劉其偉，晁瑋霞，焦葉林，張月靜，劉瑞敏，齊義軍

(1. 許昌學(xué)院醫(yī)學(xué)院細(xì)胞行為學(xué)重點實驗室，河南 許昌 461000；2. 河南科技大學(xué)醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)院，第一附屬醫(yī)院，腫瘤醫(yī)院，河南省腫瘤表觀遺傳重點實驗室，河南 洛陽 471003；3. 洛陽市第一人民醫(yī)院病理科，河南 洛陽 471003；4. 河南大學(xué)醫(yī)學(xué)院細(xì)胞與分子免疫學(xué)重點實驗室，河南 開封 475000)

食管鱗癌(esophageal squamous cell carcinoma，ESCC)是中國食管癌的主要組織學(xué)類型[1]。ESCC早期癥狀不典型，因此大部分首次確診的ESCC患者已發(fā)展至中晚期[2]?；熓悄壳癊SCC綜合治療方案的重要手段之一，但是，原發(fā)性耐藥或獲得性耐藥是導(dǎo)致ESCC治療失敗、ESCC患者死亡的主要原因[3]。更重要的是，化療耐藥細(xì)胞具有更強侵襲、轉(zhuǎn)移能力，使ESCC進展加速[4]。因此，防止或逆轉(zhuǎn)ESCC多藥耐藥性對于提高化療療效十分重要。

腫瘤的化療方案包括多種化療藥物，ESCC患者對一種化療方案產(chǎn)生耐藥后，可再次選擇其它化療方案繼續(xù)進行化療。盡管腫瘤細(xì)胞對一種化療藥物產(chǎn)生耐藥性后，通常也獲得了多藥耐藥性(multidrug resistance，MDR)，但這與腫瘤細(xì)胞在多種化療藥物作用后產(chǎn)生的MDR并不完全一致。因此，應(yīng)用多種化療藥物建立ESCC多藥耐藥細(xì)胞模型，對于深入探討ESCC化療耐藥發(fā)生的分子機制，篩選鑒定ESCC耐藥標(biāo)志物分子、耐藥分子靶點具有重要臨床價值。

1 材料與方法

1.1 試劑紫杉醇(paclitaxel，PTX，Sigma，貨號SML2017-5MG)；順鉑(cisplatin，CDDP，Sigma，貨號P4394-25MG)；5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil，5-FU，Sigma，貨號F6627-1G)；阿霉素(doxorubicin，DOX，Sigma ，貨號D1515-10MG)，長春新堿(vincristine，VCR，Sigma，貨號V0400000-1EA)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)和多藥耐藥細(xì)胞株含10%血清的RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)人ESCC EC9706細(xì)胞，對數(shù)生長期細(xì)胞用含2.5 mg·L-1PTX培養(yǎng)基培養(yǎng)3 d后，更換為不含PTX培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，待細(xì)胞活力恢復(fù)后，再加入含相同濃度PTX培養(yǎng)基培養(yǎng)至細(xì)胞能夠在含2.5 mg·L-1PTX培養(yǎng)基中穩(wěn)定生長。用同樣方法將PTX濃度依次提高至5、7.5、10 mg·L-1，建立耐10 mg·L-1PTX耐藥細(xì)胞株EC9706/PTX。根據(jù)EC9706/PTX對5-FU、CDDP、DOX和VCR的化療藥物敏感性，依次用5-FU和CDDP處理EC9706/PTX細(xì)胞，最終建立MDR細(xì)胞株EC9706/PDFC。本實驗所用5-FU和CDDP的藥物濃度梯度分別為5、10、15、20、25 mg·L-1和1、2、3及4 mg·L-1。EC9706/CDDP和EC9706/PTX分別是對單個化療藥物CDDP和PTX耐藥的細(xì)胞株，用含10%血清的RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)。

1.3 MTT法測定細(xì)胞活性對數(shù)生長期EC9706/PDFC細(xì)胞消化后，以1×107·L-1細(xì)胞數(shù)接種于96孔板中，24 h后更換為含不同濃度PTX、CDDP、5-FU、DOX、VCR的培養(yǎng)基，每個濃度有3個復(fù)孔，并設(shè)空白對照。72 h后加入5 g·L-1MTT (20 μL/孔)，4 h后加入二甲基亞砜，混合均勻后用多功能酶標(biāo)儀在550 nm處檢測各孔吸收度值。確定50%細(xì)胞存活的藥物濃度(IC50)以及耐藥指數(shù)(RI)。

1.4 細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化及侵襲實驗對數(shù)生長期EC9706和EC9706/PDFC細(xì)胞，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)并進行拍照。Matrigel包被Transwell小室水化2 h，分別將無血清RPMI 1640培養(yǎng)基重懸的1×105個EC9706和EC9706/PDFC接種于Transwell小室上層，小室下層加入含20%血清的1640培養(yǎng)基，培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)30 h終止。PBS清洗Transwell小室，甲醛固定，結(jié)晶紫染色，鏡下計數(shù)細(xì)胞并拍照。

1.5 細(xì)胞生長曲線及成球?qū)嶒灢捎肕TT法測定EC9706和EC9706/PDFC d 2至d 8等時間點細(xì)胞活性，繪制細(xì)胞生長曲線。對數(shù)生長期EC9706和EC9706/PDFC細(xì)胞，胰酶消化后，分別將5 000細(xì)胞接種于超低吸附6孔板內(nèi)，應(yīng)用干細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)兩周后，計數(shù)成球細(xì)胞數(shù)。

1.6 細(xì)胞周期測定對數(shù)生長期EC9706和EC9706/PDFC細(xì)胞胰酶消化后各取2×106個細(xì)胞，4 ℃預(yù)冷PBS洗滌2次，加入1 mL預(yù)冷70%濃度乙醇，4 ℃固定2 h，PBS清洗1次，離心后于細(xì)胞團塊中加入100 μL的RNase A，重懸細(xì)胞后37 ℃孵育30 min，400 μL PI于4 ℃避光孵育30 min，流式細(xì)胞儀檢測。

1.7 Q-PCR檢測干性和EMT相關(guān)分子表達(dá)收集對數(shù)生長期EC9706和EC9706/PDFC細(xì)胞，TRIzol法提取RNA，OD 260/280比值確定RNA純度，計算RNA濃度后，取2 μg RNA，將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA(invitrogen, C28025-32)。Q-PCR檢測OCT3/4、ALDH1A1、BM1和β-catenin等腫瘤干細(xì)胞(cancer stem cells，CSCs)及E-cadherin、N-cadherin、Vimmentin、Fibronectin等上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial mesenchymal transition, EMT)分子mRNA表達(dá)。本實驗所用PCR引物序列見Tab 1。

Tab1 Primers used for quantitative real time PCR

1.8 Western blot檢測干性及EMT相關(guān)分子表達(dá)50 μg EC9706/PDFC和EC9706細(xì)胞蛋白進行12% SDS-PAGE電泳分離，電轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉1 h，相應(yīng)一抗4 ℃孵育過夜，二抗(1 ∶10 000)室溫孵育1 h，ECL顯色檢測目的條帶。本實驗所用一抗包括：OCT3/4(CST，2890)、ALDH1A1(CST， 36671)、BM1(abcam，ab40800)、β-catenin(CST，8480)、E-cadherin(CST，3199S)和Fibronectin(CST，26836)。

1.9 多藥耐藥性表型穩(wěn)定性復(fù)蘇已凍存3年的EC9706/CDDP、EC9706/PXT和EC9706/PDFC等細(xì)胞，待細(xì)胞生長穩(wěn)定后，分別加入3 mg·L-1CDDP、10 mg·L-1PTX、CDDP和PTX聯(lián)合培養(yǎng)，收集藥物持續(xù)作用兩周停藥48 h及持續(xù)作用兩周細(xì)胞樣本。提取RNA并反轉(zhuǎn)錄，檢測ABC家族ABCB1、ABCG2、ABCC1、ABCC2等4個分子在EC9706和各耐藥細(xì)胞中的表達(dá)特征。

2 結(jié)果

2.1 EC9706/PDFC耐藥指數(shù)PTX、5-FU、CDDP、DOX、VCR等不同濃度化療藥物處理EC9706/PDFC和EC9706細(xì)胞72 h后，MTT法檢測各組細(xì)胞活性，獲得EC9706/PDFC和EC9706細(xì)胞對各種藥物的IC50值，計算EC9706/PDFC對各種化療藥物的RI(Tab 2)。結(jié)果顯示，EC9706/PDFC對PTX、DOX、CDDP產(chǎn)生高度耐藥性，對5-FU和VCR產(chǎn)生中度耐藥性。

2.2 細(xì)胞形態(tài)及侵襲倒置顯微鏡可見EC9706細(xì)胞大小基本一致，成鋪路石樣，部分為圓形，而EC9706/PDFC細(xì)胞大小不一，呈梭形或多角形，多有突起(Fig 1A)。Transwell小室檢測細(xì)胞侵襲能力，與親本細(xì)胞EC9706相比，EC9706/PDFC穿過Transwell小室基底膜Matrigel的細(xì)胞數(shù)明顯增多(Fig 1B，P<0.01)。

Tab 2 The resistance index of EC9706 and EC9706/PDFC to different chemotherapy drugs

Fig 1 Microscopic morphology of EC9706 and EC9706/PDFC cells (A) and invasive potential of EC9706 and EC9706/PDFC cells

2.3 細(xì)胞增殖及干性成球能力MTT法檢測EC9706和EC9706/PDFC的細(xì)胞活性，繪制細(xì)胞生長曲線，發(fā)現(xiàn)EC9706/PDFC增殖能力顯著低于EC9706(Fig 2A,P<0.05)。EC9706和EC9706/PDFC細(xì)胞于超低吸附狀態(tài)下培養(yǎng)兩周，發(fā)現(xiàn)EC9706/PDFC形成的干性細(xì)胞球數(shù)目明顯多于EC9706細(xì)胞。

2.4 EC9706和EC9706/PDFC細(xì)胞周期分析EC9706/PDFC的S期細(xì)胞明顯低于EC9706，兩個細(xì)胞株中S期細(xì)胞分別為17.56%和23.29%(P<0.05)，G0-G1期細(xì)胞分別為66.6%和62.64%，G2-M期細(xì)胞分別為15.84%和14.07%。見Fig 3。

2.5 干性和EMT相關(guān)分子表達(dá)與EC9706細(xì)胞相比，MDR細(xì)胞EC9706/PDFC中OCT3/4、ALDH1A1、BM1和β-catenin等分子mRNA表達(dá)水平明顯升高，而上皮相關(guān)分子E-cadherin表達(dá)降低，間質(zhì)相關(guān)分子N-cadherin和Fibronectin表達(dá)升高，Vimmentin表達(dá)無顯著變化，見Fig 4。與q-PCR檢測結(jié)果一致，Western blot結(jié)果表明，EC9706/PDFC中OCT3/4、ALDH1A1、BM1、β-catenin等干性分子蛋白表達(dá)明顯高于EC9706細(xì)胞，E-cadherin表達(dá)下調(diào)而Fibronectin表達(dá)上調(diào),見Fig 5。

Fig 3 The cell cycle distributions of EC9706 (A) and

Fig 4 mRNA expression levels of molecules related to stem cell (A) and epithelial-mesenchymal transition (B) in EC9706 and EC9706/PDFC quantified by

Fig 5 Differential protein expression levels

2.6 多藥耐藥性表型穩(wěn)定性ABC轉(zhuǎn)運蛋白家族介導(dǎo)的藥物外排是MDR產(chǎn)生的關(guān)鍵機制，因此，本實驗檢測了ABC家族ABCB1、ABCG2、ABCC1、ABCC2等4個分子在已凍存3年的EC9706/PDFC、EC9706/PTX、EC9706/CDDP中的表達(dá)。與母本EC9706細(xì)胞相比，ABCB1在3個耐藥細(xì)胞中表達(dá)均增高，藥物持續(xù)兩周后停藥48 h或持續(xù)2周作用使EC9706/PDFC和EC9706/PTX細(xì)胞中ABCB1表達(dá)進一步升高，但使EC9706/CDDP細(xì)胞中ABCB1表達(dá)降低至EC9706細(xì)胞中的表達(dá)水平。3個耐藥細(xì)胞中ABCC1與ABCB1表達(dá)模式類似，但表達(dá)增高幅度低于ABCB1。與ABCB1和ABCC1表達(dá)模式完全不同，ABCG2在EC9706/PDFC、EC9706/PTX、EC9706/CDDP細(xì)胞中表達(dá)均低于EC9706細(xì)胞，2種不同的藥物處理方式均使ABCG2表達(dá)升高。EC9706/CDDP細(xì)胞中ABCC2表達(dá)增高顯著(比EC9706增高4.2倍)，2種不同給藥方式使其表達(dá)明顯降低，但EC9706/PDFC和EC9706/PTX中增高不明顯，持續(xù)的藥物處理方式使ABCC1稍微增加。見Fig 6。

3 討論

雖然根治性手術(shù)治療是早期ESCC的首選治療手段，但治療效果仍然不理想，5年總體生存率僅為40%[5]。與單純手術(shù)治療相比，新輔助放化療聯(lián)合手術(shù)治療能夠明顯提高局部晚期ECSS患者的完全切除率和總體生存期。失去手術(shù)治療機會的中晚期ESCC患者，同步放化療能夠有效緩解局部癥狀，防止遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和腫瘤復(fù)發(fā)，放化療效果良好的患者可達(dá)到與手術(shù)治療相似的生存率。然而，對放化療產(chǎn)生抗性是臨床ESCC治療失敗的主要原因之一[6]。

化療是ESCC綜合治療的重要手段之一，目前常用的化療藥物包括CDDP、5-FU、PTX、DOX、VCR等，同時或序貫性聯(lián)合應(yīng)用多種化療藥物是目前腫瘤治療常用策略之一。CDDP是ESCC聯(lián)合化療方案的首選基礎(chǔ)藥物，鉑類和氟尿嘧啶類藥物聯(lián)合是ESCC的標(biāo)準(zhǔn)治療方案之一。這些細(xì)胞毒性藥物具有不同抗腫瘤機制，例如，CDDP與DNA分子內(nèi)和分子間交聯(lián)形成加合物，抑制DNA復(fù)制，引起細(xì)胞凋亡[7]；5-FU通過抑制胸腺嘧啶核苷酸合成酶而抑制DNA的合成；PTX靶向微管，促進微管蛋白聚合抑制解聚，保持微管蛋白穩(wěn)定，使有絲分裂異?；蛲Ｖ苟鴮?dǎo)致細(xì)胞死亡。顯然，ESCC臨床治療過程中ESCC細(xì)胞產(chǎn)生耐藥性，是在多種化療藥物的作用下形成的。

Fig 6 Q-PCR used to quantify mRNA expression levels of molecules for ABCB1 (A), ABCC1 (B), ABCC2 (C) and ABCG2 (D) in EC9706, EC9706/CDDP, EC9706/PTX and EC9706/PDFC, which were exposed to 3 mg·L-1 of CDDP, 10 mg·L-1 of PTX, and combination of CDDP and PTX, respectively.

然而，目前ESCC耐藥細(xì)胞系多由單一化療藥物誘導(dǎo)而建立[8]。雖然這些耐藥細(xì)胞系也具有部分MDR特征，但并不能完全模擬ESCC患者臨床治療過程中癌細(xì)胞耐藥性的獲得過程。本研究首先應(yīng)用間歇性反復(fù)沖擊法建立了對PTX耐藥亞細(xì)胞株EC9706/PTX(RI=25.8)，繼而應(yīng)用敏感化療藥物5-FU建立對PTX和5-FU耐藥的亞細(xì)胞株EC9706/PTX/5-FU。采用同樣的方法，建立了對CDDP耐藥的EC9706/PTX/5-FU亞細(xì)胞系。盡管本研究僅應(yīng)用了3種化療藥物反復(fù)作用于EC9706細(xì)胞，但由于交叉耐藥性的存在，最終獲得的EC9706/PDFC細(xì)胞對目前臨床常用的5種化療藥物均產(chǎn)生了不同程度的抵抗能力。與親本細(xì)胞EC9706相比，EC9706/PDFC表現(xiàn)了完全不同的生物學(xué)性狀，如增殖減慢、細(xì)胞形態(tài)間質(zhì)化、侵襲能力和干性成球能力增加。此外，EC9706/PDFC細(xì)胞的干細(xì)胞(OCT3/4、ALDH1A1、BM1和β-catenin)和EMT(N-cadherin、Fibronectin)標(biāo)志物分子的表達(dá)明顯上調(diào)，表明EC9706/PDFC細(xì)胞發(fā)生了干性富集和部分EMT轉(zhuǎn)化。

腫瘤干細(xì)胞(cancer stem cells，CSCs)是一類具有自我更新、無限增殖和多向分化潛能的細(xì)胞亞群。目前各種治療手段主要靶向快速增殖的癌細(xì)胞，而非CSCs，即使治療能使腫瘤完全消退，殘余的CSCs仍然能夠?qū)е履[瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，是腫瘤化療失敗的主要原因。靶向抑制CSCs特異性標(biāo)志物分子，可逆轉(zhuǎn)耐藥表型。通過抑制IGF2介導(dǎo)的CD133分子表達(dá)，IGF2中和抗體能夠增加ESCC來源的裸鼠皮下荷瘤對5-FU的敏感性[9]。塞來昔布通過靶向COX2而抑制食管癌細(xì)胞CSC標(biāo)志物表達(dá)，導(dǎo)致癌細(xì)胞對5-FU重新致敏[10]。由此可見，本研究結(jié)果提示，OCT3/4、ALDH1A1、BM1和/或β-catenin等干性分子可能介導(dǎo)了EC9706/PDFC的MDR的產(chǎn)生，這些分子可能是逆轉(zhuǎn)EC9706/PDFC多重耐藥的重要靶點分子。

EMT是指上皮細(xì)胞在特定的生理或病理情況下向間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化的生物學(xué)過程。EMT的發(fā)生涉及多種細(xì)胞外基質(zhì)、細(xì)胞因子和轉(zhuǎn)錄因子，是由多個信號通路參與調(diào)控的復(fù)雜、動態(tài)過程[11]。EMT不僅使表皮樣的腫瘤細(xì)胞可以轉(zhuǎn)化為間質(zhì)樣細(xì)胞以利于轉(zhuǎn)移和侵襲，并且還能獲得干細(xì)胞樣的特性。正常乳腺上皮細(xì)胞通過EMT關(guān)鍵分子過表達(dá)可轉(zhuǎn)化為干細(xì)胞；體外誘導(dǎo)乳腺上皮永生化細(xì)胞發(fā)生EMT后，這些上皮細(xì)胞呈現(xiàn)間質(zhì)表型并獲得了自我更新和腫瘤形成能力，并且表達(dá)乳腺癌干細(xì)胞分子標(biāo)志CD44high/CD24low[12]。腫瘤細(xì)胞在獲得MDR能力的過程中表現(xiàn)出EMT，并且誘導(dǎo)EMT發(fā)生能夠增加腫瘤對放化療的耐受能力；而本身具有間質(zhì)分化狀態(tài)的腫瘤細(xì)胞也常表現(xiàn)為原發(fā)性耐藥的特點[13]。EMT轉(zhuǎn)錄因子Twist可結(jié)合于腫瘤抑制基因Par-4的啟動子而使Par-4沉默，從而促進腫瘤的復(fù)發(fā)，產(chǎn)生化學(xué)耐藥性[14]。此外，化療后產(chǎn)生耐藥性的乳腺癌細(xì)胞獲得EMT特性，循環(huán)或分散的癌細(xì)胞中EMT標(biāo)志物的表達(dá)與預(yù)后不良密切相關(guān)[15]。這些研究表明，EMT及干性可以導(dǎo)致MDR，因此，EMT相關(guān)的信號分子及通路是逆轉(zhuǎn)MDR的潛在分子靶點。

ABC轉(zhuǎn)運蛋白家族包括49個成員分子，位于胞膜，參與多種分子的跨膜運輸，并與化療藥物胞外排出有關(guān)[16]。本實驗通過分析與MDR表型密切相關(guān)的ABCB1(又稱作多藥耐藥基因或P-糖蛋白)、ABCG2(乳腺耐藥蛋白)、ABCC1、ABCC2等4個分子在EC9706/PDFC、EC9706/CDDP和EC9706/PTX中的表達(dá)[17]，發(fā)現(xiàn)本實驗建立的多藥耐藥EC9706/PDFC細(xì)胞，與由單藥誘導(dǎo)耐藥細(xì)胞(EC9706/CDDP、EC9706/PTX)相比，具有不完全相同的表達(dá)模式。3種不同耐藥細(xì)胞中，ABCB1和ABCC1的表達(dá)模式類似，但ABCB1的表達(dá)增加程度顯著高于ABCC1，尤其是EC9706/PDFC和EC9706/PTX細(xì)胞；EC9706/PDFC和EC9706/PTX細(xì)胞中ABCC2表達(dá)與EC9706中該分子表達(dá)差異不明顯，而ABCG2在3種不同的耐藥細(xì)胞中表達(dá)卻降低。上述結(jié)果表明EC9706/PDFC耐藥性的獲得方式與耐藥機制相關(guān)，需進一步研究闡明。

本研究建立的人ESCC多藥耐藥細(xì)胞EC9706/PDFC更接近ESCC患者的臨床化療過程，是深入研究ESCC耐藥分子機制的理想細(xì)胞模型。EC9706/PDFC發(fā)生了EMT和CSC富集，進一步分析鑒定EMT和CSC關(guān)鍵分子，將為逆轉(zhuǎn)ESCC化療耐藥提供重要的分子靶點。