魏亞男，朱博冉，姬夢姣，周 童，翟 意，薛文達(dá)，陶偉偉，陳 剛，王 薇，吳顥昕

(1.南京中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院,中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院中醫(yī)腦病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京 210023；2.暨南大學(xué)中醫(yī)學(xué)院腦病個(gè)性化防治跨學(xué)科研究所，廣州 510632；3. 南京中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)院整合醫(yī)學(xué)院，南京 210023)

動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是一種慢性動(dòng)脈壁疾病，涉及泡沫細(xì)胞的產(chǎn)生，細(xì)胞外脂質(zhì)的積累，斑塊的形成以及最終斑塊的破裂[1]。當(dāng)今，動(dòng)脈粥樣硬化性心血管疾病是主要的死亡原因[2]?；谒☆愃幬锏囊幌盗胁涣挤磻?yīng)[3]，開發(fā)更有效的治療策略以改善AS患者的根治性治療并減少副作用的發(fā)生意義重大。補(bǔ)陽還五湯出自清代名醫(yī)張錫純的《醫(yī)林改錯(cuò)》，由黃芪、川芎、當(dāng)歸、赤芍、桃仁、紅花、地龍等7味中藥組成,是補(bǔ)氣活血的代表方劑?，F(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)補(bǔ)陽還五湯具有抑制炎癥反應(yīng),降低血脂,穩(wěn)定動(dòng)脈斑塊的作用[4]。董捷鳴等建立了補(bǔ)陽還五湯HPLC指紋圖譜,標(biāo)記了23個(gè)共有峰[5]，初步探索了該配方的生物活性成分。但對于多成分多靶點(diǎn)的補(bǔ)陽還五湯在防治AS的復(fù)雜機(jī)制方面研究并沒有結(jié)束。

隨著計(jì)算機(jī)技術(shù)與數(shù)據(jù)庫技術(shù)的不斷成熟，中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析平臺以中醫(yī)藥大數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)，通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)構(gòu)建的各種復(fù)雜成分的分子網(wǎng)絡(luò)以及基于多級靶標(biāo)的蛋白質(zhì)和基因相互作用，可以闡釋其物質(zhì)基礎(chǔ)和功能[6]。中醫(yī)方劑的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析正成為研究由高脂血癥和AS等復(fù)雜多樣的因素表現(xiàn)出來的疾病的一種重要研究方法。利用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析平臺探究補(bǔ)陽還五湯治療AS的作用機(jī)制,首先有利于解決物質(zhì)基礎(chǔ)篩選時(shí)造成的高昂的成本及長周期的問題,其次也有助于解決探尋補(bǔ)陽還五湯防治機(jī)制時(shí)出現(xiàn)的單靶作用局限性問題。

1 材料

1.1 補(bǔ)陽還五湯的化學(xué)成分來源補(bǔ)陽還五湯各中藥的化學(xué)成分收集自中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析平臺數(shù)據(jù)庫(TCMSP，http://ibts.hkbu.edu.hk/LSP/tcmsp.php)，TCMSP收錄了大量中草藥數(shù)據(jù)，對每種藥物的成分、分子名稱、分子量、人類口服生物利用度(OB)、類藥性(DL)、半衰期和血腦屏障等進(jìn)行了描述。由于目前TCMSP數(shù)據(jù)庫中暫未收錄地龍的成分，因此我們從TCMID (http://bidd.nus.edu.sg/group/tcmsite/query.aspx)數(shù)據(jù)庫收集地龍的化學(xué)成分。設(shè)定OB≥30% 和 DL≥0.18，篩選出符合條件的化合物進(jìn)行分析。但由于這種篩選剔除了很多不符合條件的但卻有廣泛藥理學(xué)作用的化合物，如黃芪甲苷、阿魏酸、紅花黃色素等。為了提高預(yù)測結(jié)果可信度，進(jìn)一步通過相關(guān)文獻(xiàn)收集補(bǔ)陽還五湯的化學(xué)成分。并利用 Pub Chem 數(shù)據(jù)庫(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)確證其分子結(jié)構(gòu)及名稱，保存其sdf 格式，建立補(bǔ)陽還五湯的化合物數(shù)據(jù)庫。

1.2 化合物靶點(diǎn)的篩選通過中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析平臺(TCMSP)，基于 Drug Bank 數(shù)據(jù)庫，利用化學(xué)信息學(xué)對補(bǔ)陽還五湯所含藥物靶標(biāo)進(jìn)行預(yù)測。檢索補(bǔ)陽還五湯相關(guān)化合物，化合物對應(yīng)的靶標(biāo)，從而實(shí)現(xiàn)對補(bǔ)陽還五湯靶標(biāo)信息的檢索。經(jīng)藥典和文獻(xiàn)查找TCMSP中未找到對應(yīng)靶標(biāo)的化合物，利用Pharm Mapper數(shù)據(jù)庫進(jìn)行預(yù)測。Pharm Mapper數(shù)據(jù)庫(http://lilab.ecust.edu.cn/pharmmapper/index.php)是一種獨(dú)特的生物信息學(xué)和化學(xué)信息資源相結(jié)合的藥物靶標(biāo)信息數(shù)據(jù)庫，反向整合靶點(diǎn)和化合物。上傳化學(xué)成分的sdf 格式至 Pharm Mapper 服務(wù)器平臺，選擇人類數(shù)據(jù)庫，設(shè)置最終返回300個(gè)靶點(diǎn)，獲得化合物預(yù)測靶點(diǎn)。通過UniProt數(shù)據(jù)庫(https://www.uniprot.org/)檢索藥物對應(yīng)的靶標(biāo)，實(shí)現(xiàn)對補(bǔ)陽還五湯靶標(biāo)信息，包括Uniprot 蛋白數(shù)據(jù)庫身份標(biāo)識號(UniProt ID)，基因名稱(Gene Name) 的確認(rèn)，從而進(jìn)行相關(guān)信息的進(jìn)一步預(yù)測分析。

1.3 動(dòng)脈粥樣硬化靶標(biāo)預(yù)測利用人類表型本體數(shù)據(jù)庫 (HPO，https://hpo.jax.org/app/)檢索AS相關(guān)靶標(biāo)信息，包括Uniprot 蛋白數(shù)據(jù)庫身份標(biāo)識號(UniProt ID)，基因名稱(Gene Name)。

1.4 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建和分析上傳補(bǔ)陽還五湯與AS相關(guān)靶點(diǎn)至 STRING(https://string-db.org/)，篩選大于0.9的最高置信度的靶點(diǎn)信息。通過Cytoscape 3.6.1構(gòu)建補(bǔ)陽還五湯靶點(diǎn)與AS基因靶點(diǎn)之間的互作網(wǎng)絡(luò)。以“節(jié)點(diǎn)連接度(degree)”、“節(jié)點(diǎn)緊密度 (closeness) ”和“節(jié)點(diǎn)介度(betweenness) ”的中位數(shù)為卡值，選取同時(shí)符合 3個(gè)卡值的節(jié)點(diǎn)作為補(bǔ)陽還五湯防治AS網(wǎng)絡(luò)的核心靶點(diǎn)。并使用插件MCODE對核心靶點(diǎn)互作網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行聚類分析，以degree cutoff=2，node score utoff=0.2，K-score=5，max deapth=100為篩選標(biāo)準(zhǔn)。

1.5 挖掘基因功能以及相關(guān)通路整合上述相關(guān)數(shù)據(jù)庫得到靶標(biāo)基因，運(yùn)用注釋、可視化和集成發(fā)現(xiàn)數(shù)據(jù)庫6.8(DAVID，https：//david.ncifcrf.gov/)在線工具，針對補(bǔ)陽還五湯治療AS的核心靶標(biāo)進(jìn)行KEGG通路以及GO生物過程、細(xì)胞組成、和分子功能富集分析。以FDR<0.05作為篩選標(biāo)準(zhǔn)，得到補(bǔ)陽還五湯治療AS的關(guān)鍵作用信號通路,并構(gòu)建“補(bǔ)陽還五湯-中藥-化學(xué)成分-核心靶點(diǎn)-關(guān)鍵通路”的可視化網(wǎng)絡(luò)。

2 結(jié)果

2.1 補(bǔ)陽還五湯中所含藥物的成分組成基本信息及藥物間共有靶標(biāo)分析利用 TCMSP，以及通過相關(guān)文獻(xiàn)搜索，得到補(bǔ)陽還五湯所含中藥基本信息(Tab 1) 。

Tab 1 Information of ingredients in Buyang Huanwu decoction and their putative targets

通過TCMSP以及相關(guān)文獻(xiàn)搜索，得到補(bǔ)陽還五湯中各單味藥化學(xué)成分共計(jì)140 個(gè)，預(yù)測靶標(biāo)174個(gè)，并對其中的共有靶標(biāo)進(jìn)行分析(Tab 2) 。其中黃芪與赤芍、黃芪與紅花的共有靶標(biāo)分別為 93、97個(gè)，紅花與赤芍、紅花與川芎的共有靶標(biāo)分別為99、95個(gè)，協(xié)作關(guān)系最密切，可能是治療AS的重要藥對。

Tab 2 Common targets between every two herbs in Buyang Huanwu decoction

2.2 補(bǔ)陽還五湯化學(xué)成分靶標(biāo)預(yù)測與分析通過 Cytoscape 3.6.1挖掘補(bǔ)陽還五湯 7種藥物靶標(biāo)與AS基因靶標(biāo)之間的相互作用。根據(jù) degree 值(Tab 3) 僅顯示前10個(gè)靶點(diǎn)，推測補(bǔ)陽還五湯可能是通過調(diào)節(jié)MAPK1、PIK3R1、SRC、AKT1、APP、HRAS、JUN、TP53、EGF、RELA等關(guān)鍵基因來調(diào)節(jié)AS的發(fā)生與發(fā)展。

2.3 核心靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)通過Cytoscape 3.6.1對補(bǔ)陽還五湯調(diào)節(jié)AS的候選靶點(diǎn)建立互作網(wǎng)絡(luò)，如Fig 1所示。根據(jù) degree 值僅顯示前 100 個(gè)靶點(diǎn)，圖中節(jié)點(diǎn)的大小與degree值成正比關(guān)系。

Tab 3 Interaction between Buyang Huanwu decoction targets and atherosclerosis gene target

Fig 1 Core node interactional network between putative drug targets of Buyang Huanwu decoction and atherosclerosis targets

2.4 補(bǔ)陽還五湯防治AS關(guān)鍵靶標(biāo)GO 和 KEGG 通路富集分析通過GO富集分析后發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)陽還五湯的藥物化學(xué)成分對應(yīng)關(guān)鍵靶點(diǎn)參與了凋亡過程的負(fù)調(diào)控、RNA聚合酶Ⅱ啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控、以DNA為模板的轉(zhuǎn)錄、肽基絲氨酸磷酸化、肽基酪氨酸自磷酸化、膽固醇穩(wěn)態(tài)、血管生成、對毒品的反應(yīng)、細(xì)胞增殖調(diào)控、內(nèi)皮細(xì)胞凋亡過程的負(fù)調(diào)控等生物過程和基因功能，對AS進(jìn)行調(diào)節(jié)，其中FDR值較小的 20位，見Fig 2。

應(yīng)用插件MCODE進(jìn)行基因的聚類分析后發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)陽還五湯的藥物化學(xué)成分對應(yīng)關(guān)鍵靶點(diǎn)參與脂質(zhì)代謝、細(xì)胞凋亡等生物過程，對AS進(jìn)行調(diào)節(jié)。對score>5的基因簇進(jìn)行打分并排序，關(guān)鍵的靶點(diǎn)聚成3類,如Fig 3所示。

利用DAVID 6.8對各基因簇進(jìn)行注釋，篩選FDR<0.05的GO條目，其中基因簇1中相關(guān)基因主要參與脂質(zhì)代謝相關(guān)的細(xì)胞組成與生物功能，基因簇3中相關(guān)基因與細(xì)胞凋亡的調(diào)控密切相關(guān)，而基因簇2中生物過程不滿足篩選標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)果見Tab 4。

Fig 3 Interaction module of modified Buyang Huanwu decoction combined with epimedium-AS-gene based on MCODE

Tab 4 Clustering analysis results of Buyang Huanwu decoction Network Nodes

KEGG 富集分析結(jié)果顯示核心靶點(diǎn)與癌癥、乙型肝炎、癌癥中的蛋白聚糖通路以及炎癥、免疫相關(guān)的T 細(xì)胞受體信號通路、PI3K-Akt 通路和FoxO信號通路密切相關(guān)。其中 FDR值較小的20位見Fig 4。

3 討論

3.1 補(bǔ)陽還五湯藥物成分分析補(bǔ)陽還五湯具有多成分、多靶點(diǎn)、調(diào)節(jié)方式多樣的特點(diǎn)，在多味藥作用疊加的基礎(chǔ)上，補(bǔ)陽還五湯還會(huì)產(chǎn)生復(fù)雜的協(xié)同效應(yīng)。黃芪、川芎、赤芍、紅花等均為臨床治療AS使用頻率較高的中藥。紅花與黃芪，紅花與赤芍相互關(guān)聯(lián)的成分最多。查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，芍藥中的芍藥苷通過上調(diào)SIRT1增強(qiáng)自噬而減弱了ox-LDL誘導(dǎo)的凋亡和粘附分子表達(dá)[7]；黃芪和紅花中的槲皮素可以抑制ox-LDL誘導(dǎo)的泡沫細(xì)胞形成并延緩衰老[8]；山奈酚通過抑制TLR4 /NF-κB信號通路減輕ox-LDL誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞凋亡[9]?？梢酝茰y在防治AS方面紅花和黃芪，紅花和赤芍配伍可能具有一定的協(xié)同作用。

Fig 4 KEGG terms of candidate targets of Buyang Huanwu decoction against atherosclerosis

3.2 基因功能與相關(guān)通路分析KEGG通路分析表明癌癥，乙型肝炎以及眾多免疫和炎癥通路可能是網(wǎng)絡(luò)中重要的信號通路。癌癥的研究是近些年來研究的熱點(diǎn)，炎癥、細(xì)胞增殖失調(diào)、氧化應(yīng)激等條件易于發(fā)生AS，且利于不同類型的癌癥的形成，用于治療AS的他汀類藥物差異性的調(diào)節(jié)單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞細(xì)胞因子可以用于癌癥治療[10]。核心靶點(diǎn)TP53、SRC、HRAS等腫瘤相關(guān)基因與乳腺癌、甲狀腺癌、直腸癌密切相關(guān)[11]，這提示補(bǔ)陽還五湯的應(yīng)用可能對癌癥的防治具有重要意義。對LDL具有反應(yīng)性的T細(xì)胞可以引發(fā)體液免疫反應(yīng)，通過調(diào)節(jié)T 細(xì)胞受體信號通路可以降低血漿膽固醇和減少病變形成的抗動(dòng)脈粥樣硬化免疫反應(yīng)[12]。

補(bǔ)陽還五湯的網(wǎng)絡(luò)藥理分析了7種草藥，140種化合物和690種靶基因，并預(yù)測了174個(gè)核心靶基因和AS有關(guān)的主要通路和生物過程。MAPK1、PIK3R1、SRC、AKT1、APP、HRAS、JUN、TP53、EGF、RELA是網(wǎng)絡(luò)中的主要靶基因。通過對補(bǔ)陽還五湯靶點(diǎn)互作網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行聚類分析得出了3個(gè)顯著性較強(qiáng)的基因簇。其中基因簇2中的生物過程FDR值>0.05，顯著性最強(qiáng)的基因簇1包含了APP、VEGFA、APOA2、APOA1、APOB、APOE、APOA5、MAPK1等與脂質(zhì)代謝相關(guān)的39個(gè)基因。在AS患者中，脂質(zhì)代謝與多種生物過程和細(xì)胞組成相關(guān)，如膽固醇穩(wěn)態(tài)，膽固醇外排，以及細(xì)胞外空間、乳糜微粒、超低密度脂蛋白顆粒等。APOA2、APOB、APOA1、APOE、APOA5是載脂蛋白家族重要成員，調(diào)控膽固醇的轉(zhuǎn)運(yùn)。當(dāng)巨噬細(xì)胞在與低密度脂蛋白孵育期間積累大量膽固醇時(shí)，巨噬細(xì)胞不僅會(huì)在脂質(zhì)小滴中儲(chǔ)存過多的膽固醇，還會(huì)將過量的未酯化膽固醇沉積到巨噬細(xì)胞周圍和下面的細(xì)胞外基質(zhì)中[13]。MAPK1即ERK2，實(shí)驗(yàn)研究表明下調(diào)ERK1 / 2過表達(dá)可以抑制巨噬細(xì)胞/泡沫細(xì)胞的形成，并激活膽固醇逆向轉(zhuǎn)運(yùn)[14]；NF-κB家族的重要成員RELA即p65，已有研究發(fā)現(xiàn)補(bǔ)陽還五湯可能與抑制TLR4炎癥通路包括NF-κB在內(nèi)的主要元件有關(guān)[15]。最近的研究發(fā)現(xiàn)在低氧環(huán)境中，巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)MAP激酶ERK1/2，參與激活NF-κB亞基p65，并通過誘導(dǎo)ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白A1和載脂蛋白A1基因促進(jìn)膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn)[16]。因此，我們推測補(bǔ)陽還五湯可以通過調(diào)節(jié)膽固醇代謝促進(jìn)AS的治愈。基因簇3中基因參與對細(xì)胞凋亡的調(diào)控，細(xì)胞凋亡是對死亡信號的響應(yīng)。研究表明補(bǔ)陽還五湯可能通過CDK5信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，下調(diào)caspase-3，Bax / Bcl-2抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡[17]。調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡是補(bǔ)陽還五湯防治AS的重要途徑，TP53(p53)是一種轉(zhuǎn)錄因子，參與外在的凋亡途徑，或通過內(nèi)在的線粒體途徑調(diào)控凋亡小體的形成，進(jìn)而促進(jìn)胱天蛋白酶介導(dǎo)的凋亡[18]，補(bǔ)陽還五湯可能參與調(diào)控p53抗AS。

Fig 5 Multi-level network of Buyang Huanwu decoction, Chinese herbs, ingredients, critical targets and pathways

從多層次網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖(Fig 5)可以看出補(bǔ)陽還五湯多成分、多靶點(diǎn)、整體協(xié)同的抗AS作用。網(wǎng)絡(luò)藥理分析對進(jìn)一步闡明其防治AS的物質(zhì)基礎(chǔ)，深入挖掘和開發(fā)經(jīng)典名方補(bǔ)陽還五湯有重要意義。但本研究也存在一些缺陷，在利用TCMSP時(shí)無法考慮到方藥組成用量、煎煮方藥時(shí)可能發(fā)生的化學(xué)反應(yīng)、藥物體內(nèi)代謝過程、而且不能預(yù)測尚未發(fā)現(xiàn)的抗AS機(jī)制、以及平臺數(shù)據(jù)庫的條件局限性問題。