劉理靜,錢(qián) 紅,王 樂(lè),胡 柯, 賀兼斌, 田玉梅

(1. 湖南醫(yī)藥學(xué)院護(hù)理學(xué)院，湖南 懷化 418000；2. 長(zhǎng)沙民政職業(yè)技術(shù)學(xué)院醫(yī)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410004；3. 湖南醫(yī)藥學(xué)院醫(yī)學(xué)院，4. 湖南醫(yī)藥學(xué)院侗醫(yī)藥研究湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，5. 懷化市第一人民醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，湖南 懷化 418000)

肺纖維化是一種難治性、致死性疾病，以Ⅰ型膠原(collagen type Ⅰ，Col Ⅰ)和Ⅲ型膠原(collagen type Ⅲ，Col Ⅲ)等細(xì)胞外基質(zhì)成分在肺間質(zhì)過(guò)度蓄積為特征[1-2]，因此，積極尋找調(diào)控Col Ⅰ、Col Ⅲ合成與分解代謝平衡的機(jī)制對(duì)于肺纖維化的防治具有重要價(jià)值。Ⅰ型血小板結(jié)合蛋白基序的解聚蛋白樣金屬蛋白酶-1(a disintegrin-like and metalloproteinase with thrombospondin type 1 motif，ADAMTS-1)是降解Col Ⅰ和Col Ⅲ最重要的酶，有較強(qiáng)的抗肺纖維化作用[3-4]。本課題組前期研究表明，miR-21通過(guò)靶向沉默ADAMTS-1，促進(jìn)肺成纖維細(xì)胞Col Ⅰ和Col Ⅲ合成，從而加重大鼠肺纖維化病變[4-5]。長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long non-coding RNAs，lncRNAs)是一類(lèi)非編碼 RNA分子，長(zhǎng)度超過(guò)200 個(gè)核苷酸，不具有蛋白編碼功能。近年研究發(fā)現(xiàn)，lncRNAs能夠作為競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源 RNA(competitive endogenous RNA，ceRNA)吸附miRNAs，上調(diào)miRNAs的靶基因表達(dá)，發(fā)揮生物學(xué)功能[6-7]。生長(zhǎng)阻滯特異性轉(zhuǎn)錄本5(growth arrest-specific transcript 5，GAS5)是一種全長(zhǎng)為630個(gè)核苷酸的lncRNA，與肝、腎纖維化相關(guān)[8-9]，但在肺纖維化中的作用有待闡明。我們前期通過(guò)生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，GAS5與ADAMTS-1分享一個(gè)相同的miR-21 結(jié)合位點(diǎn)，表明3種RNA之間可能存在ceRNA調(diào)控模式。為此，本研究通過(guò)建立SD大鼠肺纖維化模型，探討GAS5對(duì)肺纖維化的影響及miR-21/ADAMTS-1途徑在其中的作用，旨在為這種難治性疾病的防治提供新靶點(diǎn)和理論與實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑人胚胎腎細(xì)胞(HEK)293T細(xì)胞株購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)；美國(guó)Gibco公司提供胎牛血清(10099141)和DMEM高糖培養(yǎng)基(11965084)；pGL3載體(E1751)、脂質(zhì)體3000轉(zhuǎn)染試劑(lipofectamineTM3000，L3000015)分別購(gòu)自美國(guó)Promega公司、Invitrogen公司；雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒(RG027)、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(P0012)為上海碧云天生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；雄性3-4月齡無(wú)特定病原體級(jí)健康SD大鼠30只，體質(zhì)量(220.0±7.2)g，購(gòu)于長(zhǎng)沙市天勤生物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)：SCXK(湘)2014-0011；博萊霉素A5(批號(hào)：180901)購(gòu)自天津太河制藥有限公司；GAS5過(guò)表達(dá)慢病毒載體(LV-GAS5)購(gòu)于上海閃晶分子生物科技有限公司；廣州銳博公司提供miR-21激動(dòng)劑(agomir)、miR-21 模擬物(mimic)及模擬物陰性對(duì)照物(Mimic-NC)；Ⅰ型前膠原羧基端前肽(procollagen type I carboxyterminal propeptide，PICP，ER0322)和Ⅲ 型前膠原氨基端前肽(procollagen type Ⅲ aminoterminal propeptide，PⅢNP，ER1221)的酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)檢測(cè)試劑盒為武漢菲恩生物科技有限公司產(chǎn)品；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(A5001)、SYBR? Green Real Time PCR Master Mix(QPK-201)、RIPA 裂解液(R0010)分別由美國(guó)Promega公司、日本 Toyobo公司、北京索萊寶科技有限公司提供；PVDF膜(T2234)和TRIzol試劑(15596026)為美國(guó)Invitrogen公司產(chǎn)品；兔抗大鼠ADAMTS-1(ab39194)、Col Ⅰ(ab34710)、Col Ⅲ(ab7778)、β-actin(ab8227)和辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG(ab205718)購(gòu)于英國(guó)Abcam公司。

1.2 儀器細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司)；臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(德國(guó)Sigma公司)；輪轉(zhuǎn)式石蠟切片機(jī)(德國(guó)徠卡公司)；680型酶標(biāo)儀(美國(guó)Bio-Rad公司)；LightCycler 480實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(美國(guó)Roche公司)；電泳儀和轉(zhuǎn)膜儀(美國(guó)Bio-Rad公司)；化學(xué)發(fā)光凝膠成像分析儀(美國(guó)UVP公司)。

1.3 生物信息學(xué)預(yù)測(cè)利用Targetscan(http://www.targetscan. org/)、lnCeDB(http://gyanxet-beta.com/ lncedb/)、 PicTar(http://www.pictar.org/)等在線軟件預(yù)測(cè)GAS5、miR-21、ADAMTS-1 3′-非翻譯區(qū)(3′-untranslated region, 3′-UTR)之間的靶向結(jié)合情況。

1.4 熒光素酶活性檢測(cè)HEK293T細(xì)胞用含100 g·L-1胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)液，于37 ℃，50 g·L-1CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)、傳代，實(shí)驗(yàn)用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞。查找GAS5基因序列并通過(guò)PCR進(jìn)行擴(kuò)增，將擴(kuò)增產(chǎn)物插入熒光素酶報(bào)告載體pGL3，構(gòu)建野生型GAS5載體(GAS5-WT)，同時(shí)對(duì)GAS5序列中與miR-21結(jié)合的位點(diǎn)進(jìn)行CTGGA到CCTTA的點(diǎn)突變，構(gòu)建突變載體(GAS5-Mut)，按照操作說(shuō)明使用lipofectamineTM3000，將以上質(zhì)粒與miR-21 mimic或Mimic-NC共轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞48 h，利用雙熒光素酶報(bào)告基因試劑盒檢測(cè)各組細(xì)胞熒光素酶活性。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5 大鼠肺纖維化模型的制備與處理♂健康SD大鼠30只，于無(wú)特定病原體環(huán)境中適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，按隨機(jī)數(shù)字表法將其分為3組：對(duì)照組、LV-GAS5組和LV-GAS5+miR-21 agomir組，每組包含10只動(dòng)物。然后按照課題組前期報(bào)道的方法建模[5]，即利用3 mL·kg-1的100 g·L-1水合氯醛向大鼠腹腔內(nèi)注射，充分麻醉大鼠后切開(kāi)頸正中位置，使氣管暴露，再將溶解了博萊霉素A5(5 mg·kg-1)的生理鹽水0.2 mL一次性向氣管內(nèi)注入，然后迅速直立并旋轉(zhuǎn)大鼠，以使藥液均勻地分布于肺內(nèi)，構(gòu)建大鼠肺纖維化模型。給藥后次日(d 1)，LV-GAS5組大鼠尾靜脈注射0.2 mL含有1×1014TU·L-1的GAS5過(guò)表達(dá)慢病毒載體，LV-GAS5+miR-21 agomir組大鼠予相同體積的GAS5過(guò)表達(dá)慢病毒載體(1×1014TU·L-1)和miR-21 agomir(10 mg·kg-1)，而對(duì)照組大鼠尾靜脈注射0.2 mL的PBS，每2周注射1次，共2次。 d 28，麻醉大鼠后開(kāi)胸，采集3 mL血液，以3 000 r·min-1離心10 min(離心半徑15 cm)，提取上層血清，置入-20 ℃冰箱保存，用于檢測(cè)PICP和PⅢNP濃度。然后，處死大鼠，截取右肺組織，-70 ℃凍存，以備熒光實(shí)時(shí)定量PCR(quantitative real-time PCR，qRT-PCR)和Western blot檢測(cè)；再用0.1 mol·L-1中性緩和福爾馬林經(jīng)主支氣管注入左肺內(nèi)，充分展開(kāi)胸膜后，投入0.1 mol·L-1中性福爾馬林中固定1 d以上，再石蠟包埋后，5 μm厚度切片，病理組織學(xué)檢查。

1.6 肺組織病理學(xué)檢查將左肺石蠟切片行HE染色和Masson 染色，在光鏡下利用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件觀察肺組織病理學(xué)改變。評(píng)定方法參照文獻(xiàn)[3,10]，肺組織肺泡炎癥程度評(píng)定使用HE染色：無(wú)肺組織炎，評(píng)為0分；肺組織炎的面積<20%，評(píng)為1分；肺組織炎的面積20%-50%，評(píng)為2分；肺組織炎的面積>50%，評(píng)為3分。肺組織纖維化程度評(píng)定使用Masson染色：無(wú)肺纖維化，評(píng)為0分；肺纖維化面積<20%，評(píng)為1分；肺纖維化面積在20%-50%，評(píng)為2分；肺纖維化面積>50%，評(píng)為3分。

1.7 酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)血清PICP和PⅢNP濃度使用雙抗體夾心ELISA對(duì)各組大鼠血清PICP和PⅢNP濃度進(jìn)行檢測(cè)，由專(zhuān)人嚴(yán)格按試劑盒提供的操作步驟進(jìn)行。

1.8 qRT-PCR檢測(cè)GAS5、miR-21、ADAMTS-1表達(dá)收集各組大鼠右肺組織樣本，利用TRIzol試劑提取樣本中總RNA，再將提取的RNA通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄成cDNA。然后行PCR擴(kuò)增，所用引物由上海生工生物工程公司按照Tab 1所示序列合成。利用SYBR? Green Real Time PCR Master Mix，在Roche 480實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀上進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)條件： 95 ℃預(yù)變性2 min，95 ℃變性5 sec，62 ℃退火20 sec，72 ℃延伸15 sec，總共40個(gè)循環(huán)。用ΔΔCt值法，以U6、GAPDH為內(nèi)參照分別定量miR-21、GAS5和ADAMTS-1表達(dá)。

Tab 1 Primer sequences for qRT-PCR

1.9 Western blot檢測(cè)ADAMTS-1、Col Ⅰ和Col Ⅲ表達(dá)利用RIPA蛋白裂解液從各組大鼠右肺組織樣本中提取蛋白質(zhì)，BCA法對(duì)蛋白樣品濃度進(jìn)行測(cè)定。然后上樣、電泳并轉(zhuǎn)PVDF膜，予50 g·L-1脫脂牛奶室溫下封閉4 h，再分別滴加兔抗大鼠ADAMTS-1(1 ∶1 000)、Col Ⅰ(1 ∶1 000)、Col Ⅲ(1 ∶1 000)、β-actin(1 ∶2 000)一抗，4 ℃孵育過(guò)夜，TBST洗滌后滴加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG(1 ∶3 000)二抗，在37 ℃條件下孵育60 min，然后行ECL顯色，并于暗室內(nèi)曝光。通過(guò)凝膠圖像分析系統(tǒng)(Labwork軟件)掃描所得膠片，用β-actin為內(nèi)參照對(duì)ADAMTS-1、Col Ⅰ和Col Ⅲ蛋白表達(dá)進(jìn)行定量。

2 結(jié)果

2.1 鑒定GAS5、miR-21、ADAMTS-1間的ceRNA調(diào)控模式生物信息學(xué)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)(Fig 1)，GAS5與ADAMTS-1具有一個(gè)相同的miR-21 結(jié)合位點(diǎn)(GACC，即紅色框與藍(lán)色框重疊的部分)。而且，熒光素酶報(bào)告基因顯示(Fig 2)，miR-21 mimic不影響突變型GAS5熒光素酶活性(P>0.05)，但明顯減少野生型GAS5熒光素酶活性(P<0.01)，進(jìn)一步表明GAS5能夠靶向結(jié)合miR-21。結(jié)合課題組前期研究已經(jīng)鑒定ADAMTS-1為miR-21的靶基因，可確定GAS5、miR-21、ADAMTS-1之間存在ceRNA調(diào)控模式。

Fig 1 Binding sites among GAS5, ADAMTS-1 and miR-21 predicted by bioinformatics

Fig 2 Comparison of luciferase activity among groups n=3)

2.2 各組大鼠肺組織GAS5表達(dá)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，各組大鼠均未出現(xiàn)死亡。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，處死大鼠，提取右肺組織，利用qRT-PCR檢測(cè)GAS5表達(dá)水平，結(jié)果顯示(Fig 3)，相對(duì)于對(duì)照組，LV-GAS5組和LV-GAS5+miR-21 agomir組GAS5表達(dá)水平升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，提示構(gòu)建的GAS5過(guò)表達(dá)慢病毒載體具有較高的感染效率。

Fig 3 Comparison of GAS5 expression in pulmonary tissues among groups n=10)

2.3 GAS5減輕肺纖維化大鼠肺組織病理改變采用HE染色(Fig 4)和Masson染色(Fig 5)觀察各組大鼠肺組織病理改變，發(fā)現(xiàn)對(duì)照組大鼠肺組織中有大量的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)及成纖維細(xì)胞增生，肺泡間隔顯著增厚，部分肺泡腔被纖維組織占據(jù)，肺泡壁被破壞，大量藍(lán)色膠原沉積于肺間質(zhì)內(nèi)，纖維化明顯；LV-GAS5組上述病理改變明顯減輕，而LV-GAS5+miR-21 agomir組病理改變較LV-GAS5組加重。定量分析顯示(Tab 2)，LV-GAS5組肺泡炎與肺纖維化程度評(píng)分相比于對(duì)照組均降低(P<0.01)，然而，與LV-GAS5組比較，LV-GAS5+miR-21 agomir組上述評(píng)分明顯升高(P<0.01)。

Fig 4 The morphological changes of pulmonary tissues among groups (HE×200, scale bar = 100 μm)

Fig 5 The collagen deposition of pulmonary tissues among groups (Masson×200, scale bar=100 μm)

Tab 2 Effect of GAS5 on pathological changes of pulmonary tissues from pulmonary fibrosis rats n=10)

2.4 GAS5降低肺纖維化大鼠血清PICP和PⅢNP水平利用ELISA檢測(cè)各組大鼠血清PICP、PⅢNP水平，結(jié)果顯示(Tab 3)，LV-GAS5組血清PICP、PⅢNP水平較對(duì)照組降低(P<0.01)，而LV-GAS5+miR-21 agomir組血清PICP、PⅢNP水平高于LV-GAS5組(P<0.01)。

Tab 3 Comparison of serum PICP and PⅢNP levels among groups n=10)

2.5 GAS5下調(diào)肺纖維化大鼠肺組織Col Ⅰ、Col Ⅲ表達(dá)Col Ⅰ、Col Ⅲ分別為PICP、PⅢNP的成熟體，為了進(jìn)一步闡明GAS5 對(duì)肺纖維化大鼠肺組織中膠原蓄積的影響，采用Western blot檢測(cè)各組大鼠肺組織Col Ⅰ和Col Ⅲ表達(dá)。如Fig 6所示，LV-GAS5組Col Ⅰ和Col Ⅲ表達(dá)較對(duì)照組下調(diào)(P<0.01)，而LV-GAS5+miR-21 agomir組Col Ⅰ和Col Ⅲ表達(dá)則明顯高于LV-GAS5組(P<0.01)，與血清PICP、PⅢNP水平變化一致。

Fig 6 Comparison of Col Ⅰ and Col Ⅲ expression in pulmonary tissues among groups n=10)

2.6 GAS5增加肺纖維化大鼠肺組織ADAMTS-1表達(dá)ADAMTS-1是降解Col Ⅰ、Col Ⅲ最重要的酶，且已經(jīng)被鑒定為miR-21的靶基因，為了揭示GAS5抑制Col Ⅰ、Col Ⅲ表達(dá)的機(jī)制，通過(guò)qRT-PCR、Western blot分別檢測(cè)各組大鼠肺組織ADAMTS-1 mRNA與蛋白表達(dá)(Fig 7)，發(fā)現(xiàn)LV-GAS5組ADAMTS-1 mRNA與蛋白水平較對(duì)照組明顯升高(P<0.01)，而LV-GAS5+miR-21 agomir組ADAMTS-1 mRNA與蛋白水平較LV-GAS5組降低(P<0.01)，提示ADAMTS-1介導(dǎo)GAS5對(duì)Col Ⅰ、Col Ⅲ表達(dá)的抑制作用。

2.7 GAS5降低肺纖維化大鼠肺組織miR-21表達(dá)通過(guò)qRT-PCR檢測(cè)各組大鼠肺組織miR-21表達(dá)(Fig 8)，發(fā)現(xiàn)LV-GAS5組miR-21水平明顯低于對(duì)照組(P<0.01)，而LV-GAS5+miR-21 agomir組miR-21水平較LV-GAS5組顯著增加(P<0.01)。

3 討論

肺纖維化為一種死亡率極高的呼吸系統(tǒng)疾病，是各種不同病因所致的肺間質(zhì)疾病的共同結(jié)局，以肺泡間質(zhì)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、纖維母細(xì)胞增生和大量膠原沉積為特征，目前尚無(wú)有效的治療方法，嚴(yán)重危害人類(lèi)健康。因此，以肺纖維化發(fā)病機(jī)理中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)為突破口，開(kāi)發(fā)靶向治療新藥對(duì)于改善患者預(yù)后具有十分重要的意義。GAS5是一種全長(zhǎng)為630個(gè)核苷酸的lncRNA，定位于人1q25.1的小開(kāi)放閱讀框。以往的研究多關(guān)注GAS5在腫瘤增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移等方面的作用[11-12]，新近研究表明，GAS5也與纖維化疾病相關(guān)[8-9]，但在肺纖維化中的作用尚不清楚。本研究發(fā)現(xiàn)，GAS5過(guò)表達(dá)減輕大鼠肺纖維化病變，并降低血清PICP、PⅢNP水平，下調(diào)肺組織Col Ⅰ和Col Ⅲ表達(dá)，提示GAS5能夠促進(jìn)Col Ⅰ和Col Ⅲ降解，發(fā)揮抗肺纖維化作用。

Fig 7 Comparison of ADAMTS-1 mRNA (A) and protein (B) expression in pulmonary tissues

Fig 8 Comparison of miR-21 expression in pulmonary tissues

LncRNA可作ceRNA 通過(guò)miRNA 應(yīng)答元件與靶mRNA競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合同種 miRNA分子，使miRNA 的水平下降，抑制 miRNA 對(duì)靶 mRNA 的沉默效應(yīng)，進(jìn)而上調(diào)靶基因的表達(dá)[6-7]。ceRNA是廣泛存在于動(dòng)物體內(nèi)的一種全新的基因表達(dá)調(diào)控模式，ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)失調(diào)與肺纖維化的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切[13-14]。本研究中，GAS5與ADAMTS-1 3′-UTR分享一個(gè)共同的miR-21結(jié)合位點(diǎn)，而且miR-21模擬物明顯減少野生型GAS5熒光素酶活性，但對(duì)突變型GAS5熒光素酶活性無(wú)明顯影響，從而證實(shí)GAS5為miR-21的靶基因。同時(shí)，課題組前期研究已經(jīng)鑒定ADAMTS-1為miR-21的靶基因[4-5]。因此，GAS5、miR-21、ADAMTS-1間存在ceRNA調(diào)控模式，這為探討GAS5促進(jìn)Col Ⅰ和Col Ⅲ分解機(jī)制提供了新的方向。

miRNAs是一類(lèi)在人體廣泛分布的內(nèi)源性非編碼RNA，長(zhǎng)度為19-25個(gè)核苷酸，在轉(zhuǎn)錄后水平抑制靶基因表達(dá)。miR-21定位于人17q23.2的脆性區(qū)域上，有促纖維化作用[15-16]。ADAMTS-1屬于一種Zn2+依賴的分泌型蛋白，是ADAMTS家族中第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的成員，分泌后經(jīng)含 TSP-1 的血小板反應(yīng)素同源域錨定于細(xì)胞外基質(zhì)，通過(guò)金屬蛋白酶結(jié)構(gòu)域分解Col Ⅰ和Col Ⅲ 等細(xì)胞外基質(zhì)成分[17]。研究發(fā)現(xiàn)，miR-21過(guò)表達(dá)能明顯下調(diào)ADAMTS-1水平，進(jìn)而增加肺組織Col Ⅰ和Col Ⅲ含量，從而加重博萊霉素所致的小鼠肺纖維化[18]。本研究發(fā)現(xiàn)，GAS5過(guò)表達(dá)降低miR-21水平，上調(diào)ADAMTS-1表達(dá)，而且miR-21 agomir處理可逆轉(zhuǎn)GAS5過(guò)表達(dá)對(duì)ADAMTS-1、Col Ⅰ、Col Ⅲ表達(dá)及肺纖維化病變的影響。因此，miR-21/ADAMTS-1途徑在GAS5抑制大鼠肺纖維化過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。

綜上所述，本研究結(jié)果表明，GAS5作為ceRNA吸附miR-21，上調(diào)ADAMTS-1表達(dá)，促進(jìn)Col Ⅰ、Col Ⅲ降解，從而抑制博萊霉素所致的大鼠肺纖維化。隨著研究的深入，促進(jìn)內(nèi)源性GAS5表達(dá)可能是防治肺纖維化的新策略。

(致謝：本實(shí)驗(yàn)在侗醫(yī)藥研究湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室和懷化市第一人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)中心實(shí)驗(yàn)室完成，感謝各位同事和老師的幫助及指導(dǎo)。)