for 24 h on activity of antagonist estrogen receptor in cortical neurons (positive control group: genistein) n=6)

2.3 槲皮素對(duì)大鼠皮層神經(jīng)元細(xì)胞形態(tài)的影響與對(duì)照組相比，用17β-E2(0.02 μmol·L-1)、Gen(25 μmol·L-1)、Que(50、100 μmol·L-1)處理過(guò)的大鼠皮層神經(jīng)元細(xì)胞的突觸數(shù)目明顯增多(P<0.05)(Fig 1)，從圖片上可看出，和對(duì)照組相比，17β-E2(0.02 μmol·L-1)、Gen(25 μmol·L-1)、Que(50、100 μmol·L-1)組中神經(jīng)元細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)較好，細(xì)胞突觸明顯增粗且分支較多，并且突觸間、突觸與胞體之間聯(lián)系更加緊密；當(dāng)分別與ICI182,780共同孵育時(shí)，17β-E2(0.02 μmol·L-1)、Gen(25 μmol·L-1)、Que(50、100 μmol·L-1)對(duì)皮層神經(jīng)元突觸的促生長(zhǎng)作用減弱，突觸數(shù)量明顯減少(P<0.05)(Fig 2)，突觸明顯變細(xì)，并且突觸間的連接變少。

Fig 1 Neurite outgrowth of cortical neurons treated with E2 (0.02 μmol·L-1), Gen (25 μmol·L-1) and Que (50 μmol·L-1, 100 μmol·L-1 and 200 μmol·L-1) for 24 h

Fig 2 Neurite outgrowth of cortical neurons treated with E2 (0.02 μmol·L-1), Gen (25 μmol·L-1) and Que (50 μmol·L-1, 100 μmol·L-1 and 200 μmol·L-1) for 24 h with or without pre-incubated with ICI182,780 for 2 h

2.4 槲皮素對(duì)大鼠皮層神經(jīng)元ER表達(dá)量的影響β-actin作為內(nèi)參蛋白，與對(duì)照組相比，17β-E2(0.02 μmol·L-1)、Gen(25 μmol·L-1)、Que(50 μmol·L-1、100 μmol·L-1)處理組均能上調(diào)大鼠皮層神經(jīng)元細(xì)胞ERα蛋白水平(P<0.05)，而對(duì)ERβ蛋白表達(dá)的影響并不明顯(Fig 3)。當(dāng)用ICI182,780孵育后，與未孵育組比較，17β-E2(0.02 μmol·L-1)、Gen(25 μmol·L-1)、Que(50、100 μmol·L-1)ERα蛋白表達(dá)表達(dá)被拮抗，未見(jiàn)明顯上調(diào)(Fig 4)。

3 討論

隨著我國(guó)人口老齡化，罹患AD的老年患者日漸增多，AD的主要病理癥是多種原因?qū)е碌纳窠?jīng)元的損傷，因此對(duì)于神經(jīng)元細(xì)胞的保護(hù)就顯得非常重要。新生SD大鼠皮層神經(jīng)元細(xì)胞的原代培養(yǎng)已被作為神經(jīng)系統(tǒng)疾病的細(xì)胞模型[8]，為探索神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)病機(jī)理及藥物篩選提供了良好的平臺(tái)。大鼠皮層神經(jīng)元細(xì)胞在培養(yǎng)至d5-8時(shí)生長(zhǎng)狀態(tài)最佳；培養(yǎng)皮層神經(jīng)元細(xì)胞時(shí)使用不含酚紅的培養(yǎng)基，即培養(yǎng)基中不存在酚紅等具有雌激素樣作用的物質(zhì)，因此，可以確保培養(yǎng)5-8 d的皮質(zhì)神經(jīng)元細(xì)胞可以保存在雌激素耗竭狀態(tài)；Tuj1是一種微管蛋白，廣泛存在于細(xì)胞骨架中，其主要的功能是參與神經(jīng)元細(xì)胞類(lèi)型特異性的分化，Tuj1抗體廣泛用于鑒定神經(jīng)元細(xì)胞的標(biāo)記物[9]。原代培養(yǎng)的皮層神經(jīng)元的特異性及純度通過(guò)免疫熒光實(shí)驗(yàn)進(jìn)行檢測(cè)，其純度高達(dá)95%。

Fig 3 Protein abundances of ERα and ERβ in cortical neurons treated with E2(0.02 μmol·L-1), Gen(25 μmol·L-1) and Que (50 μmol·L-1, 100 μmol·L-1 and 200 μmol·L-1) for 24 h n=3)

Fig 4 Protein abundances of ERα in cortical neurons treated with E2 (0.02 μmol·L-1), Gen (25 μmol·L-1) and Que (50 μmol·L-1, 100 μmol·L-1 and 200 μmol·L-1) for 24 h with or without pre-incubated with

槲皮素是一種天然的黃酮類(lèi)化合物，其化學(xué)結(jié)構(gòu)和雌激素極其相似，是植物雌激素的一種，可從多種食物和植物中提取，而無(wú)明顯毒性和不良反應(yīng)。近年來(lái)研究顯示槲皮素作為一種植物雌激素同樣具有神經(jīng)元保護(hù)作用，可明顯改善神經(jīng)退行性病變動(dòng)物的記憶和行為能力[10-11]。MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示槲皮素在一定的劑量范圍內(nèi)可以提高大鼠皮層神經(jīng)元細(xì)胞的活性，初步驗(yàn)證了槲皮素的神經(jīng)元保護(hù)作用。通過(guò)觀(guān)察皮層神經(jīng)元突觸的數(shù)目，結(jié)果顯示槲皮素可以明顯促進(jìn)皮層神經(jīng)元生長(zhǎng)，增加皮層神經(jīng)元的突觸密度，并可見(jiàn)不同形態(tài)的突觸結(jié)構(gòu)，這與17β-E2, Gen的神經(jīng)元保護(hù)作用作用相類(lèi)似。目前研究發(fā)現(xiàn)植物雌激素主要通過(guò)與ERs結(jié)合發(fā)揮雌激素樣作用[12]。ICI182,780作為實(shí)驗(yàn)用ER完全拮抗劑，可以完全阻斷雌激素等具有雌激素樣作用的物質(zhì)通過(guò)ER介導(dǎo)的生物學(xué)活性，在MTT實(shí)驗(yàn)中，當(dāng)使用ICI182,780孵育后，槲皮素對(duì)大鼠皮層神經(jīng)元的保護(hù)作用明顯被抑制，同時(shí)也可抑制17β-E2，金雀異黃素的神經(jīng)元保護(hù)作用。Western blot結(jié)果顯示槲皮素可以明顯提高ERα的蛋白表達(dá)，而對(duì)于ERβ，槲皮素和對(duì)照組的蛋白表達(dá)量之間差異無(wú)顯著性；而在使用ICI182,780孵育后ERα蛋白的表達(dá)量明顯少于未孵育組。表明槲皮素具有一定的雌激素樣作用，且對(duì)皮層神經(jīng)元的保護(hù)作用可能主要是由ERα介導(dǎo)的。