呂美娟, 馬賢德, 任 路

（1.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng)110032; 2.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)教學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，遼寧 沈陽(yáng) 110032；3.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)研究生院，遼寧 沈陽(yáng) 110032）

阿爾茨海默?。ˋlzheimer’ s disease， AD）是記憶障礙最常見的神經(jīng)退行性疾?。?］，通常與行為變化有關(guān)，常表現(xiàn)為焦慮、幻覺、妄想、冷漠和異常運(yùn)動(dòng)等行為［2］。隨著老年人口比例的持續(xù)增長(zhǎng)，AD 的患病率進(jìn)一步升高，世界老年癡呆癥報(bào)告（2015 年）［3］指出：到2030 年，AD 患者將達(dá)到1 600 多萬(wàn)，到2050 年將達(dá)到2 800 萬(wàn)。AD 的病理特征是β-淀粉樣蛋白（amyloid β-protein，Aβ） 沉積過(guò)多和含有高磷酸化Tau （p-Tau） 的神經(jīng)纖維內(nèi)纏結(jié)［4-6］。Aβ 和p-Tau 的異常積累提示疾病過(guò)程中蛋白質(zhì)處理系統(tǒng)失效。事實(shí)上，蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)的失衡（包括自噬途徑） 與AD 的發(fā)病機(jī)制有關(guān)聯(lián)［7-8］。中醫(yī)中藥和針灸對(duì)AD 均具有較好的作用。研究［9］表明：?jiǎn)我粦?yīng)用中藥或針刺治療AD 具有良好的療效。目前，有關(guān)針?biāo)幉⒂玫难芯肯鄬?duì)較少，且作用機(jī)制不明確。本研究以ApoE 基因敲除小鼠作為研究對(duì)象，觀察化痰祛瘀法針?biāo)幉⒂脤?duì)ApoE 基因敲除小鼠認(rèn)知功能的影響，探討其可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、實(shí)驗(yàn)藥品、主要試劑和儀器選取50 只SPF 級(jí)8 周齡ApoE 基因敲除小鼠和10 只同齡具有相同遺傳背景的C57BL/6J 小鼠，體質(zhì)量18～22 g，所有小鼠均購(gòu)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK （京） 2012-0001，雌雄各半，分籠飼養(yǎng)。飼養(yǎng)于遼寧中醫(yī)藥大學(xué)SPF 級(jí)動(dòng)物中心，自由攝食與飲水，飼養(yǎng)環(huán)境：溫度22℃， 相對(duì)濕度40%～45%。 高脂飼料由膽固醇、蔗糖、蛋黃粉、豬油、膽鹽和基礎(chǔ)飼料等組成，由遼寧省沈陽(yáng)市于洪區(qū)前民動(dòng)物實(shí)驗(yàn)飼料廠加工制成。二陳湯和桃紅四物湯購(gòu)于遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院。全部藥物加水浸泡1 h 后，先武火煎煮沸騰后調(diào)至文火煎煮，每份藥物煎煮3 次，混合后濃縮為分別含 有 生 藥 量 為 0.72 、 1.44 和2.89 g·L－1的煎劑，保存于4℃冰箱中備用。磷脂酰 肌 醇-3- 激 酶 （phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K）、蛋白激酶B （protein kinase B，AKT） 和哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mamalian target of repamycin，mTOR） 一抗（美國(guó)Abcam 公司），β -actin 一抗、免疫組織化學(xué)SP 試劑盒和DAB 顯色劑和辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗（北京中杉金橋公司），蘇木素、WB 和IP 細(xì)胞裂解液（上海碧云天公司）， ECL 超敏發(fā)光試劑盒（美國(guó)Thermo 公司）。 中研太和牌一次性使用無(wú)菌針灸針（0.25 mm×13.00 mm，北京健樂(lè)康醫(yī)持器械有限公司），Morris 水迷宮由遼寧中醫(yī)藥大學(xué)重大科研平臺(tái)動(dòng)物行為學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供， EPS300 型電泳儀（意大利SCOTSMAN 公司），VE-180 型電泳槽和VE-186 型轉(zhuǎn)膜儀（上海天能公司），LX300 型微量離心機(jī)和TS-1000 水平搖床（江蘇省海門市其林貝爾儀器制造有限公司），高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)（安徽嘉文儀器裝備有限公司）， 數(shù)碼顯微鏡（日本Olympus 公司），透射電鏡（型號(hào)H-7650，日本日立公司）。

1.2實(shí)驗(yàn)分組和造模50 只8 周齡ApoE 基因敲除小鼠以高脂飼料喂養(yǎng)， 16 周后ApoE 基因敲除小鼠隨機(jī)分為模型組、低劑量中藥組、高劑量中藥組、針?biāo)幗M和針刺組，每組10 只；10 只同齡C57BL/6L 小鼠以普通飼料喂養(yǎng)，作為對(duì)照組。ApoE 基因敲除小鼠繼續(xù)給予高脂飼料喂養(yǎng)，同時(shí)施加干預(yù)因素；C57BL/6J 小鼠繼續(xù)給予普通飼料喂養(yǎng)，不進(jìn)行干預(yù)。

1.3各組小鼠給藥方式從第17 周開始，低劑量中藥組和高劑量中藥組小鼠分別于單日給予含有生藥 量 為0.72 和2.89 g·mL－1中 藥 煎 劑 灌 胃， 每 次0.2 mL；雙日以膠帶固定于木板上，持續(xù)15 min。針?biāo)幗M小鼠單日給予含有生藥量為1.44 g·mL－1（相當(dāng)于中劑量中藥組，各劑量組間給藥劑量間距依據(jù)《藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)》，設(shè)定為彼此2 倍關(guān)系）中藥煎劑灌胃，每次0.2 mL；同時(shí)雙日以膠帶固定于木板上，并予以針刺百會(huì)、關(guān)元和豐隆穴，每次針刺15 min 干預(yù)。針刺組小鼠單日經(jīng)口灌胃蒸餾水0.2 mL； 雙日以膠帶固定， 并給予針刺干預(yù)，方法同針?biāo)幗M。模型組小鼠單日每只給予0.2 mL蒸餾水灌胃；雙日以膠帶固定于木板上， 持續(xù)15 min。對(duì)照組不進(jìn)行處理。上述各組小鼠的干預(yù)方法共計(jì)持續(xù)8 周。

針刺取穴：采用膠帶將小鼠固定于木板上，仰臥位，依照《常用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物穴位的標(biāo)準(zhǔn)化定位方法研究》［10］，選取百會(huì)、關(guān)元和豐隆穴。百會(huì)向后平刺2～3 mm， 關(guān) 元 穴 向 恥 骨 聯(lián) 合 方 向45° 斜 刺1.5 mm，豐隆直刺3.0 mm。

1.4樣本采集末次干預(yù)后1 h，采用水迷宮方法檢測(cè)各組小鼠認(rèn)知功能。水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，所有小鼠采用過(guò)量麻醉法處死，置于冰盤上，開顱取腦。將所取腦組織分為左腦和右腦，每組隨機(jī)選取2 只小鼠左腦海馬組織，切成1 mm×1 mm×1 mm組織塊，固定于2.5% 戊二醛溶液中，用于電鏡觀察自噬體；剩余8 只小鼠的左腦浸泡于4% 多聚甲醛溶液中，用于免疫組織化學(xué)檢測(cè)；從所有小鼠的右腦中分離海馬組織， 置于1.5 mL 凍存管中，－ 80℃冰 箱 保 存， 用 于Western blotting 法檢測(cè)。

1.5水迷宮實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組小鼠逃避潛伏期采用Morris 水迷宮實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組小鼠逃避潛伏期，評(píng)估小鼠空間學(xué)習(xí)和記憶能力。 將小鼠放置在充滿水（21 ℃～22 ℃，通過(guò)添加奶粉使其不透明） 的圓形池（直徑104 cm） 中的不同起始位置。 訓(xùn)練各組小鼠尋找平臺(tái)（直徑8 cm），該平臺(tái)通過(guò)使用遠(yuǎn)距離視覺提示淹沒在水面以下1 cm 處，并位于水池的西北象限中。 視覺提示出現(xiàn)在水池周圍的四壁上，距離為0.5 m。 在所有實(shí)驗(yàn)中，視覺觀察者均在房間中，并且始終位于同一位置（在圍繞設(shè)備的窗簾后面）。連續(xù)5 d， 小鼠每天進(jìn)行3 次采集試驗(yàn)（60 s 內(nèi)小鼠爬上平臺(tái)并停留≥5 s，則本次測(cè)試結(jié)束，所經(jīng)歷時(shí)間記作本次實(shí)驗(yàn)的逃避潛伏期。若在60 s 內(nèi)小鼠未找到平臺(tái)，則潛伏期記作60 s，并將小鼠放上平臺(tái)，停留10 s，便于小鼠學(xué)習(xí)與適應(yīng)。最后將小鼠擦拭干凈置入鼠籠）。起始位置是隨機(jī)選取除目標(biāo)象限的任一象限，按照上述方法從入水象限順時(shí)針?lè)较颍ǔ繕?biāo)平臺(tái)所在象限以外） 依次對(duì)各象限進(jìn)行記錄，記錄小鼠尋找平臺(tái)的時(shí)間，即逃避潛伏期。

1.6各組小鼠海馬組織的超微結(jié)構(gòu)觀察水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)束之后，所有實(shí)驗(yàn)小鼠采用0.3% 戊巴比妥鈉（30 mg·kg－1） 腹腔注射麻醉后將小鼠仰臥，四肢固定于手術(shù)臺(tái)上，暴露胸腹部，常規(guī)消毒，開胸進(jìn)行心尖快速灌注0.9% 氯化鈉溶液，觀察肝臟顏色至白色后停止灌注，在冰盤上開顱取腦。將所取腦組織分別按照電鏡檢測(cè)、 免疫組織化學(xué)和Western blotting 樣本要求制備，然后置于－80℃冰箱保存待檢。取每組5 只小鼠的海馬組織切成1 mm×1 mm×1 mm 的組織中，置于含2.5%戊二醛的緩沖液（4 ℃、pH 7.4） 中固定4 h，經(jīng)漂洗、脫水和浸透后，常規(guī)電鏡包埋，超薄切片，片厚80 nm，每組每只小鼠海馬組織切5 張切片，每張切片隨機(jī)選取3～5 個(gè)視野。并在醋酸雙氧鈾及檸檬酸鉛雙重染色后，在透射電鏡下觀察自噬泡、自噬溶酶體和溶酶體的形態(tài)表現(xiàn)。

1.7 Western blotting法檢測(cè)各組小鼠海馬組織中PI3K、AKT和mTOR蛋白表達(dá)水平取出各組小鼠的海馬組織，自然融化，于100 mg 海馬組織加入1 mL 裂解緩沖液， 研磨均勻后靜置30 min，4 ℃、1 2000 r·min－1離心15 min，取上清液。測(cè)定蛋白濃度，然后按1∶4 的比例加入5×SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液，混勻，100℃水浴鍋加熱5 min，充分變性蛋白。 SDS-PAGE 電泳， 轉(zhuǎn)膜， 漂洗5 min，5% 脫脂奶粉室溫封閉處理1 h。分別加入相應(yīng)的抗體孵育（PI3K 稀釋度為1∶400；AKT 稀釋度為1∶500；mTOR 稀釋度為1∶200），緩慢搖動(dòng)，4 ℃孵育過(guò)夜。次日洗膜后， 加入二抗（1∶1 500）， 室 溫 孵 育2 h。 加 入 洗 滌 液 TBST ，10 min×3 次。將PVDF 膜放置于凝膠成像分析系統(tǒng)中，避光配置ECL 發(fā)光液，并滴加在PVDF 膜上，反應(yīng)1 min。采用凝膠成像分析系統(tǒng)自帶分析軟件測(cè)定條帶的灰度值，以各目的蛋白與內(nèi)參蛋白β-actin 條帶灰度值的比值作為該蛋白表達(dá)水平。

1.8免疫組織化學(xué)法檢測(cè)各組小鼠腦組織中PI3K、AKT和mTOR蛋白表達(dá)水平取多聚甲醛固定的各組小鼠腦組織，經(jīng)自來(lái)水充分沖洗，常規(guī)脫水、浸蠟和包埋，制備石蠟塊，然后以石蠟切片機(jī)將石蠟塊進(jìn)行冠狀位連續(xù)切片，切片厚度5 μm，撈片后60 ℃烤片2 h， 常規(guī)脫蠟后， 進(jìn)行抗原修復(fù)，采用免疫組織化學(xué)SP 法檢測(cè)各組小鼠腦組織中PI3K、 Akt 和mTOR 的表達(dá)。 PI3K、 AKT 和mTOR 一抗稀釋度為1∶300，4 ℃過(guò)夜；次日洗片后，孵育二抗工作液，室溫下孵育60 min，PBS緩沖液洗片后，DAB 顯色，蘇木精復(fù)染，1% 鹽酸乙醇分化，透明、脫水后中性樹膠封片。檢測(cè)吸光度（A） 值，并以A 值代表各蛋白表達(dá)水平。

1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 21.0 統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。各組小鼠逃避潛伏期和小鼠海馬組織中PI3K、AKT 及mTOR 蛋白表達(dá)水平均呈正態(tài)分布，以±s表示，多組間樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1各組小鼠逃避潛伏期Morris 水迷宮定位航行實(shí)驗(yàn)中，隨著學(xué)習(xí)天數(shù)的增加，每組小鼠逃避潛伏期均縮短。模型組小鼠逃避潛伏期均長(zhǎng)于對(duì)照組（P＜0.05）；與模型組比較，針?biāo)幗M小鼠的逃避潛伏期明顯縮短（P＜0.05）。見圖1。

圖1 各組小鼠逃避潛伏期Fig.1 Escape latency time of mice in various groups

2.2各組小鼠海馬組織超微結(jié)構(gòu)電鏡下可見對(duì)照組小鼠海馬神經(jīng)元結(jié)構(gòu)清晰，線粒體結(jié)構(gòu)完整，核膜光滑，可見自噬泡；與對(duì)照組比較，模型組小鼠海馬組織中線粒體腫脹，核膜粗糙不完整，線粒體嵴斷裂變形，自噬泡減少；與模型組比較，中藥組、針?biāo)幗M和針刺組小鼠海馬組織中可見神經(jīng)元部分不規(guī)則變形、萎縮，胞質(zhì)內(nèi)可見較多自噬泡，病理改變均有改善， 尤以針?biāo)幗M減輕最為明顯。見圖2。

2.3 Western blotting法檢測(cè)各組小鼠海馬組織中PI3K、AKT和mTOR蛋白表達(dá)水平與對(duì)照組比較， 其余各組小鼠海馬組織中PI3K、 AKT 和mTOR 蛋白表達(dá)水平明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，各劑量中藥組、針刺組和針?biāo)幗M小鼠海馬組織中PI3K、AKT 和mTOR 蛋白表達(dá)水平明顯降低（P＜0.05）。見圖3 和圖4。

2.4免疫組織化學(xué)法檢測(cè)各組小鼠海馬組織中PI3K、AKT和mTOR蛋白表達(dá)水平與對(duì)照組比較， 其余各組小鼠海馬組織中PI3K、 AKT 和mTOR 蛋白表達(dá)水平明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，各劑量中藥組、針刺組和針?biāo)幗M小鼠海馬組織中PI3K、AKT 和mTOR 蛋白表達(dá)水平明顯降低（P＜0.05）。各蛋白表達(dá)水平見圖5，各蛋白表達(dá)情況見圖6～圖8 （插頁(yè)一和插頁(yè)二）。

3 討 論

ApoE 缺陷型小鼠顯示出促動(dòng)脈粥樣硬化的脂蛋白譜，最終導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化。當(dāng)飼喂高脂飲食時(shí)，ApoE 缺陷型小鼠表現(xiàn)出血腦屏障功能障礙和神經(jīng)退行性變的跡象［11-12］，出現(xiàn)認(rèn)知功能障礙，已被驗(yàn)證為實(shí)驗(yàn)性AD 模型［13］。 本課題組前期研究［14］ 顯示：ApoE 基因敲除小鼠認(rèn)知能力的降低與海馬內(nèi)自噬受損有關(guān)。針?biāo)幉⒂脤?duì)ApoE 基因敲除小鼠進(jìn)行干預(yù)可通過(guò)上調(diào)小鼠海馬組織中自噬水平從而改善其認(rèn)知功能。

圖2 透射電鏡下觀察各組小鼠海馬組織超微結(jié)構(gòu)（×20 000）Fig.2 Ultrastructures of hippocampus tissue of mice in various groups observed under transmission electron microscope(×20 000)

圖3 各組小鼠海馬組織中PI3K、AKT 和mTOR 蛋白表達(dá)電泳圖Fig.3 Electrophoregram of expressions of PI3K, AKT,and mTOR proteins in hippocampus tissue of mice in various groups

圖4 各組小鼠海馬組織中PI3K、AKT 和mTOR 蛋白表達(dá)水平Fig.4 Expression levels of PI3K, AKT，and mTOR proteins in hippocampus tissue of mice in various groups

圖5 各組小鼠海馬組織中PI3K、AKT 和mTOR 蛋白表達(dá)水平Fig.5 Expression levels of PI3K, AKT, and mTOR proteins in hippocampus tissue of mice in various groups

基于痰瘀互結(jié)為認(rèn)知功能障礙的發(fā)病關(guān)鍵。本研究采用針?biāo)幉⒂靡?“化痰祛瘀，醒腦開竅”。二陳湯燥濕化痰、理氣和中，桃紅四物湯養(yǎng)血活血、祛瘀生新?；谔叼鐾瑢儆陉?，同氣相求，相互為病，使疾病遷延難愈。因此治療時(shí)多聯(lián)合應(yīng)用二陳湯和桃紅四物湯［14-15］。百會(huì)、關(guān)元二穴，一陰一陽(yáng)，配伍為用，通達(dá)督任，使血脈充盈，腎精充沛，腦髓得養(yǎng)，共奏益髓健腦之功。豐隆為 “祛痰要穴”，有 “間接入腦” 一說(shuō)，針刺豐隆可抑制炎癥因子的釋放，改善脂代謝，同時(shí)，也常用來(lái)治療認(rèn)知功能障礙疾病［16-17］。針?biāo)幉⑴e，內(nèi)外兼治，起到事半功倍的效果。中醫(yī)認(rèn)為痰為濁邪，而心神性清凈，故痰濁致病，易蒙蔽清竅，阻遏清陽(yáng)，而致健忘，癡呆。清代陳士鐸云認(rèn)識(shí)到：“痰積于胸中，盤踞于心外， 使神明不清而成呆病矣”、 并提出“治呆無(wú)奇法，治痰即治呆?！?而大臨床上多應(yīng)用具有化痰開竅作用的方劑如溫膽湯、 滌痰湯治療AD，且療效突出［18］。同時(shí)，《傷寒論》 曰：“陽(yáng)明病，使人善忘者，必有蓄血，所以然者，本有久瘀血”。治療以抵當(dāng)湯，祛逐瘀血，使氣血得以榮養(yǎng)腦髓，使腦絡(luò)復(fù)暢?！夺t(yī)林改錯(cuò)》 中也提到：“凡有瘀血皆令人善忘”。均證明血瘀也是本病形成的重要原因之一。痰濁與瘀血，由津液和血液運(yùn)化失常所產(chǎn)生的病理產(chǎn)物，“津血同源”，故 “痰瘀同源”。痰瘀互為因果，相互影響，常相兼為病，進(jìn)一步加重氣血運(yùn)行障礙，使疾病遷延難愈?！疤怠?和 “瘀” 為AD 病機(jī)的關(guān)鍵因素［19］。越來(lái)越多的證據(jù)表明，自噬功能障礙與異常的蛋白聚集所致的神經(jīng)退行性疾病（如AD） 密切相關(guān)［20］。當(dāng)自噬的調(diào)節(jié)能力下降時(shí)，影響細(xì)胞識(shí)別及降解受損線粒體的能力，從而使破損或衰老的細(xì)胞器、長(zhǎng)壽命蛋白質(zhì)、錯(cuò)誤合成或折疊錯(cuò)誤的蛋白質(zhì)等物質(zhì)的過(guò)度堆積，最終產(chǎn)生病理性產(chǎn)物 “垃圾”。這一病理過(guò)程與中醫(yī)的內(nèi)生痰濁瘀血過(guò)程相同。

實(shí)驗(yàn)小鼠因ApoE 基因被敲除而更容易出現(xiàn)脂質(zhì)代謝紊亂，血脂異常堆積使得發(fā)生血管內(nèi)皮炎性損傷進(jìn)而受到氧化應(yīng)激的損害，最終出現(xiàn)認(rèn)知功能障礙。本研究采用Morris 水迷宮檢測(cè)小鼠水中學(xué)習(xí)尋找隱藏平臺(tái)的能力，以此來(lái)判定小鼠的空間學(xué)習(xí)和記憶能力。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：對(duì)照組小鼠游泳動(dòng)作嫻熟，速度快，往往很快就能找到平臺(tái)，即對(duì)照組小鼠的學(xué)習(xí)及記憶能力強(qiáng)； ApoE 基因敲除的模型組小鼠游泳動(dòng)作笨拙，速度慢，需要花長(zhǎng)時(shí)間才能找到平臺(tái)，說(shuō)明ApoE 基因與記憶認(rèn)知能力有相關(guān)性。張 寧 等［21］發(fā) 現(xiàn)：ApoE 基 因 敲 除 小 鼠 海 馬 神經(jīng)組織中Aβ 表達(dá)水平明顯高于正常小鼠，ApoE 基因的異常表達(dá)與AD 的發(fā)病有密切關(guān)系。經(jīng)過(guò)針?biāo)幉⒂酶深A(yù)后，小鼠逃避潛伏期縮短，證明基于化痰祛瘀法的針?biāo)幉⒂酶深A(yù)方案能夠改善APOE 基因敲除小鼠的認(rèn)知功能。

研 究［22］證 明：損 害 神 經(jīng) 元 的Aβ 異 常 沉 積 是誘導(dǎo)AD 發(fā)生發(fā)展的核心因素，而AD 患者腦組織中均有不同程度自噬功能的損傷，無(wú)法及時(shí)減少Aβ 的生成和清除Aβ，最終引發(fā)AD。電鏡下觀察小鼠海馬的超微結(jié)構(gòu)結(jié)果顯示：對(duì)照組小鼠海馬內(nèi)細(xì)胞器豐富且有大量的自噬泡和溶酶體；ApoE 基因敲除小鼠海馬內(nèi)的自噬泡和溶酶體的數(shù)量減少，提示ApoE 基因敲除可能損害了小鼠海馬組織中神經(jīng)元，并且自噬過(guò)程發(fā)生了異常變化；而經(jīng)過(guò)針?biāo)幐深A(yù)后，海馬組織中的自噬泡及溶酶體數(shù)量增多，提示針?biāo)幐深A(yù)可以增強(qiáng)自噬途徑以此來(lái)改善ApoE基因敲除小鼠的學(xué)習(xí)和記憶能力。為探討可能的作用機(jī)制，本研究采用Western blotting 和免疫組織化學(xué)法檢測(cè)各組小鼠海馬組織中PI3K、 AKT 和mTOR 蛋白的表達(dá)情況。

PI3K/AKT/mTOR 信號(hào)通路作為與細(xì)胞自噬密切相關(guān)的轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，參與和調(diào)節(jié)許多細(xì)胞活性，如細(xì)胞存活、增殖和生長(zhǎng)等［23］。PI3K 分為Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型，而PI3K/AKT/mTOR 通路是指Ⅰ型PI3K，PI3K 作為自噬的負(fù)調(diào)節(jié)因子，其磷酸化水平在調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和死亡中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。AKT 參與各種信號(hào)通路的調(diào)節(jié)， 包括細(xì)胞增殖、生長(zhǎng)、存活、血管生成和化療耐藥等［24］，AKT是PI3K 的下游效應(yīng)子和mTOR 的上游調(diào)節(jié)分子。mTOR 作為AKT 的直接靶點(diǎn)，被AKT 磷酸化激活后，不同的下游通路得到調(diào)控，特定的蛋白質(zhì)合成得到控制，進(jìn)而參與了細(xì)胞的自噬和凋亡。此外，mTOR 可抑制自噬體復(fù)合物形成所需的相關(guān)蛋白，從而抑制自噬，被認(rèn)為是自噬的負(fù)調(diào)節(jié)物。多數(shù)藥物通過(guò)下調(diào)PI3K/Akt/mTOR 途徑或抑制mTOR 從而誘導(dǎo)自噬［25-26］。本研究結(jié)果顯示：模型組小鼠海馬組織中PI3K、AKT 和mTOR 蛋白表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組，說(shuō)明ApoE 基因敲除小鼠PI3K/AKT/mTOR 的信號(hào)通路被激活，該結(jié)果與張利達(dá)等［27］的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。采用針?biāo)幉⒂酶深A(yù)后，針?biāo)幗M小鼠海馬組織中PI3K、AKT 和mTOR的蛋白表達(dá)明顯低于模型組，由此推測(cè)化痰祛瘀法針?biāo)幉⒂每赡芡ㄟ^(guò)抑制PI3K/AKT/mTOR 的信號(hào)通路來(lái)增強(qiáng)細(xì)胞自噬現(xiàn)象，以此改善認(rèn)知障礙。

綜上所述， 化痰祛瘀法針?biāo)幉⒂每梢陨险{(diào)PI3K、AKT 和mTOR 蛋白表達(dá)水平，抑制PI3K/AKT/mTOR 信號(hào)通路的異常激活，緩解或增強(qiáng)細(xì)胞的自噬途徑作用， 以此達(dá)到恢復(fù)認(rèn)知能力的作用。