李世英，汪 艷,2,3

(南方醫(yī)科大學(xué) 1.藥學(xué)院、2. 中心實驗室，3.南方醫(yī)院感染內(nèi)科暨肝病中心，廣東 廣州 510515)

非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD) 的主要特征為肝細胞脂肪變性[1-3]。細胞中的脂肪積累和處置之間的失調(diào)是導(dǎo)致肝細胞脂肪變性的主要原因[4]。線粒體丙酮酸載體(mitochondrial pyruvate carrier，MPC)于2012年被發(fā)現(xiàn)，其主要功能是將細胞質(zhì)中的丙酮酸轉(zhuǎn)運至線粒體中。丙酮酸是一種重要的代謝中間體，參與糖異生、脂質(zhì)新生、膽固醇合成以及維持三羧酸循環(huán)[5-6]。因此，MPC在糖、脂質(zhì)代謝中起著關(guān)鍵作用。研究發(fā)現(xiàn)，MPC是治療NAFLD的潛在靶點[7]。抑制MPC可以促進NAFLD患者肝臟的脂質(zhì)代謝，顯著改善患者的脂肪變性情況[8]，但是關(guān)于MPC抑制劑調(diào)控脂肪變的分子機制仍不明確。

以往文獻報道，正常小鼠敲除MPC1基因，腺苷酸激活蛋白激酶(AMP-activated protein kinase, AMPK)信號通路、脂肪酸β氧化途徑被激活?？梢? 肉毒堿棕櫚?；D(zhuǎn)移酶1A(carnitine palmitoyltransferase 1A，CPT1A)表達上調(diào)。而脂質(zhì)生成的相關(guān)基因乙酰輔酶A羧化酶(acetyl CoA carboxylase，ACC)則顯著下調(diào)[9-10]。這些文獻報道提示，MPC與AMPK-ACC通路可能存在調(diào)控作用，然而至今尚未有研究證明，這種調(diào)控作用是否與肝細胞脂肪變性有關(guān)。

棕櫚酸(palmitic acid，PA)誘導(dǎo)HepG2細胞建立體外高脂負荷模型常被用作模擬體外NAFLD模型[11]。因此我們選擇這一體外模型研究MPC活性的抑制對細胞脂質(zhì)堆積的影響及其分子機制，旨在探索抑制MPC對PA所致HepG2細胞脂肪變性以及AMPK-ACC通路進的影響，為改善NAFLD肝細胞脂肪變性提供線索。

1 材料

1.1 細胞來源HepG2 細胞(批號:xbz-030)，購自美國ATCC公司。

1.2 試劑PBS溶液(批號:C10010500BT)、0.25% 胰酶(批號:25200056)、DMEM高糖培養(yǎng)基(批號:C11995500BT)、胎牛血清(批號:10099-141)購自Gibco公司；PA(批號:P0500-10)購自Sigma 公司；MPC抑制劑UK5099(批號:56396-35-1)購自MCE 公司；CCK8檢測試劑盒(批號:C0037)、BCA蛋白濃度測定試劑盒(增強型) (批號:P0010S)購自碧云天公司；總 RNA 提取試劑盒 RNAiso Plus(批號:T9109)、RT-PCR 反應(yīng)擴增試劑盒(批號:RR047A)購自TakaRa 公司；油紅O染色試劑盒(批號:BB-44612-2)購自廣州一科生物科技有限公司；p-AMPK(批號；2535T)抗體購自CST公司；AMPK抗體(批號:ab32047)、p-ACC抗體(批號:ab68191)、ACC抗體(批號:ab45174)、SREBP1抗體(批號:ab193318)購自Abcam公司。

1.3 儀器酶標儀(美國 BIO-TEK公司)；電子分析天平(BS210S型，北京賽多利斯天平有限公司)；高速臺式離心機(MIKRO200，Hettich公司)；實時熒光定量PCR儀(7500型，ABI公司)；PCR擴增儀(ETC811，蘇州東盛興業(yè)科學(xué)儀器有限公司)；NanoDrop2000核酸超微量測定儀(GNM15140，Genom)；全自動蛋白質(zhì)定量檢測儀(Wes，美國Protein Simple)；倒置相差顯微鏡(倒置 TS100，NIKON)；明場正置顯微成像系統(tǒng)(德國Leica)。

2 方法

2.1 細胞培養(yǎng)和主要試劑配制細胞在含有10% FBS的完全培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)。等細胞長到接近90%，用0.25% 胰酶對其消化、傳代。PA配制為5 mol·L-1的母液，于-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?。將MPC抑制劑UK5099配置為0.05 mol·L-1的母液，于-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?，再根?jù)實驗需要稀釋為各濃度。

2.2 CCK8測定細胞活力為了確認不同濃度PA以及MPC抑制劑 UK5099是否會對細胞活性產(chǎn)生顯著影響，我們在實驗之前利用CCK8對HepG2細胞的活力進行檢測。將HepG2細胞鋪在96孔板中，d 2將培養(yǎng)液改換為以下培養(yǎng)基:正常對照組:高糖完全培養(yǎng)基；PA組:0、0.1、0. 5、1.0 mmol·L-1PA的完全培養(yǎng)基；MPC抑制組:0、10、20、50 μmol·L-1UK5099的完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h或者48 h。然后棄去孔板中的培養(yǎng)液，改換為含 10% CCK8 的基本培養(yǎng)基處理細胞 60 min，記錄酶標儀450 nm波長處所測得的吸光度。細胞相對存活力為各實驗組的所測得的吸光度與正常組所測的的吸光度之比。

2.3 細胞的分組將HepG2細胞使用胰酶消化后，重新種植于6孔板上。次日改為無血清的培養(yǎng)基饑餓24 h。細胞分組:換上含完全培養(yǎng)基為正常對照組，含0.5 mmol·L-1的PA的完全培養(yǎng)基作為體外高脂負荷模型組，添加了10 μmol·L-1UK5099、0.5 mmol·L-1的PA的完全培養(yǎng)基作為抑制劑組，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，收集細胞的總RNA或蛋白用于后續(xù)實驗。

2.4 Real-time PCR檢測目的基因的表達4 ℃條件下使用TRIzol技術(shù)提取總RNA，按照說明書操作方法制備cDNA。然后在ABI Prism 7500 PCR儀利用SYBR Green-BSAed Real-time PCR進行分析。檢測以下目的基因:AMPK、ACC、SREBP1、CPT1A，以GAPDH為內(nèi)參基因。以上目標基因的表達，采用2-ΔΔCT法計算相對表達量。每個基因重復(fù)測定3次。引物序列見Tab 1。

2.5 全自動蛋白質(zhì)定量檢測儀定量檢測相關(guān)蛋白表達于4 ℃條件下使用含PMSF抑制劑的RIPA試液提取總蛋白，根據(jù)BCA試劑盒檢測其濃度，并調(diào)整樣品最終上樣濃度為1 g·L-1。于全自動蛋白質(zhì)檢測儀定量測定AMPK、p-AMPK、ACC、p-ACC、SREBP1蛋白的表達水平，以GAPDH為內(nèi)參蛋白。運用全自動蛋白質(zhì)定量檢測儀配套軟件Compass for SW軟件對靶蛋白的條帶密度值進行統(tǒng)計分析。

2.6 油紅O染色觀察脂質(zhì)堆積用一次性吸管去除各孔原培養(yǎng)液，用適量PBS清洗后加入濃度為4% 的中性甲醛，暗處處置15 min；用蒸餾水洗去固定液；然后加入油紅O工作液，密封處理后，在37 ℃避光靜置30 min；棄去工作液，蒸餾水沖洗；利用顯微鏡進行觀察，鏡下顯示脂滴陽性結(jié)果為胞質(zhì)呈橘紅色。油紅O染色定量方法:棄去6孔板中的PBS，將6孔板置于干燥通風(fēng)處，使每孔中的水分揮干。用異丙醇對溶解在脂滴中的油紅O進行萃取，即每孔加入200 μL異丙醇，密封，置于37 ℃搖床20 min，將提取液轉(zhuǎn)移至96孔板中，200 μL異丙醇作為調(diào)零孔，于酶標儀490 nm處檢測各組的OD值。

Tab 1 Sequence primer of selected genes

3 結(jié)果

3.1 不同濃度PA、MPC抑制劑UK5099對HepG2細胞活力的影響用CCK-8法檢測不同濃度PA、UK5099對HepG2細胞活力影響，結(jié)果如Fig 1A所示，0、0.1、0.5 mmol·L-1PA處理24、48 h對細胞活力均無影響；1、2 mmol·L-1PA抑制了HepG2細胞活性。如Fig 1B所示，10 μmol·L-1UK5099處理48 h對細胞活力無影響，20、50 μmol·L-1UK5099處理24 h抑制HepG2細胞活力。本實驗為了排除UK5099對PA所致肝細胞脂肪變和AMPK-ACC通路的影響是由于抑制HepG2細胞活力引起的，我們最終選擇對HepG2細胞活性影響不大的濃度，即0.5 mmol·L-1PA以及10 μmol·L-1UK5099處理48 h為后續(xù)實驗濃度以及時間點。

3.2 抑制MPC可以改善PA所致HepG2細胞脂質(zhì)堆積的情況結(jié)果如Fig 2顯示， 0.5 mmol·L-1PA處理48 h， HepG2細胞胞質(zhì)內(nèi)油滴數(shù)量大小及含脂滴細胞數(shù)量明顯增加(P<0.01)，呈環(huán)狀聚集于胞質(zhì)內(nèi)；0.5 mmol·L-1PA添加10 μmol·L-1UK5099 處理48 h，胞質(zhì)內(nèi)脂滴數(shù)量、大小及含脂滴細胞數(shù)量明顯減少(P<0.01)。可見，MPC抑制劑UK5099可以改善PA所致HepG2細胞胞質(zhì)內(nèi)脂質(zhì)堆積情況。

3.3 體外抑制MPC通過激活A(yù)MPK-ACC通路改善脂質(zhì)堆積情況RT-PCR結(jié)果如Fig 3顯示，0.5 mmol·L-1PA處理HepG2細胞48 h，可以提高ACC、SREBP1 mRNA的表達水平(P<0.01)，并降低AMPK(P<0.01)、CPT1A (P<0.05)mRNA的表達水平；與0.5 mmol·L-1PA組相比，0.5 mmol·L-1PA添加10 μmol·L-1UK5099 處理48 h，可以降低ACC、SREBP1 mRNA的表達水平(P<0.01)， 并提高AMPK、CPT1A mRNA的表達水平(P<0.01)。

全自動蛋白分析實驗結(jié)果如Fig 4所示，0.5 mmol·L-1PA處理HepG2細胞48 h，可以降低細胞的p-AMPK 、p-ACC蛋白表達水平(P<0.01)，并且提高AMPK(P<0.05)、ACC(P<0.01)、SREBP1(P<0.01)蛋白表達水平；與0.5 mmol·L-1PA組相比，0.5 mmol·L-1PA添加10 μmol·L-1UK5099 處理48 h，細胞的p-AMPK、p-ACC蛋白表達水平均明顯升高(P<0.01)，ACC、SREBP1蛋白表達水平均降低(P<0.01)，AMPK蛋白表達水平無顯著變化。

4 討論

肝細胞脂肪變性是NAFLD的主要特征，因此探索肝細胞脂肪變性的分子機制對該疾病的診治尤為重要。在本實驗，為了排除高濃度的PA或MPC抑制劑UK5099對HepG2細胞的毒性作用，干擾UK5099改善PA誘導(dǎo)的肝細胞脂肪變性，是由于UK5099對HepG2細胞的毒性作用，還是UK5099通過激活A(yù)MPK-ACC通路所導(dǎo)致的，因此我們首先利用CCK-8實驗，選出對HepG2細胞的毒性作用較小的低濃度PA(0.5 mmol·L-1)、低濃度UK5099(10 μmol·L-1)進行后續(xù)分子機制相關(guān)實驗。實驗結(jié)果表明，低濃度UK5099可以明顯改善PA所致HepG2細胞脂肪變性。

Fig 1 Cell viability of HepG2 cells treated with different concentrations of (A) PA or (B) UK5099 n=6)

Fig 2 Intracellular lipid accumulation in HepG2 cells treated with PA and UK5099 (scale bar 50 μm) n=6)

Fig 3 Effect of UK5099 treatment on relative mRNA levels of AMPK-ACC pathways in HepG2 cells treated with n=6)

Fig 4 Effect of UK5099 treatment on protein levels of AMPK, p-AMPK, ACC, p-ACC, SREBP1 in HepG2 cells treated with n=3)

AMPK-ACC通路在體內(nèi)脂質(zhì)代謝中具有關(guān)鍵調(diào)控作用[12]。ACC可以控制丙二酰輔酶A的生成，進而參與脂質(zhì)新生，并且能下調(diào)CPTIA，抑制脂肪酸氧化[13]。AMPK在調(diào)控ACC活性中具有關(guān)鍵作用[14-16]，AMPK通過磷酸化激活后，進一步磷酸化ACC，使后者失去活性，進而抑制脂質(zhì)新生，并上調(diào)CPT1A的活性，從而促進肝細胞脂質(zhì)分解[17]。我們選用PA誘導(dǎo) HepG2細胞建立體外高脂負荷模型，添加MPC抑制劑UK5099加以干預(yù)，探究MPC在肝細胞脂肪變性中的作用。本研究通過油紅O染色實驗、RT-PCR以及全自動蛋白質(zhì)量分析實驗首次發(fā)現(xiàn)，0.5 mmol·L-1PA誘導(dǎo)HepG2細胞48 h后，胞質(zhì)內(nèi)油脂堆積水平明顯提高，p-AMPK、p-ACC蛋白表達水平明顯降低，SREBP1蛋白表達水平則明顯升高。進一步的抑制MPC，則可逆轉(zhuǎn)櫚酸所致HepG2細胞脂質(zhì)堆積情況，同時能夠提高p-AMPK、p-ACC蛋白表達水平，降低脂質(zhì)合成關(guān)鍵因子SREBP1蛋白表達水平，并提高脂肪酸β氧化關(guān)鍵基因CPT1A mRNA的表達水平。說明MPC抑制劑可以激活A(yù)MPK-ACC通路，改善肝細胞脂肪變性情況。

綜上可知，體外抑制MPC可以通過激活A(yù)MPK-ACC通路，改善細胞脂質(zhì)堆積情況。本實驗初步闡明了MPC與脂質(zhì)代謝機制，為后續(xù)治療NAFLD肝細胞脂肪變性提供科學(xué)依據(jù)。由于時間限制，抑制MPC活性對脂質(zhì)堆積的影響的功能研究中，僅從降低其活性單方面驗證了這一現(xiàn)象，尚未進行增強表達 MPC對脂質(zhì)代謝的影響。今后的研究中將利用細胞轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)基因小鼠等進一步完善這部分內(nèi)容，此外，MPC是否可以調(diào)控其他脂質(zhì)代謝相關(guān)通路有待進一步探索。