陸雨順，張磊，姜輝，宮瑞澤，劉暢，孫印石※

（1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所，吉林 長(zhǎng)春 130112；2.吉林特研藥業(yè)有限公司，吉林 吉林 132109）

氨基酸是構(gòu)成人體營(yíng)養(yǎng)所需蛋白質(zhì)的基本物質(zhì)，其組成及含量是評(píng)價(jià)蛋白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的重要指標(biāo)[1-2]。研究發(fā)現(xiàn)，鹿茸、鹿肉及鹿皮中均含有大量人體必需氨基酸[3-5]，可以作為優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)資源為人們利用。

膠原蛋白是動(dòng)物組織中一類特有的蛋白質(zhì)，它屬于不溶性纖維型蛋白質(zhì)，是動(dòng)物結(jié)締組織及細(xì)胞外基質(zhì)的重要組成成分[6]。膠原蛋白中甘氨酸（Gly）含量最高，約占總氨基酸的1/3，此外還包括丙氨酸（Ala）、脯氨酸（Pro）和羥脯氨酸（Hyp）等氨基酸殘基，它們通常以Gly-X-Y重復(fù)系列排列于膠原蛋白的一級(jí)結(jié)構(gòu)中[7-8]。2015年版《中國(guó)藥典》中以異硫氰酸苯酯柱前衍生液相色譜法測(cè)定膠原蛋白結(jié)構(gòu)中的4種氨基酸從而控制膠類中藥材飲片質(zhì)量[9]。

目前，關(guān)于梅花鹿資源中氨基酸及膠原蛋白的研究主要集中于不同鹿茸和鹿角中氨基酸及膠原蛋白含量的測(cè)定[3,10-13]。而關(guān)于其他鹿副產(chǎn)品中膠原蛋白的研究還相對(duì)較少。傳統(tǒng)膠原蛋白測(cè)定方法主要是通過(guò)比色法測(cè)定Hyp 的含量從而獲得[13-14]，但操作繁瑣，需求樣品數(shù)大，且靈敏性及穩(wěn)定性不理想；氨基酸自動(dòng)分析法是一種快速、準(zhǔn)確和靈敏度高的測(cè)定方法，適用于膠原蛋白中Ala、Pro 和Hyp 等多種氨基酸的測(cè)定與分析[15]。

本研究以氨基酸自動(dòng)分析法測(cè)定梅花鹿鞭、鹿角脫盤、鹿骨及鹿皮等4種鹿副產(chǎn)品中18種氨基酸的含量，并將其中4種特有氨基酸含量轉(zhuǎn)化為膠原蛋白含量，進(jìn)而對(duì)比分析膠原蛋白的含量，以期為鹿副產(chǎn)品的深加工及質(zhì)量評(píng)價(jià)提供新方法及理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

梅花鹿鞭、鹿角脫盤、鹿骨和鹿皮均購(gòu)于吉林省長(zhǎng)春市雙陽(yáng)區(qū)鹿鄉(xiāng)鎮(zhèn)。H 型氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液（日本W(wǎng)ako 公司）；L-羥脯氨酸（Hyp，批號(hào)：Z26M7H11979，純度≥99%，上海源葉生物科技有限公司）；檸檬酸鈉緩沖鹽、茚三酮衍生化試劑（日本日立公司）；鹽酸、檸檬酸鈉（均為分析純，北京翰天科技有限公司）；超純水（電阻率≥18.25 M·cm）由實(shí)驗(yàn)室超純水機(jī)制備。

1.2 儀器與設(shè)備

WP-UP-WF-40 型微量分析型超純水機(jī)（四川沃特爾水處理設(shè)備有限公司）；JP-100ST 超聲波清洗機(jī)（深圳潔盟清洗設(shè)備有限公司）；L-8900 型氨基酸自動(dòng)分析儀（日本日立公司）；SF-TGL-16M 型臺(tái)式離心機(jī)（上海菲恰爾分析儀器有限公司）；MS-204S型精密電子分析天平（瑞士梅特勒-托利多公司）。

1.3 氨基酸含量測(cè)定

采用茚三酮進(jìn)行柱后衍生法，參考GB/T 5009.124—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中氨基酸的測(cè)定》中的方法進(jìn)行測(cè)定。

1.3.1 色譜條件 HITACHI 2622SC-PH 離子分離柱（4.6 mm 60 mm），日立專用3m 磺酸型陽(yáng)離子交換樹(shù)脂，柱溫57 ℃，反應(yīng)溫度135 ℃；Hyp 和Pro 經(jīng)茚三酮衍生后在440 nm波長(zhǎng)處有最大吸收，其余16種氨基酸在570 nm 波長(zhǎng)處有最大吸收；流動(dòng)相：B1～B4為不同pH 值的檸檬酸鈉緩沖溶液（分離氨基酸），B5為水（清洗流動(dòng)相），B6 為再生溶液（清洗樣品），B1～B6由泵1 控制，流速為0.40 mL/min；R1～R3 是茚三酮衍生化劑及其緩沖溶液，由泵2 控制，流速為0.35mL/min；泵1 壓力0.3～25 MPa，泵2 流速0.35 mL/min，泵壓力0～0.2MPa；檢測(cè)波長(zhǎng)：1 通道570nm，2 通道440nm；分析時(shí)間：1 通道32 min，2 通道10 min；具體氨基酸洗脫程序見(jiàn)表1。

表1 氨基酸洗脫程序Table 1 Amino acid elution procedure

1.3.2 對(duì)照品溶液制備 以0.1 mol/L 鹽酸將氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋1000 倍，精密稱取Hyp 對(duì)照品，置于50 mL 容量瓶中，加入稀釋后的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，定容，混勻，配制成各氨基酸濃度為250mol/L 的對(duì)照品溶液。

1.3.3 供試品溶液制備 精密稱取鹿鞭、鹿角脫盤、鹿骨及鹿皮粉末（過(guò)60 目篩）0.2 g 置50 mL 氨基酸水解管中，加入6 mol/L 的鹽酸溶液20 mL，密封，置于110 ℃恒溫干燥箱中水解22 h，取出，冷卻至室溫，定容，取800L 置于蒸發(fā)皿中，于70 ℃真空干燥箱中烘干，殘?jiān)尤? mL 的鹽酸（0.02 mol/L）復(fù)溶，渦旋，混勻，過(guò)0.22m 水系微孔濾膜，即得。

1.4 氨基酸含量測(cè)定方法學(xué)考察

1.4.1 線性關(guān)系 精密稱取氨基酸標(biāo)準(zhǔn)混合液，以檸檬酸鈉緩沖液（檸檬酸鈉19.6g，加超純水稀釋到1000mL，用鹽酸調(diào)pH 值至2.2）稀釋成系列梯度，按1.3.4 項(xiàng)下的試驗(yàn)方法上機(jī)檢測(cè)，以對(duì)照品中氨基酸質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程。

1.4.2 檢出限和定量限 按色譜條件，將對(duì)照品進(jìn)行逐級(jí)稀釋，上機(jī)測(cè)定。以信噪比為3（S/N=3）的對(duì)照品濃度為檢出限，以信噪比為10（S/N=10）的對(duì)照品濃度為定量限。

1.4.3 精密度試驗(yàn) 精密稱取同一濃度的氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液，按色譜條件重復(fù)進(jìn)樣6 次，測(cè)定峰面積并計(jì)算RSD。

1.4.4 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取同一鹿皮樣品6 份，按1.3.3 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按色譜條件測(cè)定，根據(jù)峰面積計(jì)算樣品中各氨基酸含量及RSD。

1.4.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密稱取同一鹿皮樣品6 份，分別在0、2、4、8、16、24 h 按1.3.3 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按色譜條件上機(jī)測(cè)定，測(cè)定各氨基酸峰面積，考察儀器穩(wěn)定性。

1.4.6 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取同一鹿皮樣品6份，加入一定量的氨基酸標(biāo)準(zhǔn)混合液，按1.3.3 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按色譜條件上機(jī)測(cè)定，計(jì)算回收率。

1.5 膠原蛋白含量的計(jì)算

膠原蛋白含量計(jì)算參照宮瑞澤（2019）的方法進(jìn)行[11]，計(jì)算公式如下：

其中：A 為樣品中Hyp 的濃度（ng/mL）；m 為稱取的樣品質(zhì)量（mg）；50 為氨基酸水解液定容體積（mL）。

1.6 數(shù)據(jù)處理

所有試驗(yàn)重復(fù)測(cè)定3 次，結(jié)果采用GraphPad Prism 6 軟件處理，應(yīng)用獨(dú)立t 檢驗(yàn)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性分析。所有數(shù)據(jù)以x±s 表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 氨基酸色譜圖

18種氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)品及鹿皮樣品的氨基酸色譜圖見(jiàn)圖1。其中，Hyp 及Pro 在VIS 2（440 nm 波長(zhǎng)）顯示，其余16種氨基酸在VIS 1（570 nm）波長(zhǎng)顯示。

圖1 18種氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)品（A）及鹿皮樣品（B）色譜圖Fig.1 Chromatograms of mixed amino acid standards（A）and deer skin（B）

2.2 線性關(guān)系、檢出限和定量限

18種氨基酸的回歸方程、線性范圍、檢出限和定量限見(jiàn)表2。由表2 可知，18種氨基酸在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)R2為0.9921～0.9992；檢出限為0.14～0.98 ng/mL；定量限為0.94～2.03 ng/mL。

表2 18種氨基酸的回歸方程、相關(guān)系數(shù)（2）、檢出限（LOD）和定量限（LOQ）Table 2 Regression equations, correlation coefficients, limits of detection and limits of quantification of 18 amino acids

表2 18種氨基酸的回歸方程、相關(guān)系數(shù)（2）、檢出限（LOD）和定量限（LOQ）Table 2 Regression equations, correlation coefficients, limits of detection and limits of quantification of 18 amino acids

氨基酸Amino acids回歸方程Regression equation images/BZ_50_1295_681_1318_704.png2 LOD（ng/mL） LOQ（ng/mL）Asp Y=15635X+4820 0.9985 0.68 1.25 Thr Y=25682X+3690 0.9964 0.52 0.94 Ser Y=24652X+3215 0.9991 0.34 1.54 Glu Y=16258X+4195 0.9978 0.46 1.34 Gly Y=29365X+2806 0.9926 0.14 1.32 Ala Y=21520X+4252 0.99650 0.88 0.93 Cys Y=22645X+3690 0.9958 0.51 1.38 Val Y=24856X+ 3857 0.9947 0.21 1.84 Met Y=31268X-1026 0.9984 0.85 1.62 Ile Y=27362X+2056 0.9922 0.35 1.52 Leu Y=22594X+3520 0.9953 0.68 0.97 Tyr Y=37866X+1120 0.9947 0.75 1.57 Phe Y=32256X+2034 0.9921 0.95 1.36 Lys Y=27548X+3325 0.9982 0.62 1.83 His Y=35382X+3690 0.9951 0.81 2.03 Arg Y=28755X-2641 0.9932 0.98 1.62 Pro Y=27602X+1520 0.9971 0.35 2.01 Hyp Y=32624X-1265 0.9992 0.55 1.02

2.3 精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性及加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

精密度試驗(yàn)結(jié)果顯示，18種氨基酸的RSD 為0.15%～1.52%，表明儀器精密度良好；重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果顯示，18種氨基酸的RSD為0.12%～3.34%，表明樣品的重復(fù)性良好；穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果顯示，18種氨基酸的RSD 為1.36%～2.41%，表明儀器在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好；回收率試驗(yàn)結(jié)果顯示，18種氨基酸的平均加樣回收率為98.32%～100.03%，RSD為1.65%～2.43%，表明加樣回收率良好。

2.4 鹿副產(chǎn)品中氨基酸含量測(cè)定

鹿副產(chǎn)品中18種氨基酸含量結(jié)果，見(jiàn)表3。由表3 可知，4種鹿副產(chǎn)品中以鹿鞭中氨基酸總量（84.24%）最高，鹿骨中氨基酸總量（25.83%）最低；綜合各種鹿副產(chǎn)品中的氨基酸組成，其中以Gly 含量占比最高，約占氨基酸總量的20%；Met含量最低，只占總量的0.06%左右。由此可見(jiàn)4種鹿副產(chǎn)品中大部分氨基酸是由I型膠原蛋白水解產(chǎn)生的[16]。在鹿鞭及鹿皮中，Gly 及Pro 為最主要的兩類氨基酸，它們的占比均超過(guò)了10%，此外Hyp 含量也較高，達(dá)到10%左右；而在鹿角脫盤和鹿骨中，只有Gly 含量較高，分別為7.71%和5.71%；所有樣品中以鹿鞭中的必需氨基酸含量（17.08%）最高，而其中又以Leu 含量最高，這與王海璐等的研究結(jié)果相一致[17]。鹿皮中以Glu、Gly、Ala、Pro 及Hyp 含量較高，已有研究證明可利用鹿皮來(lái)開(kāi)發(fā)鹿皮膠并制作營(yíng)養(yǎng)調(diào)節(jié)劑[5]。

2.5 鹿副產(chǎn)品中膠原蛋白含量測(cè)定

鹿副產(chǎn)品中膠原蛋白含量見(jiàn)圖2。如圖所示，4種鹿副產(chǎn)品中以鹿鞭中的膠原蛋白含量最高，鹿骨中膠原蛋白含量最低，鹿鞭及鹿皮中膠原蛋白含量顯著高于鹿角脫盤及鹿骨（P＜0.05）。宮瑞澤等[12]通過(guò)研究藥典中鹿源藥材中膠原蛋白的含量發(fā)現(xiàn)，鹿角膠及鹿角脫盤膠中膠原蛋白含量顯著高于鹿茸和鹿角等其他鹿源藥材，證明膠類藥材是膠原蛋白的可靠來(lái)源。

表3 鹿副產(chǎn)品中18種氨基酸含量Table 3 Contents of 18 amino acids in deer by-products（%）

圖2 鹿副產(chǎn)品中膠原蛋白含量Fig. 2 Collagen contents in deer by-products

3 結(jié)論

本研究通過(guò)氨基酸自動(dòng)分析儀對(duì)于梅花鹿鞭、鹿角脫盤、鹿骨及鹿皮4種鹿副產(chǎn)品中的18種氨基酸進(jìn)行了測(cè)定，并對(duì)比了不同鹿副產(chǎn)品中氨基酸的含量與組成，進(jìn)一步通過(guò)Hyp 含量計(jì)算出各鹿副產(chǎn)品中膠原蛋白的含量。結(jié)果表明，鹿鞭中氨基酸總量（84.24%）及必需氨基酸含量（17.08%）最高；各種氨基酸中以Gly含量（約為20%）占比最高，Met 含量（0.05%）最低；膠原蛋白在鹿鞭中含量最高，在鹿骨中含量最低。本研究為鹿副產(chǎn)品的精深加工與利用提供了理論依據(jù)。