金芳多, 張 天, 張 釗, 尹學(xué)哲, 全吉淑

（延邊大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，吉林 延吉 133002）

氧化應(yīng)激損傷是肝損傷發(fā)生過(guò)程中的重要機(jī)制和 環(huán) 節(jié)［1］。 叔 丁 基 過(guò) 氧 化 氫 （tert-butyl hydroperoxide， TBHP） 是一種較穩(wěn)定的氧化劑，通常用于體內(nèi)外誘導(dǎo)氧化應(yīng)激損傷，本研究利用TBHP 建立人肝癌HepG2 細(xì)胞的氧化損傷模型。蘆丁是從植物中提取的天然黃酮類化合物，是天然的抗氧化劑，具有抗氧化、抗自由基、舒張血管、神經(jīng)保護(hù)和保肝等多種藥理作用［2-3］。蘆丁作為傳統(tǒng)的中草藥，近年來(lái)引起國(guó)內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注，因其具有強(qiáng)烈的抗氧化性和較少的不良反應(yīng)，被廣泛應(yīng)用于臨床中，目前主要用于治療高血壓、糖尿病和心血管疾病等。既往研究［4］顯示：蘆丁可以通過(guò)調(diào)節(jié)信號(hào)通路、抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡發(fā)揮其抗腫瘤作用，有研究［5］顯示：蘆丁能增加磷脂酰肌醇-3 激酶（phosphoinositol 3 kinase，PI3K）、蛋白激酶B （protein kinase B，Akt） 和哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin， mTOR） 信號(hào)通路的活化程度， 并能通過(guò)增加抗氧化應(yīng)激酶的表達(dá)來(lái)進(jìn)一步降低氧化應(yīng)激的水平，對(duì)神經(jīng)細(xì)胞、胃癌細(xì)胞和心肌細(xì)胞等均有一定的保護(hù)作用，但有關(guān)蘆丁抑制肝細(xì)胞氧化損傷的作用及其機(jī)制尚缺乏深入的系統(tǒng)性研究。本研究通過(guò)探討蘆丁對(duì)肝細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用，為蘆丁的臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞、主要試劑和儀器人肝癌HepG2 細(xì)胞購(gòu)自延邊大學(xué)附屬醫(yī)院細(xì)胞庫(kù)提供。蘆丁購(gòu)自阿拉丁試劑公司， 高糖DMEM 培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gemini 公司，胰蛋白酶購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich 公司， 四甲基偶氮唑鹽（methyl thiazolyl terrazolium， MTT） 購(gòu) 自 美 國(guó)Sigma-Aldrich 公 司， 丙 二 醛（malondialdehyde，MDA） 試劑盒、 超氧化物歧化酶（superoxide dismutase， SOD） 試劑盒和還原型谷胱甘肽（reduced glutathione， GSH） 試劑盒購(gòu)自南京建成科 技 有 限 公 司， 活 性 氧 （reactive oxidative species， ROS） 檢測(cè)試劑盒購(gòu)自廣州碧云天生物技術(shù)有限公司，PI3K 抗體、Akt 抗體和核轉(zhuǎn)錄因子κB （nuclear factor kappa B， NF-κB） 抗體、 腫瘤抑制基因p53 抗體購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology 公司。 酶標(biāo)儀購(gòu)自深圳雷杜公司，IX70-7721 倒置顯微鏡購(gòu)自日本Olympus 公司，DYCZ-24DN 電泳儀購(gòu)自北京市六一儀器廠，UVP凝膠成像儀購(gòu)自美國(guó)UVP 公司，高速冷凍離心機(jī)購(gòu)自德國(guó)Eppendorf 公司。

1.2肝癌HepG2細(xì)胞培養(yǎng)和分組取增殖活躍并處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的肝癌HepG2 細(xì)胞，將其分為對(duì)照組、TBHP 組和0.25、0.50、1.00 μmol·L－1蘆丁組。對(duì)照組細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)，TBHP 組細(xì)胞加入含終 濃 度 為400 μmol·L－1TBHP 的 無(wú) 血 清 培 養(yǎng) 液，培養(yǎng)細(xì)胞4 h，建立氧化損傷模型；0.25、0.50 和1.00 μmol·L－1蘆丁組先分別使用含0.25、0.50 和1.00 μmol·L－1蘆丁的培養(yǎng)液預(yù)處理24 h （蘆丁用DMSO 預(yù)溶，DMSO 體積不超過(guò)總體積的0.3%，采用DMEM 培養(yǎng)液稀釋至所需的溶液濃度），再采用含400 μmol·L－1TBHP 的無(wú)血清培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞4 h。

1.3 MTT法檢測(cè)各組肝癌HepG2細(xì)胞活性將細(xì)胞接種于96 孔板中，待細(xì)胞貼壁后，換入含蘆丁的無(wú)血清培養(yǎng)液，使其濃度分別為0.25、0.50、1.00、2.00 和4.00 μmol·L－1，并設(shè)置對(duì)應(yīng)的空白對(duì)照組。對(duì)照組添加無(wú)血清培養(yǎng)液，空白對(duì)照組添加不含細(xì)胞的培養(yǎng)液。作用細(xì)胞24 h 后，棄去上清。每孔加入20 μL MTT 溶液。MTT 溶液作用細(xì)胞4 h 后，吸取上清，每孔依次加入150 μL DMSO溶液，混勻溶解，待生成的藍(lán)紫色結(jié)晶完全溶解后，置于酶標(biāo)儀492 nm 波長(zhǎng)處測(cè)得各組吸光度（A） 值，計(jì)算細(xì)胞活性。細(xì)胞活性= （實(shí)驗(yàn)孔A 值－實(shí)驗(yàn)空白孔A 值） ／ （對(duì)照孔A 值－空白對(duì)照孔A 值） ×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.4 MTT法檢測(cè)各組肝癌HepG2細(xì)胞存活率將細(xì)胞接種于96 孔板中，按照上述實(shí)驗(yàn)分組分為對(duì) 照 組、 TBHP 組和0.25、 0.50、 1.00 μmol·L－1蘆丁組，并對(duì)各個(gè)實(shí)驗(yàn)組設(shè)置空白對(duì)照。細(xì)胞按上述方法處理后，吸取上清，每孔加入20 μL MTT溶液， 作用細(xì)胞4 h 后， 吸 取 上 清， 每 孔 加 入150 μL DMSO 溶液，振蕩混勻，待生成藍(lán)紫色結(jié)晶并完全溶解后，置于酶標(biāo)儀492 nm 波長(zhǎng)處測(cè)得各組A 值。細(xì)胞存活率＝（實(shí)驗(yàn)孔A 值－實(shí)驗(yàn)空白孔A 值） ／ （對(duì)照孔A 值－空白對(duì)照孔A 值） ×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.5比色法檢測(cè)各組肝癌HepG2細(xì)胞中MDA和GSH水平及SOD活性按上述實(shí)驗(yàn)方法處理細(xì)胞后，棄去原上清培養(yǎng)液，胰酶消化細(xì)胞，將培養(yǎng)液在室溫條件下1 000 r·min－1，離心10 min 并收集細(xì)胞沉淀，在細(xì)胞沉淀中加入0.5～1.0 mL 等滲磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer solution， PBS），在室溫條件下離心10 min 沉降細(xì)胞。棄上清，留細(xì)胞沉淀。加入0.5～1.0 mL PBS，冰水浴下手動(dòng)勻漿破碎細(xì)胞3 min，取破碎后細(xì)胞勻漿液待用，后按試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟進(jìn)行操作。計(jì)算方法：MDA 水平（μmol·L－1） = （測(cè)定管A 值－測(cè)定空白管A 值） /（標(biāo)準(zhǔn)管A 值－ 標(biāo)準(zhǔn)空白管A 值） × 標(biāo)準(zhǔn)品濃度（10 μmol·L－1） × 樣 本 稀 釋 前 倍 數(shù)； SOD 活 性（U·mL－1） = （對(duì)照管A 值－測(cè)定管A 值） /（對(duì)照管A 值） /50%×反應(yīng)體積的稀釋倍數(shù)×樣本測(cè)試前的稀釋倍數(shù)； GSH 水平（μmol·g－1） = （測(cè)定 孔A 值－ 空 白孔A 值） / （標(biāo) 準(zhǔn) 孔A 值－ 空 白孔A 值） ×樣本前處理稀釋倍數(shù)（2 倍） /待測(cè)勻漿蛋白濃度（g·L－1）。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.6熒光顯微鏡檢測(cè)各組肝癌HepG2細(xì)胞中ROS水平將細(xì)胞接種于6 孔板中， 分組處理方法同“1.2” 步驟。按照1∶1 000 的比例采用無(wú)血清培養(yǎng)液 稀 釋DCFH-DA， 使 其 終 濃 度 為10 μmol·L－1，去除細(xì)胞培養(yǎng)液，每孔加入1 mL DCFH-DA 稀釋液，置于37℃培養(yǎng)箱孵育20 min，以裝載探針，然后采用無(wú)血清細(xì)胞培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞3 次， 每孔1 mL，去除細(xì)胞中殘留的DCFH-DA，置于熒光顯微鏡下采用488 nm 激發(fā)波長(zhǎng)和525 nm 發(fā)射波長(zhǎng)觀察細(xì)胞形態(tài)表現(xiàn)，以細(xì)胞中綠色熒光強(qiáng)度表示ROS 水平。

1.7 Western blotting法檢測(cè)各組肝癌HepG2細(xì)胞中相關(guān)蛋白表達(dá)水平按照 “1.2” 步驟中方法進(jìn)行分組和給藥，藥物作用完畢后收集細(xì)胞。提取細(xì)胞總蛋白后，采用BCA 法測(cè)定蛋白濃度。配置濃縮膠和10% 分離膠進(jìn)行電泳分離蛋白，統(tǒng)一蛋白上樣量20 μg，電轉(zhuǎn)移至聚偏乙烯PVDF 膜上，轉(zhuǎn)膜過(guò)后， 采用含5% 脫脂奶粉的TBST 封閉2 h。采用TBST 洗脫P(yáng)VDF 膜，加入一抗孵育4℃過(guò)夜。次日經(jīng)TBST 洗脫抗體后，置于二抗中室溫孵育1～2 h，然后采用TBST 洗脫P(yáng)VDF 膜。并將膜浸泡于顯影液中顯影曝光，UVP 凝膠成像分析儀中采集圖像，采用Image J 進(jìn)行灰度分析，以β-actin作為內(nèi)參對(duì)照， 計(jì) 算 PI3K 、 磷 酸 化 PI3K（ p-PI3K）、 Akt、 磷 酸 化Akt （p-Akt）、 NF- κB、磷酸化NF-κB （p-NF-κB） 及p53 蛋白表達(dá)水平。目的蛋白表達(dá)水平=目的蛋白條帶灰度值/β-actin條帶灰度值。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 20.0 和GraphPad Prism 7.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。各組HepG2細(xì)胞存活率、肝癌HepG2 細(xì)胞中MDA 和GSH 水平及SOD 活性以及HePG2 細(xì)胞中PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt、NF-κB、p-NF-κB 和p53 蛋 白 表達(dá)水平均符合正態(tài)分布，以±s表示，多組間樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，兩組樣本均數(shù)比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。 以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1各組HepG2細(xì)胞活性當(dāng)蘆丁摩爾濃度≤1.00 μmol·L－1時(shí)，HepG2 細(xì)胞的存活率均＞90%，與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；蘆丁摩爾濃度＞1.00 μmol·L－1后，細(xì)胞存活率逐漸降 低。 因此本實(shí)驗(yàn)選取0.25、0.50和1.00 μmol·L－1蘆丁作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的干預(yù)劑量。見(jiàn)圖1。

2.2各組肝癌HepG2細(xì)胞存活率與對(duì)照組比較， TBHP 組肝癌HepG2 細(xì)胞存活率明顯降低，接近半數(shù)抑制率（P＜0.01）；與TBHP 組比較，各濃度蘆丁組肝癌HepG2 細(xì)胞存活率逐漸升高，1.00 μmol·L 蘆 丁 組 肝 癌HepG2 細(xì) 胞 存 活 率 最 高（P＜0.01）。見(jiàn)表1。

圖1 各組肝癌HepG2 細(xì)胞活性Fig.1 Cell vitalities of liver cancer HepG2 cells in various groups

表1 各組肝癌HepG2 細(xì)胞存活率Tab.1 Survival rates of liver cancer HepG2 cells in viarous groups （n=3±s）

表1 各組肝癌HepG2 細(xì)胞存活率Tab.1 Survival rates of liver cancer HepG2 cells in viarous groups （n=3±s）

*P＜0.01 compared with control group；△P＜0.05， △△P＜0.01 compared with TBHP group.

Group Control TBHP Rutin Dose（μmol·L－1）400 0.25 0.50 1.00 A value 0.94±0.01 0.518±0.04 0.551±0.05 0.63±0.09 0.699±0.03 Survival rate（η/%）100.00±0.00 48.68±1.74*58.34±0.91△60.72±0.68△△66.84±2.12△△

2.3各組HepG2細(xì)胞中MDA和GSH水平及SOD活性對(duì)照組肝癌HepG2 細(xì)胞MDA 水平較低， GSH 水平和SOD 活性較高；與對(duì)照組比較，TBHP 組 肝 癌HepG2 細(xì) 胞MDA 水 平 升 高（P＜0.01）， GSH 水 平 和SOD 活 性 明 顯 降 低（P＜0.01）； 與TBHP 組 比 較， 不 同 濃 度 蘆 丁 組 肝 癌HepG2 細(xì)胞中MDA 水平逐漸降低（P＜0.01），GSH 水平和SOD 活性均明顯升高（P＜0.05 或P＜0.01）。見(jiàn)表2。

表2 各組HepG2 細(xì)胞中MDA 和GSH 水平及SOD 活性Tab.2 Levels of MDA and GSH and activity of SOD in HepG2 in various groups （n=3，±s）

表2 各組HepG2 細(xì)胞中MDA 和GSH 水平及SOD 活性Tab.2 Levels of MDA and GSH and activity of SOD in HepG2 in various groups （n=3，±s）

*P＜0.01 compared with control group；△P＜0.05，△△P＜0.01 compared with TBHP group.

Group Control TBHP Rutin 1.00 Dose[cB/(μmol·L－1)]400 0.25 0.50 MDA[cB/(μmol·L－1)]8.95±0.07 13.57±0.00*11.27±0.02△△10.02±0.03△△8.89±0.05△△SOD[λB/(U·mL－1)]49.31±0.57 10.49±0.07*16.44±0.79△24.37±0.43△△34.85±1.50△△GSH[mB/(μmol·g－1)]14.67±0.30 4.66±0.24*7.32±0.03△9.12±0.32△△13.65±0.80△△

2.4各組肝癌HepG2細(xì)胞中ROS水平對(duì)照組肝癌HepG2 細(xì)胞生成的綠色熒光微弱，幾乎看不見(jiàn)細(xì)胞被染色； 與對(duì)照組比較， TBHP 組肝癌HepG2 細(xì)胞生成的綠色熒光強(qiáng)度明顯增加，說(shuō)明HepG2 細(xì)胞中ROS 水平升高，被染色的細(xì)胞數(shù)增加；與TBHP 組比較， 0.25、0.50和1.00 μmol·L－1蘆丁組肝癌HepG2 細(xì)胞熒光強(qiáng)度呈減弱的趨勢(shì)，說(shuō)明HepG2 細(xì)胞中ROS 水平降低，被染色的細(xì)胞數(shù)逐漸減少。見(jiàn)圖2 （插頁(yè)一）。

2.5各組肝癌HepG2細(xì)胞中PI3K/Akt信號(hào)通路蛋白的表達(dá)水平

與對(duì)照組比較，TBHP 組肝癌HepG2 細(xì)胞中PI3K 和p-PI3K 蛋白表達(dá)水平明顯降低（P＜0.05）， Akt 和p-Akt 蛋 白 表 達(dá) 水 平 均 明 顯 降 低（P＜0.05）；而與TBHP 組比較，各濃度蘆丁組肝癌HepG2 細(xì)胞中PI3K 和p-PI3K 蛋白表達(dá)水平升高（P＜0.05），Akt 和p-Akt 蛋白表達(dá)水平升高（P＜0.05）。見(jiàn)圖3 和圖4。

圖3 各組肝癌HepG2 細(xì)胞中PI3K、p-PI3K、Akt 和p-Akt蛋白表達(dá)電泳圖Fig.3 Electrophoregram of expressions of PI3K, p-PI3K,Akt，and p-Akt proteins in liver cancer HepG2 cells in various groups

2.6各組HepG2細(xì)胞中NF-κB信號(hào)通路蛋白的表達(dá)水平與對(duì)照組比較，TBHP 組肝癌HepG2 細(xì)胞中NF-κB、p-NF-κB 和p53 蛋白表達(dá)水平明顯升高（P＜0.05）；與TBHP 組比較，各濃度蘆丁組HepG2 細(xì)胞中NF-κB、p-NF-κB 和p53 蛋白表達(dá)水平降低（P＜0.05），1.00 μmol·L－1蘆丁組HepG2細(xì)胞中NF-κB、p-NF-κB 和p53 蛋白表達(dá)水平達(dá)到最低。見(jiàn)圖5 和圖6。

3 討 論

氧化應(yīng)激是最常見(jiàn)的應(yīng)激損傷， 是細(xì)胞中ROS 水平超過(guò)細(xì)胞抗氧化能力的一種狀態(tài)，是肝損傷發(fā)生機(jī)制中的重要損傷機(jī)制和環(huán)節(jié)［6-7］。TBHP 具有較穩(wěn)定、不宜分解的優(yōu)勢(shì)，可以代謝為自由基中間體， 從而進(jìn)一步引起脂質(zhì)過(guò)氧化、GSH 耗竭和DNA 損傷，破壞抗氧化防御體系，使細(xì)胞氧化損傷甚至凋亡［8］。 TBHP 會(huì)引起DNA、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)等生物分子的改變，尤其是調(diào)節(jié)與細(xì)胞凋亡和肝星狀細(xì)胞活化有關(guān)的信號(hào)傳導(dǎo)途徑，從而引起肝臟損傷［9］。蘆丁是一種從植物中提取的天然黃酮類化合物，是天然的抗氧化劑，具有多方面的生物活性和藥理作用，包括抗氧化、抗自由基、抗炎、抗病毒、清熱解毒、降血糖、降血脂、舒張血管、止血、拮抗血小板活化因子、神經(jīng)保護(hù)、保肝以及抗腫瘤等作用［10-13］。 本研究結(jié)果表明：TBHP 使肝細(xì)胞存活率明顯降低，細(xì)胞中生成大量的ROS，細(xì)胞中脂質(zhì)過(guò)氧化水平升高，抗氧化體系水平明顯降低。而蘆丁預(yù)處理可以增加細(xì)胞存活率，減少細(xì)胞中ROS 自由基和脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)產(chǎn)物的生成，明顯提高細(xì)胞的抗氧化能力，提示蘆丁對(duì)肝細(xì)胞損傷具有一定的防御和保護(hù)作用。本研究結(jié)果與儲(chǔ)金秀等［13］的研究結(jié)果一致。

圖4 各組肝癌HepG2 細(xì)胞中PI3K、p-PI3K、Akt 和p-Akt蛋白表達(dá)水平Fig.4 Expression levels of PI3K, p-PI3K, Akt, and p-Akt proteins in liver cancer HepG2 cells in various groups

圖5 各組肝癌HepG2 細(xì)胞中NF-κB、p-NF-κB 和p53 蛋白表達(dá)電泳圖Fig.5 Electrophoregram of expressions of NF-κB, p-NFκB, and p53 proteins in liver cancer HepG2 cells in various groups

圖6 各組肝癌HepG2 細(xì)胞中NF-κB、p-NF-κB 和p53 蛋白表達(dá)水平Fig.6 Expression levels of NF- κB, p-NF- κ B and p53 proteins in liver cancer HepG2 cells in various groups

PI3K/Akt 信號(hào)通路在癌細(xì)胞生長(zhǎng)、存活、代謝、自噬和凋亡調(diào)控中起多方面重要作用，其對(duì)于細(xì)胞增殖和凋亡必不可少，在腫瘤疾病的發(fā)生發(fā)展中也起重要作用［14-18］。PI3K 被激活后，誘導(dǎo)下游蛋白Akt 的2 個(gè)位點(diǎn)磷酸化，激活的Akt 再磷酸化下游底物， 引發(fā)級(jí)聯(lián)反應(yīng)［19］。 本研究結(jié)果顯示：TBHP 損傷引起PI3K、p-PI3K、Akt 和p-Akt 蛋白表達(dá)水平明顯降低，而蘆丁預(yù)處理能使PI3K 、p-PI3K、Akt 和p-Akt 蛋白表達(dá)水平升高，且有隨藥物濃度的增加而逐漸升高的趨勢(shì)，說(shuō)明蘆丁對(duì)肝細(xì)胞損傷的保護(hù)作用可能與PI3K/Akt 信號(hào)通路有關(guān)聯(lián)。

NF-κB 是一種多效性的核轉(zhuǎn)錄因子，可調(diào)控多種基因的表達(dá)，這些基因也可促進(jìn)各種腫瘤細(xì)胞的生 長(zhǎng)、 存 活 和 轉(zhuǎn) 化［20-22］。 既 往 研 究［23］表 明：PI3K/Akt 信號(hào)通路中其下游蛋白Akt 可以激活B細(xì)胞的核因子κ 輕鏈增強(qiáng)子NF-κB；且體外研究［24］表明： 組成性活性Akt 可以激活鼠源雙微體（murine double minute gene 2， MDM2），MDM2是一種降解p53 減少細(xì)胞凋亡的E3 泛素蛋白連接酶，而其激活和核易位可以降低p53 水平， 從而降低p53 轉(zhuǎn)錄活性。 本研究結(jié)果表明： TBHP 組肝癌HepG2 細(xì)胞中NF-κB、p-NF-κB 和p53 蛋白表達(dá)水平明顯升高，蘆丁預(yù)處理可使NF-κB、p-NF-κB 和p53 蛋白表達(dá)水平有所降低， 說(shuō)明蘆丁能下調(diào)NF-κB 的活化及p53 蛋白的表達(dá)，從而抑制肝細(xì)胞凋亡。上述結(jié)果表明：蘆丁對(duì)PI3K/Akt 和NF-κB兩條信號(hào)通路的關(guān)鍵蛋白表達(dá)均有一定的調(diào)控作用，提示蘆丁對(duì)TBHP 引起的HepG2 細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用可能與PI3K/Akt 和NF-κB 兩條信號(hào)通路有關(guān)聯(lián)。

綜上所述，蘆丁能夠抑制TBHP 引起的肝細(xì)胞的氧化損傷和細(xì)胞凋亡， 其機(jī)制可能與調(diào)控PI3K/Akt 和NF-κB 這2 條信號(hào)通路有關(guān)。由于肝細(xì)胞損傷臨床極為常見(jiàn)，部分肝損傷甚至經(jīng)久不愈。蘆丁具有較好的抗肝細(xì)胞氧化損傷作用，且價(jià)格低廉， 不良反應(yīng)少， 故具有廣泛的臨床研究前景。