陳微微, 安佳佳, 武 艷, 代娟娟, 杜 靜

（濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院腫瘤研究實(shí)驗(yàn)室，山東 濱州256600）

肺癌是全球目前發(fā)病率和死亡率居首位的惡性腫瘤，其發(fā)病率和死亡率呈逐年升高趨勢(shì)，嚴(yán)重影響人類健康。SHH 信號(hào)通路是調(diào)控胚胎發(fā)育和細(xì)胞增殖分化的經(jīng)典信號(hào)通路，在肺癌、胃癌、大腸癌、 肝癌、 胰腺癌和乳腺癌等多種腫瘤組織中Hedgehog 軸 的 關(guān) 鍵 組 分 表 達(dá) 上 調(diào)［1-6］。 SHH 信 號(hào)通路處于靜止時(shí)，PTCH 抑制SMO 蛋白活性，從而抑制下游通路，當(dāng)處于激活狀態(tài)時(shí)，PTCH 與SHH 結(jié)合后，解除對(duì)SMO 的抑制，促進(jìn)GLI1 蛋白入核激活下游靶基因轉(zhuǎn)錄。GLI1 作為SHH 信號(hào)通路末端的一種直接調(diào)控靶基因的轉(zhuǎn)錄激活因子，可直接調(diào)控靶基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。研究［7-8］表明：針對(duì)GLI1 靶點(diǎn)的抑制劑GANT61 可特異性阻斷人肺癌細(xì)胞和髓母瘤細(xì)胞中GLI1 表達(dá)，從而抑制腫瘤細(xì)胞增殖。有學(xué)者［9］采用RNA 干擾技術(shù)有效抑制GLI1 基因表達(dá)，該方法能明顯提高人非小細(xì)胞肺癌耐藥細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性。研究［3］顯示：過(guò)表達(dá)GLI1 能促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移，但過(guò)表達(dá)GLI1 對(duì)肺癌PC9 細(xì)胞增殖的影響國(guó)內(nèi)外尚未見報(bào)道。本研究成功構(gòu)建了GLI1 基因的真核表達(dá)載體，并將其轉(zhuǎn)染至肺癌PC9 細(xì)胞中，通過(guò)細(xì)胞增殖和細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證GLI1 促進(jìn)細(xì)胞增殖的作用，為深入研究GLI1 在肺癌發(fā)生發(fā)展中的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)，同時(shí)也為開發(fā)治療肺癌的新靶點(diǎn)提供思路。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞、主要試劑和儀器肺癌PC9 細(xì)胞和

pcDNA 3.1 過(guò)表達(dá)載體為本實(shí)驗(yàn)室保存。胎牛血清和RPMI1640 培養(yǎng)基購(gòu)于美國(guó)BI 公司，質(zhì)粒小提試劑盒與膠回收試劑盒購(gòu)于北京天根生物公司，TRIzol 和PCR 所需引物購(gòu)于上海生物工程有限公司合成，GLI1 抗體購(gòu)于美國(guó)Abcam 公司，Tubulin抗體購(gòu)于美國(guó)Bioworld 公司，HRP 標(biāo)記的山羊抗兔抗體購(gòu)于美國(guó)CST 公司， 限制性核酸內(nèi)切酶Hind Ⅲ、Xba Ⅰ和T4 連接酶購(gòu)于美國(guó)NEB 公司，2×Taq PCR Mix 和T- 載體試劑盒購(gòu)于中國(guó)Transgen 公司，CCK-8 試劑盒購(gòu)自日本同仁化學(xué)研究所。 PCR 儀購(gòu)于美國(guó)ABI 公司（ 型號(hào)ABI9700），37℃恒溫CO2孵箱購(gòu)于美國(guó)Thermo 公司， 凝膠成像儀（Bio-Rad ChemiDoc XRS+） 購(gòu)于美國(guó)伯樂公司， 多功能酶標(biāo)儀（BIO-TEK SynergyHIM） 購(gòu)于美國(guó)Omega Bio-Tek 公司， 光學(xué)顯微鏡購(gòu)于日本Olympus 公司， 溫控細(xì)菌搖床（型號(hào)MaxQ6000） 購(gòu)于美國(guó)Fisher 公司。

1.2引物設(shè)計(jì)根據(jù)GenBank 中GLI1 的序列，采用Primer 5 設(shè)計(jì)出含有Hind Ⅲ和Xba Ⅰ限制性核酸內(nèi)切酶位點(diǎn)的GLI1 特異性引物（下劃線處為酶切位點(diǎn)）。 引物序列： GLI1 （克?。?上游引物5'-CCCAAGCTTCCATGTTCAACTCGATGACC-3'，GLI1（克?。┫掠我?'-TGCTCTAGACTTTAGGCACTAGAGTTGAG-G-3'；GLI1（鑒定）上游引物5'-CCCAATCACAAGTCAGGTTCCT-3'，GLI1 （鑒定） 下游引物5'-CCTATGTGAAGCCCTATTTGCC-3'； β -actin 上 游 引 物 5'-CTCCATCCTGGCCTCGCTGT-3'， β -actin 下 游引物5'-GCTGTCACCTTCACCGTTCC-3'。

1.3 GLI1的擴(kuò)增和鑒定以pOTB7-GLI1 質(zhì)粒為模板。反應(yīng)體系：2×Taq mix 25 μL，上下游引物各2 μL （10 mmol·L－1）， 無(wú) 菌 純 水 補(bǔ) 足 體 系 至50 μL； 反應(yīng)條件： 94 ℃、 5 min， 95 ℃、 10 s，54 ℃、 30 s， 72 ℃、 15 s， 共35 個(gè) 循 環(huán)， 72 ℃、10 min。0.5% 瓊脂糖凝膠電泳后回收GLI1 目的條帶并行測(cè)序鑒定。

1.4真核表達(dá)載體pcDNA3.1-GLI1的構(gòu)建將測(cè)序正確的GLI1 回收產(chǎn)物與T 載體混合均勻，25 ℃、10 min 轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α 中，涂至氨芐青霉素抗性的LB 固態(tài)培養(yǎng)板上，37 ℃倒置培養(yǎng)過(guò)夜，挑取單個(gè)菌落，擴(kuò)大培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，并進(jìn)行Hind Ⅲ和XbaⅠ雙酶切鑒定、PCR 及測(cè)序鑒定。將測(cè)序正確的T-GLI1 質(zhì)粒和pcDNA3.1 載體雙酶切后分別切膠回收目的條帶，通過(guò)T4 DNA 連接酶連 接， 轉(zhuǎn) 化至大腸桿菌DH5α 中， 涂于LB 平板（含有氨芐青霉素），37 ℃倒置培養(yǎng)過(guò)夜，次日挑取單菌落，振蕩培養(yǎng)過(guò)夜，小量提取重組質(zhì)粒，并行雙酶切鑒定。 將鑒定正確的重組質(zhì)粒命名為pcDNA3.1-GLI1， 采 用Nanodrop 測(cè) 定 濃 度， 置于－20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.5真核表達(dá)載體pcDNA3.1-GLI1的細(xì)胞轉(zhuǎn)染和GLI1 mRNA及蛋白表達(dá)水平檢測(cè)

將PC9 細(xì)胞接種至12 孔板中，待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)至70%～80% 時(shí)，準(zhǔn)備轉(zhuǎn)染。將1.5 μg 質(zhì)粒溶于50 μL 培 養(yǎng) 基 作 為A 管， 將3 μL Lipofectamine 2000 溶于50 μL 培養(yǎng)基作為B 管，將A 和B 管 輕輕混合后，室溫放置20 min，加入準(zhǔn)備好的細(xì)胞中，繼續(xù)培養(yǎng)48 h 后更換培養(yǎng)基，加入G418 篩選2 周后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。將PC9 細(xì)胞分為空質(zhì)粒組（給予pcDNA3.1 質(zhì)粒） 和重組質(zhì)粒組（給予pcDNA3.1-GLI1 質(zhì) 粒）。 采 用RT-PCR 法 檢 測(cè) 細(xì) 胞 中GLI1 mRNA 表 達(dá) 水 平。 將 細(xì) 胞 轉(zhuǎn) 染 48 h 后，5 000 r·min－1離心收集細(xì)胞，提取細(xì)胞總RNA，采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA 反轉(zhuǎn)錄成cDNA，采用2×Taq PCR SuperMix 進(jìn) 行PCR 鑒 定。 以2 μg cDNA 為模板（100 μg·L－1），反應(yīng)體系為2×Tag mix 10 μg ， 上 下 游 引 物 各1 μL （10 mmol·L－1），以無(wú)菌純水補(bǔ)足體系至20 μL。反應(yīng)條件：94 ℃、5 min，95 ℃、10 s，54 ℃、20 s，72 ℃、15 s，共35 個(gè)循環(huán)；72 ℃、10 min。并進(jìn)行3 次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，采用Image J 軟件分析灰度值，以GAPDH 作為內(nèi)參，計(jì)算GLI1 mRNA 表達(dá)水平。

采用Western blotting 法檢測(cè)2 組細(xì)胞中GLI1蛋白表達(dá)水平。將細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h 后，5 000 r·min－1離心收集細(xì)胞，蛋白裂解液裂解細(xì)胞30 min，BCA法測(cè)定蛋白濃度。取40 μg 蛋白與適量蛋白上樣緩沖液混合均勻后， 100 ℃煮沸10 min， 進(jìn)行10%SDS-PAGE 電泳分離，100 V/2 h 濕轉(zhuǎn)法將目的蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF 膜上。5% 脫脂奶粉封閉膜30 min后， 根據(jù)預(yù)染蛋白Marker 裁膜， 分別孵育抗體GLI1 （1∶1 000） 和α-Tubulin （1∶1 000） 抗體過(guò)夜。次日TBST 洗膜3 次后，孵育羊抗兔標(biāo)記的二抗（1∶1 000） 室溫1 h，TBST 洗膜3 次后，加入ECL 底物顯色液，采用凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行曝光拍照。采用Image J 軟件分析灰度值，以α-Tubulin為內(nèi)參，計(jì)算GLI1 蛋白表達(dá)水平。

1.6 CCK-8法檢測(cè)2組細(xì)胞增殖活性將細(xì)胞懸液按1×104mL－1的 細(xì) 胞 密 度， 每 孔100 μL 接 種 于96 孔板，每組設(shè)6 個(gè)平行復(fù)孔。然后分別于培養(yǎng)24、 48、 72 和96 h 后， 在避光條件下加入10 μL CCK-8 反應(yīng)液， 在37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱避光反應(yīng)2 h。2 h 后用酶標(biāo)儀在450 nm 處檢測(cè)的吸光度（A） 值，以僅加培養(yǎng)液的孔為對(duì)照孔調(diào)零。以A 值表示各組細(xì)胞的增殖活性。

1.7克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)2組細(xì)胞克隆形成數(shù)將細(xì)胞以500 個(gè)/孔的密度接種于6 孔板，每組設(shè)3 個(gè)重復(fù)，每3 d 更換新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)10 d。將細(xì)胞采用4% 甲醛固定15 min 后，結(jié)晶紫染色10 min，采用自來(lái)水洗滌至本底干凈，采用凝膠成像儀進(jìn)行拍照，采用Image J 軟件計(jì)算各組細(xì)胞克隆形成數(shù)。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用Graphpad Prism 7.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。2 組細(xì)胞中GLI1 mRNA 表達(dá)水平、GLI1 蛋白表達(dá)水平、細(xì)胞增殖活性和細(xì)胞克隆形成數(shù)以x±s表示，組間比較采用t檢驗(yàn)。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 GLI1的擴(kuò)增和重組質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定從Potb7-GLI1 質(zhì)粒中克隆出GLI1 （3 300 bp） 基因片段， 見圖1 A。 隨后將GLI1 基因片段克隆至pcDNA3.1 （5 400 bp） 載體上，并進(jìn)行Hind Ⅲ和XbaⅠ雙酶切鑒定，見圖1 B。經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，GLI1 條帶大小與預(yù)期一致，雙酶切鑒定結(jié)果提示GLI1 已成功插入至pcDNA3.1 載體上。

2.2 2組PC9細(xì)胞中GLI1 mRNA和蛋白表達(dá)水平將pcDNA3.1 和pcDNA3.1-GLI1 質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染PC9 細(xì)胞后，采用RT-PCR 法檢測(cè)2 組PC9 細(xì)胞中GLI1 mRNA 表達(dá)水平， 與空載體組（1.016±0.085） 比 較， 重 組 質(zhì) 粒 組PC9 細(xì) 胞 中GLI1 mRNA 表 達(dá) 水 平（47.138±7.087） 升 高（P＜0.01）；采用Western blotting 法檢測(cè)GLI1 蛋白表達(dá)水平可見：與空載體組（0.561±0.061） 比較，重組質(zhì)粒組PC9 細(xì)胞中GLI1 蛋白表達(dá)水平（1.334±0.055） 也明顯升高（P＜0.05）。見圖2。

圖1 GLI1 重組質(zhì)粒的構(gòu)建和鑒定電泳圖Fig.1 Electrophoregram of construction and identification of GLI1 recombinant plasmid

圖2 2 組PC9 細(xì)胞中GLI1 mRNA(A)和蛋白(B)表達(dá)電泳圖Fig.2 Electrophoregram of expressions of GLI1 mRNA(A) and protein(B) in PC9 cells in two groups

2.3 2組PC9細(xì)胞增殖活性和克隆形成數(shù)與空載體組比較，24 和48 h 時(shí)重組質(zhì)粒組PC9 細(xì)胞增殖活性差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），72 和96 h細(xì)胞增殖活性明顯升高（P＜0.01），見圖3 和圖4。克隆形成實(shí)驗(yàn)（培養(yǎng)10 d） 結(jié)果顯示：重組質(zhì)粒組PC9 細(xì)胞克隆形成數(shù)較空載體組明顯增加（P＜0.01），見圖5 （插頁(yè)三）。

圖3 各時(shí)間點(diǎn)2 組PC9 細(xì)胞的增殖活性Fig.3 Proliferation activities of PC9 cells in two groups at different time points

圖4 2 組PC9 細(xì)胞增殖形態(tài)表現(xiàn)(×10)Fig.4 Morphology of proliferation of PC9 cells in two groups（×10）

3 討 論

SHH 信號(hào)通路的異常激活在肺癌的發(fā)生發(fā)展中有重要作用［10］。該信號(hào)通路主要由分泌型糖蛋白配體SHH、2 個(gè)跨膜受體PTCH 和SMO 及核轉(zhuǎn)錄因子GLI 構(gòu)成。GLI 蛋白家族在信號(hào)通路中占據(jù)重要地位，包含3 個(gè)成員（GLI1、GLI2 和GLI3），其中GLI1 是調(diào)控Hedgehog 通路最關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄因子。 本 課 題 組 前 期 研 究［11］表 明： 在 肺 癌 組 織 中GLI1 基因較癌旁組織異常高表達(dá)，且表達(dá)水平與患者預(yù)后呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。中藥半枝蓮?fù)ㄟ^(guò)抑制該通路中SMO 表達(dá)，阻滯下游細(xì)胞周期檢驗(yàn)點(diǎn)CyclinA等表達(dá)并抑制肺癌細(xì)胞增殖。亞硒酸鈉通過(guò)下調(diào)轉(zhuǎn)錄因子GLI1 及其下游干細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子SOX2 抑制肺癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移［12］。Hedgehog 通路的異常激活與晚期非小細(xì)胞肺癌對(duì)順鉑耐藥具有相關(guān)性［13］，且該通路關(guān)鍵信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)組分SMO 和GLI1 的異常表達(dá)是導(dǎo)致非小細(xì)胞肺癌對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體（epidermal growth factor receptor， EGFR） 抑制劑耐 藥 和 轉(zhuǎn) 移 發(fā) 生 的 重 要 機(jī) 制［14-15］。 ZHANG 等［16］研究表明：雷公藤內(nèi)酯酮通過(guò)SHH-GLI1 信號(hào)通路抑 制 肺 癌 發(fā) 生。YAO 等［3］研 究 顯 示：GLI1 在 胃癌組織中明顯高表達(dá)，過(guò)表達(dá)GLI1 可以促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移，并且誘導(dǎo)藥物耐藥。在卵巢癌中，過(guò)表達(dá)GLI1 可以促進(jìn)腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移［17］。在基底細(xì)胞癌中，降低PTCH 表達(dá)后抑制細(xì)胞檢驗(yàn)點(diǎn)Cyclin B1， 促 進(jìn)GLI1 表 達(dá)［18］。 在 胰 腺 癌 中，GLI1 調(diào)控多種致癌基因，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生［4］。在肝癌中，GLI1 可通過(guò)ERK 信號(hào)通路促進(jìn)肝癌的發(fā)生、 侵 襲 和 轉(zhuǎn) 移［19］。 針 對(duì)GLI1 的 靶 向 抑 制 劑 有GANT61 和GANT58 等［20］， 研 究［21-22］顯 示：GANT61 以劑量依賴的方式降低癌細(xì)胞增殖能力。

本研究成功構(gòu)建了GLI1 的真核表達(dá)載體，建立了GLI1 穩(wěn)定過(guò)表達(dá)的肺癌細(xì)胞系，同時(shí)證明了有GLI1 促進(jìn)肺癌PC9 細(xì)胞增殖的能力。