籍 辰, 張文娟, 關(guān) 寧, 高秀秋, 王琳源

（1.錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院牙周黏膜科，遼寧 錦州 121000；2.錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院腦與脊髓損傷重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧 錦州 121000）

慢性牙周炎是由牙周致病菌引起的、發(fā)生在牙齒支持組織（包括牙齦、牙周膜、牙槽骨） 的炎癥性、破壞性疾病，牙周炎的病因復(fù)雜，包括感染因素（細(xì)菌、病毒） 和非感染因素（機(jī)體免疫的狀態(tài)、遺傳因素等）。目前臨床上治療牙周炎常依賴于機(jī)械性地去除牙菌斑，如潔治、刮治和牙周手術(shù)等，但因牙周炎患者的病程較長(zhǎng)，一旦患者牙周維護(hù)不佳，則易出現(xiàn)牙周病損進(jìn)行性加重。因此，研究慢性牙周炎發(fā)生發(fā)展的相關(guān)機(jī)制，尋找關(guān)鍵的阻斷靶點(diǎn)是目前亟需解決的問題。研究［1］表明：宿主對(duì)抗牙周致病菌的免疫應(yīng)答（包括固有免疫和適應(yīng)性免疫） 在牙周炎的發(fā)生發(fā)展和轉(zhuǎn)歸中發(fā)揮重要作用。研究［2］顯示：在牙周炎的病變牙周組織中巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)增多，巨噬細(xì)胞作為宿主先天免疫系統(tǒng)的重要組成部分，能夠分泌單核細(xì)胞趨化蛋白1（monocyte chemotactic protein 1，MCP-1）、白細(xì)胞介 素8 （interleukin-8， IL-8） 和 白 細(xì) 胞 介 素6（interleukin-6，IL-6） 等趨化因子，從而誘導(dǎo)更多的巨噬細(xì)胞在牙周組織中活化聚集，通過趨化因子產(chǎn)生和自我調(diào)節(jié)，建立防御機(jī)制。巨噬細(xì)胞具有很強(qiáng)的可塑性，可極化為不同類型，其中，M1 型巨噬細(xì)胞作為巨噬細(xì)胞的一種亞型，具有黏附和殺傷細(xì)菌、分泌大量促炎因子及啟動(dòng)獲得性免疫應(yīng)答的作用［3］，可抑制巨噬細(xì)胞向M1 型巨噬細(xì)胞分化，明顯抑制炎癥反應(yīng)。國(guó)內(nèi)外尚無有關(guān)M1 型巨噬細(xì)胞對(duì)慢性牙周炎免疫狀態(tài)影響的研究報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)以牙齦卟啉單胞菌誘導(dǎo)的牙周炎小鼠［4-5］為研究對(duì)象，評(píng)價(jià)小鼠牙槽骨的吸收情況，采用HE 染色觀察小鼠牙周組織改變， 流式細(xì)胞術(shù)和實(shí)時(shí)定量PCR 法檢測(cè)M1 型巨噬細(xì)胞及其相關(guān)因子誘導(dǎo)型一氧 化 氮 合 酶 （induced nitric oxide synthase，iNOS） 在慢性牙周炎小鼠病損組織中的表達(dá)情況，探討M1 型巨噬細(xì)胞在慢性牙周炎中的作用，為牙周炎的防治提供免疫理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、主要試劑和儀器SPF 級(jí)7 周齡C57BL/6 雌性小鼠10 只， 體質(zhì)量18～20 g， 由遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)股份有限公司提供，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK （遼） 2015-0001，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)過程經(jīng)錦州醫(yī)科大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。小鼠牙列完整，無齲壞及牙周疾病，于室內(nèi)采光條件良好、清潔安靜、通風(fēng)良好、室溫22 ℃、光照周期12 h∶12 h、無特殊致病菌的環(huán)境中給予無菌飼料分籠喂養(yǎng)。Ficoll分離液（天津?yàn)笊镏破房萍加邢挢?zé)任公司），F(xiàn)4/80 抗體（美國(guó)Biolegend 公司）， iNOS 抗體（美國(guó)eBioscience 公司）， 反轉(zhuǎn)錄試劑盒（中國(guó)Vazyme 公 司）， TRIzol （中 國(guó)Ambion 公 司），iNOS 引物合成、β-actin 引物合成和DEPC 水（中國(guó)鼎國(guó)昌盛公司）。 流式細(xì)胞儀和FACS Calibur（美國(guó)BD 公司），實(shí)時(shí)定量PCR 儀和高速低溫冷凍離心機(jī)（美國(guó)Thermo 公司），體視顯微鏡（日本Olympus 公司），厭氧培養(yǎng)箱（日本SANYO 公司），渦旋混合器（江蘇海門市其林貝爾儀器制造廠），微量加樣器（法國(guó)吉爾森公司）。

1.2動(dòng)物分組和處理10 只小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組和慢性牙周炎組，每組5 只。慢性牙周炎組：牙齦卟啉單胞菌W83以菌密度1×1010mL－1重懸于含2% 羧甲基纖維素鈉（carboxymethyl cellulose sodium， CMC） 的 磷 酸 鹽 緩 沖 液（phosphate buffer sulution，PBS） 中。將100μL 菌懸液涂抹于小鼠齦緣乃至整個(gè)口腔，連續(xù)涂抹7 d。對(duì)照組：以相同體積含2% CMC 的PBS 液涂抹于小鼠口腔。第35 天出現(xiàn)明顯的牙槽骨吸收，說明小鼠牙周炎動(dòng)物模型成功建立。于口腔涂抹結(jié)束后處死小鼠。

1.3 2組小鼠牙槽骨吸收情況評(píng)價(jià)處死小鼠后，截取上頜骨，去除軟組織，在體視顯微鏡下測(cè)量上頜磨牙（ 第一至第三磨牙） 從釉牙骨質(zhì)界（cementoenamel junction， CEJ） 到 牙 槽 嵴 頂（alveolar bone crest， ABC） 的距離， 每個(gè)牙測(cè)量頰、腭側(cè)共4 個(gè)位點(diǎn)：頰、腭側(cè)的近遠(yuǎn)中位點(diǎn)，取12 個(gè)位點(diǎn)的平均值。2 組小鼠進(jìn)行比較，判斷牙槽骨吸收程度。

1.4HE 染色觀察2組小鼠牙周組織形態(tài)表現(xiàn)取2 組小鼠半側(cè)上頜骨的磨牙段，經(jīng)固定、脫鈣、脫水、包埋，制成近遠(yuǎn)中向5μm 切片，常規(guī)HE 染色觀察牙齦卟啉單胞菌對(duì)牙周組織炎癥的影響。

1.5流式細(xì)胞術(shù)分析2組小鼠牙齦組織中M1型巨噬細(xì)胞百分率和細(xì)胞數(shù)①組織樣本制備：分別取對(duì)照組小鼠和慢性牙周炎組小鼠牙齦， 參考KOBAYASHI 等［6］方 法 制 備 牙 齦 單 細(xì) 胞 懸 液 制 備單核細(xì)胞懸液，牙齦組織置于1 mL PBS 液中切成1 mm×1 mm×1 mm 小塊，取上清，經(jīng)膠原酶消化的牙齦細(xì)胞中的單個(gè)核細(xì)胞再由Ficoll 分離液分離。②細(xì)胞染色和檢測(cè)：將牙齦細(xì)胞懸液分別加入流式管并根據(jù)組別編號(hào)。F4/80 抗體和iNOS 抗體行胞外胞內(nèi)因子染色，室溫避光孵育，PBS 洗滌重懸，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)牙齦組織中M1 型巨噬細(xì)胞的表達(dá)情況。采用FlowJo10.4 軟件分析巨噬細(xì)胞和M1 型巨噬細(xì)胞的百分率，在1×104個(gè)牙齦單個(gè)核細(xì)胞內(nèi)分析F4/80＋iNOS＋M1 型巨噬細(xì)胞數(shù)。

1.6實(shí)時(shí)定量PCR法檢測(cè)2組小鼠牙齦組織中M1型巨噬細(xì)胞相關(guān)因子iNOS mRNA表達(dá)水平采用TRIzol 試劑常規(guī)提取小鼠牙齦組織總RNA，并經(jīng)紫外分光光度儀檢測(cè)純度， 于260 和280 nm 處檢測(cè)RNA 吸光度A （260） 值，以A （260）/A （280）的比值為1.8～2.2 作為實(shí)驗(yàn)樣本。 操作完成后，凍存于－80℃冰箱或直接進(jìn)行PCR 反應(yīng)。按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將總RNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA 進(jìn)行擴(kuò)增，實(shí)時(shí)定量PCR 反應(yīng)的總體系為20 μL。引物設(shè)計(jì)，iNOS 上游引物序列 5′- ACAGGAGAAAGCGCAAAAC -3′，下游引物序列 5′-TGTGGCCTTGTGGTGAAGAG-3′； 以β -actin 為 內(nèi) 參 照 物，β-actin 上游引物序列5′- GGCTGTATTCCCCTCCATCG-3′，下游引物序列5′-CCAGTTGGTAACAATGCCATGT-3′。引物均由北京鼎國(guó)昌盛生物科技有限公司合成。 反應(yīng)條件： 預(yù)變性95 ℃、30 s；循環(huán)反應(yīng)95 ℃、5 s；60 ℃、30 s，共40 個(gè)循環(huán)； 溶解曲線95 ℃、 15 s、 60 ℃、 1 min、 95 ℃、15 s。每個(gè)樣本做3 個(gè)平行孔，結(jié)果采用2－ΔΔCt法進(jìn)行計(jì)算。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 22.0 和GraphPad Prism 8.0 統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。2 組小鼠CEJ 到ABC 距離、牙齦組織中巨噬細(xì)胞和M1 型巨噬細(xì)胞的細(xì)胞百分率和細(xì)胞數(shù)、 牙齦組織中iNOS mRNA 表達(dá)水平以x±s表示，組間樣本均數(shù)比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 2組小鼠牙槽骨吸收情況對(duì)照組和慢性牙周炎組小鼠CEJ 到ABC 的距離分別為（134.033±19.523） μm 和（206.5 ±20.797） μm。與對(duì)照組比較，慢性牙周炎組小鼠發(fā)生明顯的牙槽骨吸收，ABC 高度降低， CEJ 到ABC 的距離增大（P＜0.01）。體視顯微鏡下觀察的2 組小鼠牙槽骨吸收情況見圖1 （插頁(yè)二）。

2.2 2組小鼠牙周組織形態(tài)表現(xiàn)對(duì)照組小鼠結(jié)合上皮完整并附著于釉牙骨質(zhì)界，牙周膜膠原纖維排列整齊，牙槽骨表面完整，未見破骨細(xì)胞和骨吸收陷窩形成。慢性牙周炎組小鼠結(jié)合上皮上方與牙面分離，附著位于CEJ 的根方，牙周膜膠原纖維溶解、變性，排列紊亂，結(jié)合上皮周圍有大量的炎細(xì)胞浸潤(rùn)，ABC 吸收變平，可見破骨細(xì)胞和骨吸陷窩形成。見圖2 （插頁(yè)二）。

2.3 2組小鼠牙齦組織中F4/80＋iNOS＋M1 型巨噬細(xì)胞百分率

對(duì)照組小鼠牙齦組織中F4/80＋巨噬細(xì)胞細(xì)胞百分率為（10.236±0.982） %，慢性牙周炎小鼠牙齦組織中F4/80＋巨噬細(xì)胞細(xì)胞百分率為（29.940±1.745） %，與對(duì)照組比較，慢性牙周炎小鼠牙齦組織中F4/80＋巨噬細(xì)胞細(xì)胞百分率明顯升高（P＜0.01）。 對(duì)照組小鼠牙齦組織中F4/80＋iNOS＋M1 型 巨 噬 細(xì) 胞 百 分 率 為（5.408±0.754） %， 慢性牙周炎組小鼠牙齦組織中F4/80＋iNOS＋M1 型 巨 噬 細(xì) 胞 百 分 率 為（30.580±1.522） %；在1×104個(gè)牙齦單細(xì)胞中，對(duì)照組小鼠牙齦組織中M1 型巨噬細(xì)胞數(shù)為（56.078±13.645） 個(gè)，慢性牙周炎組小鼠牙齦組織中M1 型巨噬細(xì)胞數(shù)為（917.738±97.383） 個(gè)。與對(duì)照組比較，慢性牙周炎組小鼠牙齦組織中M1 型巨噬細(xì)胞百分率和細(xì)胞數(shù)均有明顯升高（P＜0.01）。見圖3。

圖3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)2 組小鼠牙齦組織中F4/80＋巨噬細(xì)胞和F4/80＋iNOS＋M1 型巨噬細(xì)胞的百分率Fig.3 Percentages of F4/80＋macrophages and F4/80＋iNOS＋M1 macrophages in gingival tissue of mice in two groups detected by flow cytometry

2.4 2組小鼠牙齦組織中M1型巨噬細(xì)胞相關(guān)因子iNOS mRNA表達(dá)水平對(duì)照組和慢性牙周炎小鼠牙齦組織中iNOS mRNA 均有不同程度的表達(dá)；慢性牙周炎組小鼠牙齦組織中iNOS mRNA 表達(dá)水平（1.212±0.133） 高 于 對(duì) 照 組（1.985±0.181）（P＜0.01）。

3 討 論

牙周病是人類口腔兩大類疾病之一，其患病率和嚴(yán)重性隨年齡增高而增加。慢性牙周炎是牙周病中重最為常見的一類疾病，其不僅是目前我國(guó)成人牙齒缺失的主要原因，影響口腔局部健康，而且與某些系統(tǒng)性疾病如心血管疾病、消化系統(tǒng)疾病等有著雙向聯(lián)系，進(jìn)而影響全身健康［7］。由于牙周組織樣本取材有限，利用穩(wěn)定可靠的牙周炎實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型研究慢性牙周炎的病因和發(fā)病機(jī)制對(duì)該疾病的預(yù)防及治療具有重要意義。小鼠牙周組織結(jié)構(gòu)與人類相似，并且其口腔中不含有慢性牙周炎的最主要的致病菌——牙齦卟啉單胞菌，因此，利用小鼠模型是研究慢性牙周炎宿主免疫和炎癥反應(yīng)的重要手段［8］。本研究以牙齦卟啉單胞菌懸液連續(xù)7 d 涂抹小鼠口腔，第35 天出現(xiàn)明顯的牙槽骨吸收，成功建立小鼠牙周炎動(dòng)物模型。

研究［9］已證明：在慢性牙周炎的發(fā)病過程中，宿主對(duì)抗牙周致病菌產(chǎn)生的免疫反應(yīng)與致病菌之間的相互作用影響著牙周炎的炎癥進(jìn)程和組織破壞。牙齦卟啉單胞菌等牙周致病菌定植到齦溝后，牙齦上皮細(xì)胞表面的模式識(shí)別受體如Toll 樣受體，識(shí)別牙周致病菌并產(chǎn)生細(xì)胞因子IL-8 和腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor， TNF） 等， 表達(dá)趨化因子如Toll 樣受體等，激活并招募局部牙周組織中的免疫細(xì)胞如中性多形核白細(xì)胞、單核/巨噬細(xì)胞等至細(xì)菌定植區(qū)控制并清除致病菌［10-11］。巨噬細(xì)胞作為固有免疫應(yīng)答的重要組成部分，在外來病原體和趨化因子的作用下，具有啟動(dòng)固有免疫應(yīng)答，加工和遞呈抗原，吞噬殺滅病原菌及清除細(xì)胞碎片等多種功能，對(duì)維持體內(nèi)的內(nèi)穩(wěn)態(tài)平衡和宿主防御有重要 意 義［12］。 研 究［13-14］顯 示： 類 風(fēng) 濕 關(guān) 節(jié) 炎（rheumatoid arthritis ，RA）、實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊 髓 炎 （experimentalautoimmune encephalomyelitis， EAE） 和 炎 癥 性 腸 ?。╥nflammatory bowel disease，IBD） 等炎癥性病損組織中巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)增多，表明巨噬細(xì)胞參與機(jī)體抗細(xì)菌性感染以及免疫性炎癥病損。JAGANNATHAN 等［15］發(fā)現(xiàn)：慢性牙周炎患者牙齦組織中CD14＋CD16＋單核/巨噬細(xì)胞百分率升高。LAM 等［16］發(fā) 現(xiàn)：應(yīng) 用 雙 磷 酸 鹽-脂 質(zhì) 體 清 除 巨 噬細(xì)胞，牙齦卟啉單胞菌誘導(dǎo)牙周炎小鼠的牙周骨吸收加重，與以往研究［17］結(jié)果一致。本研究結(jié)果顯示：牙周炎小鼠病損牙齦組織中F4/80＋巨噬細(xì)胞百分率升高，進(jìn)一步證明巨噬細(xì)胞在牙周組織抵抗牙周致病菌侵入的過程中發(fā)揮重要作用。

巨噬細(xì)胞具有高度可塑性，在微生物產(chǎn)物、受損細(xì)胞、活化的淋巴細(xì)胞和炎細(xì)胞刺激下活化并極化為細(xì)胞亞群，這些細(xì)胞亞群通過表達(dá)各自的表面分子、分泌細(xì)胞因子和趨化因子在組織局部發(fā)揮不同 作 用［18］。 巨 噬 細(xì) 胞 在 脂 多 糖（lipopolysaccharide，LPS） 和IFN-γ 的刺激下誘導(dǎo)極化為M1 型巨噬細(xì)胞，M1 型巨噬細(xì)胞分泌炎性細(xì) 胞 因 子 如TNF-α、 IL-1β、 IL-6 和IL-23 等［19］，合成分泌iNOS 進(jìn)而催化L-精氨酸產(chǎn)生NO 和L-瓜氨酸， 通過表達(dá)趨化因子CCL2-4、 CXCL8-11 招募Th1 細(xì)胞至組織進(jìn)而增強(qiáng)宿主的促炎效應(yīng)［20-21］。 在實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎早期階段，M1 型巨噬細(xì)胞活化并釋放促炎性細(xì)胞因子，損傷中樞神經(jīng)系統(tǒng)［17］。JONES 等［22］在體外研究發(fā)現(xiàn)：牙齦卟啉單胞菌可通過細(xì)胞壁的LPS 激活巨噬細(xì)胞向M1 型巨噬細(xì)胞極化，分泌大量的促炎性細(xì)胞因子IL-1、IL-6和趨化因子MCP-1。GONZALEZ等［23］在牙周炎恒河猴牙齦組織中發(fā)現(xiàn)：M1 型巨噬細(xì)胞相關(guān)因子CCL13、CCL19、CCR7 和TLR4 水平明顯升高。本研究結(jié)果顯示：正常小鼠牙齦和牙周炎的病損牙齦組織中均存在M1 型巨噬細(xì)胞，并且牙周炎小鼠M1 型巨噬細(xì)胞比例和數(shù)量均明顯增多，相關(guān)細(xì)胞因子iNOS 表達(dá)上調(diào)， 表明牙周炎小鼠M1 型巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答增強(qiáng)，提示在正常情況下，牙齦組織中M1 型巨噬細(xì)胞能有效清除病原刺激從而保護(hù)牙齦組織處于健康的狀態(tài)，而在發(fā)生牙周炎中，隨著入侵病原刺激物增多，大量的炎性因子促進(jìn)M1 型巨噬細(xì)胞活化并分泌促炎性細(xì)胞因子，從而形成放大效應(yīng)，使機(jī)體對(duì)抗牙周致病菌的反應(yīng)過強(qiáng)，從而加重了牙周組織的炎癥和組織損傷。

本研究通過分析小鼠牙齦組織中M1 型巨噬細(xì)胞以及相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)情況表明：牙周炎小鼠M1 型巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答增強(qiáng)，提示作為機(jī)體抗牙周致病菌的前沿，M1 型巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的適度的免疫應(yīng)答對(duì)牙周組織發(fā)揮保護(hù)性作用，而過強(qiáng)的反應(yīng)則會(huì)促進(jìn)牙周炎癥進(jìn)展。在牙周微環(huán)境中，M1 型巨噬細(xì)胞的活化及功能發(fā)揮受多種因子的調(diào)節(jié)，如何調(diào)控M1 型巨噬細(xì)胞免疫反應(yīng)強(qiáng)度，使其發(fā)揮有效的防御作用仍需進(jìn)一步研究。