鄭偉，劉曉穎，廉士珍，張蕾，張海玲，呂爽，李亞麗，王中英，閆喜軍，朱言柱※

（1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所，吉林 長(zhǎng)春 130112；2.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)中藥材學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130117；3.吉林大學(xué)第一醫(yī)院，吉林 長(zhǎng)春 130021；4.華威特科技有限責(zé)任公司，江蘇 泰州 100085)

犬1 型腺病毒（CAdV-1）和犬2 型腺病毒（CAdV-2）屬于犬腺病毒（canine adenovirus,CAV）科。其中CAdV-1 的基因組與其它腺病毒有相似的基因結(jié)構(gòu)，即單分子、線狀和雙股DNA，長(zhǎng)30～31kb，且DNA兩側(cè)的末端有反向重復(fù)序列，5’端有末端蛋白。CAdV-1基因組包含E1-E4 基因和L1-L5 基因，病毒直徑約為80 nm。CAdV-1 的E1 區(qū)包括E1A、E1B-55K 和E1B-19K。其中E1B-55K 可延緩細(xì)胞過(guò)早凋亡，并協(xié)助mRNA 的翻譯。CAdV-1 無(wú)囊膜，有衣殼結(jié)構(gòu)，且為20 面立體對(duì)稱(chēng)，其纖突長(zhǎng)度在45～ 47 nm 范圍內(nèi)，特異性抗原位于纖突的基部，細(xì)胞受體可與頂端的knob發(fā)生特異性結(jié)合[1]。CAdV-1 不僅引起狐貍和犬發(fā)病，還可引起狼、黑熊和臭鼬等發(fā)病。犬、狼表現(xiàn)為肝炎變化，狐貍和黑熊表現(xiàn)為腦炎，前者引發(fā)肝皮質(zhì)和實(shí)質(zhì)細(xì)胞長(zhǎng)時(shí)間出血，后者臨床癥狀為發(fā)燒、腹瀉、精神高度興奮，嚴(yán)重時(shí)還伴隨便血、共濟(jì)失調(diào)和意識(shí)障礙等[2-4]。CAdV-1 與巴氏肺炎桿菌共同感染幼犬[5]，對(duì)病死幼犬進(jìn)行尸檢，組織病理學(xué)顯示肝、脾和淋巴結(jié)腫大，心內(nèi)膜和腦膜有出血點(diǎn)。

生物信息學(xué)融合了計(jì)算機(jī)科學(xué)和生命科學(xué)，主要進(jìn)行生物信息的采集、存儲(chǔ)和結(jié)果解釋等，基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)是其研究的重點(diǎn)，尤其是藥物設(shè)計(jì)，蛋白質(zhì)比對(duì)和分子進(jìn)化等。米春娟[6]通過(guò)生物信息學(xué)方法探索不同的運(yùn)動(dòng)對(duì)心臟蛋白質(zhì)組的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)運(yùn)動(dòng)對(duì)機(jī)體組織器官和血液的蛋白質(zhì)組有重塑作用，促進(jìn)對(duì)心血管疾病的治療。馬素珍[7]等以人的HNRNPA1基因?yàn)閷?shí)驗(yàn)材料，采用生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)其性質(zhì)，發(fā)現(xiàn)HNRNPA1 主要存在于細(xì)胞核中，調(diào)控RNA 的成熟。金琦芳[8]采用生物信息學(xué)方法分析了CsANS 基因氨基酸，預(yù)測(cè)CsANS 的相應(yīng)理化性質(zhì)，并結(jié)合熒光定量PCR 技術(shù)，證實(shí)光照強(qiáng)弱調(diào)控CsANS 基因的表達(dá)。郭慧[9]通過(guò)生物信息學(xué)方法分析了甘藍(lán)AP2/ERF-B3的亞基因序列BoAP2/ERF1 和BoAP2/ERF2，結(jié)果發(fā)現(xiàn)AP2/ERF 具有信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的功能。

因此，通過(guò)以上分析，我們發(fā)現(xiàn)E1B-55K 在延緩細(xì)胞過(guò)早凋亡和協(xié)助mRNA 的翻譯過(guò)程中發(fā)揮重要作用，為更進(jìn)一步利用E1B-55K，我們采用生物信息學(xué)分析方法對(duì)其蛋白的結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)，為其下一步應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

犬1 型腺病毒E1B-55K 蛋白的DNA 序列：TGGAGCAGGATTCAGATCTGGAGTCAGGCCGCG CGACTAATCAACGACCTCCCAGAGTCCGTGTTC GAGGGGCAGGGGTCCGTGGTAGAGGAAGAGTG CGGAGAAGAGCACTTAGCGAGGGACAGCGAC GATCCCTTTTTCGACTAGACGATCTGCAGCT TCCAGATTCCCTGTATGTTACGCGAGCTCTGCA ACGGGACCATGCTTTGGAAATGCCTAGAGGGC AGGTAGATTTTAGCTTGATTGAGGCTGAGGAG AGGAGGGCCGGTCCTACGGACGAGTGGTAT TTTGAATCTGTTAAAACTTACAGGGCTAAGCCG GGGGATGATCTCCAGACCTTAATCAAAAATTAT GCCAAGATTTCTCTGGAATGTGGGGCTGTGTAT GAAATAAACTCTAAGATTGTGGTGACGGGGG CTTGTTATATAATTGGTAATTGTGCTGTACTTAGG GCTAACCTGCCGGTAGGGACTGCAATGTTTGAG GTTTTGAATGTAGATGTTATTCCGTCAATTGGTT TTATGGAAAGGATAGTGTTTTCAAATATTCTTTT TGATTGCAGGAGTACCACAGCTGTAGTGTGTTG CATTAGTGAAAGAAATACGCTCTTTCACAAT TGTGTCTTTTCCGGTCCACACATGCTGTGCTTG GATATTAGGGCGGGGGCCGAAGTGAGGGGATG TCATTTTGTGGGTGCGGTGTGTGCTCTGCGTA GCAAGGGTTTGTATAGTGTTAGAGTGAGAAATA GCATCTTTGAAAAATGTGCTTTTGGGGTAGTGA GCGGCTCCAAGGCTTCCATTAGCCACAGTATGT TTAAAGACTGTGCTTGCTGTATTATGTTTGGGG GACAGGGCACTATCGCACATAGTCATTTTA TGGCGACCACTTGTACTGATACACCTATGAACC TGCAATTATGTACTTGTGAGGGGAATGGAAGTC ATGTGGTTCCTCTGGGAAATATTCACTTTGCT TCTAATCGGGAAGCCCCGTGGCCTACATTTAAC GCGAACGTTTTGGTTCGGGTACGTTTATACATG GGCCGGCGCCGGGGAGTGTTTCATCCTAAGCAG TCAACATTTTCTATGTGTGTCATTGCCGCTCCA AGAGGGGTTGTGCAAAGAATCTATCTGTTCA GTGTGTATGATGCAACCTGCGCCATTTTGCAACT GGGCGAAGCAGGTGATGCTGCTACCGAAAGA CTGTGTACCTGCGGTATGAGGCATAACACCCCTT CTTTGAGGGCTGCTTATGTTACTGACACGAGGA TTGATCGGGAAATAAATTCCCAAGACACGGCG GAGTTTTTTAGCAGTGATGAAGATAACTTATAA。

1.2 方法

1.2.1 E1B-55K 理化性質(zhì)在線預(yù)測(cè) 采用SnapGene軟件將E1B-55K 翻譯為相應(yīng)的氨基酸序列，并通過(guò)Protparam（網(wǎng)站https://web.expasy.org/protparam/）分析E1B-55K 的等電點(diǎn)、氨基酸組成和穩(wěn)定系數(shù)等。

1.2.2 E1B-55K 磷酸化和糖基化位點(diǎn)在線預(yù)測(cè) 采用NetPhos 3.1 Server（網(wǎng)站http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos）預(yù)測(cè)E1B-55K 的磷酸化潛在位點(diǎn)。利用NetOGlyc 1.0 Server 預(yù)測(cè)E1B-55K的潛在糖基化位點(diǎn)。

1.2.3 E1B-55K 親疏水性與跨膜區(qū)結(jié)構(gòu)在線預(yù)測(cè) 采用ProtScale（網(wǎng)站https://web expasy org/protscale/）分析E1B-55K 親疏水性。利用TMHMM Server 2.0（網(wǎng)址http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM）預(yù)測(cè)E1B-55K 的跨膜區(qū)結(jié)構(gòu)。

1.2.4 E1B-55K 信號(hào)肽在線預(yù)測(cè) 采用德泰生物推出的測(cè)評(píng)軟件（網(wǎng)站www.detaibio.com/tools/signal-peptide.html）預(yù)測(cè)信號(hào)肽，可精確到具體的氨基酸位點(diǎn)。

1.2.5 E1B-55K 二級(jí)結(jié)構(gòu)在線預(yù)測(cè) 通過(guò)網(wǎng)站https://npsa-prabi.ibcp.fr/NPSA/npsa_sopma.html 預(yù)測(cè)E1B-55K的二級(jí)結(jié)構(gòu)，并可知 折疊、螺旋和無(wú)規(guī)卷曲各含有的氨基酸數(shù)目。

1.2.6 E1B-55K 三級(jí)結(jié)構(gòu)在線預(yù)測(cè) 采用phyre2（網(wǎng)站http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html/page.cgi?id=index）預(yù)測(cè)E1B-55K 的三級(jí)結(jié)構(gòu)，并分析此蛋白的空間結(jié)構(gòu)、可信度和覆蓋率等。

1.2.7 E1B-55K 抗原表位在線預(yù)測(cè) 采用Predicting Anti-genic Peptides（網(wǎng)站http://imed.med.ucm.es/Tools/antigenic.pl）預(yù)測(cè)E1B-55K 的抗原決定簇。通過(guò)ABCpred（網(wǎng)站https://webs.iiitd.edu.in/raghava/abcpred/ABC_submission.html）預(yù)測(cè)E1B-55K 的B 細(xì)胞抗原表位。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 E1B-55K 的氨基酸序列和理化性質(zhì)預(yù)測(cè)

E1B-55K 蛋白通過(guò)SnapGene 軟件翻譯的氨基酸序列為：WSRIQIWSQAARLINDLPESVFEGQGSVVEEE CGEEHLARDSDDPFFD*TICSFQIPCMLRELCNGT MLWKCLEGR*ILA*LRLRRGGPVLRTSGILNLLK LTGLSRGMISRP*SKIMPRFLWNVGLCMK*T LRLW*RGLVI*LVIVLYLGLTCR*GLQCLRF*M*M LFRQLVLWKG*CFQIFFLIAGVPQL*CVALVK EIRSFTIVSFPVHTCCAWILGRGPK*GDVILWVRC VLCVARVCIVLE*EIASLKNVLLG**AAPRLPLATV CLKTVLAVLCLGDRALSHIVILWRPLVLIHL*TCN YVLVRGMEVMWFLWEIFTLLLIGKPRGLHLTRTF WFGYVYTWAGAGECFILSSQHFLCVSLPLQEGLC KESICSVCMMQPAPFCNWAKQVMLLPKDCVPAV*GITPLL*GLLMLLTRGLIGK*IPKTRRSFLAVM KITY。氨基酸數(shù)量為424，但密碼子共有444個(gè)，結(jié)果見(jiàn)表1。其中碳（C）、氫（H）、氮（N）、氧（O）和硫（S）分別為2199、3535、575、538 和39，共6886個(gè)原子即C2199H3535N575O538S39。有25個(gè)負(fù)電殘基和46個(gè)正電殘基。分子量為47887.13，理論等電點(diǎn)為9.29。失穩(wěn)指數(shù)（II）為42.53（42.53 即為不穩(wěn)定指數(shù)），我們將此蛋白歸類(lèi)為不穩(wěn)定的蛋白。

表1 E1B-55K 氨基酸組成表Table 1 Amino acid composition of E1B-55K

2.2 E1B-55K 磷酸化和糖基化位點(diǎn)的預(yù)測(cè)結(jié)果

使用NetPhos 3.1 Server 進(jìn)行E1B-55K 的磷酸化潛在位點(diǎn)的預(yù)測(cè)，見(jiàn)圖1，發(fā)現(xiàn)E1B-55K 有13個(gè)絲氨酸位點(diǎn)（8、20、27、42、91、103、111、196、271、341、348、359 和415），9個(gè)蘇氨酸位點(diǎn)（49、90、146、193、253、258、329、392 和412），在第326 位有1個(gè)酪氨酸潛在位點(diǎn)。通過(guò)NetOGlyc 1.0 Server 預(yù)測(cè)E1B-55K 的糖基化潛在位點(diǎn)，見(jiàn)圖2，發(fā)現(xiàn)潛在的糖基化位點(diǎn)存在于第64 位且只有1個(gè)。

圖1 E1B-55K 磷酸化位點(diǎn)的預(yù)測(cè)Fig.1 E1B-55K phosphorylation site prediction

圖2 E1B-55K 糖基化位點(diǎn)的預(yù)測(cè)圖Fig. 2 Prediction of the glycosylation site of E1B-55K

2.3 E1B-55K 親疏水性與跨膜區(qū)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)結(jié)果

通過(guò)ProtScale 預(yù)測(cè)E1B-55K 的親疏水性，發(fā)現(xiàn)E1B-55K 蛋白是平均親水系數(shù)為0.662 的疏水蛋白，見(jiàn)圖3。利用TMHMM Server 2.0 預(yù)測(cè)E1B-55K 的跨膜區(qū)結(jié)構(gòu)，見(jiàn)圖4，結(jié)果顯示E1B-55K 形成跨膜結(jié)構(gòu)。

2.4 E1B-55K信號(hào)肽的預(yù)測(cè)結(jié)果

利用德泰生物推出的測(cè)評(píng)軟件預(yù)測(cè)信號(hào)肽，見(jiàn)圖5，結(jié)果發(fā)現(xiàn)E1B-55K 蛋白無(wú)信號(hào)肽。

圖3 E1B-55K 親疏水性形成圖Fig. 3 Hydrophilic and hydrophobic formation of E1B-55K

圖4 E1B-55K 跨膜區(qū)形成圖Fig. 4 Formation of E1B-55K transmembrane region

圖5 E1B-55K 信號(hào)肽預(yù)測(cè)圖Fig 5 Prediction diagram of E1B-55K signal peptide

2.5 E1B-55K二級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)結(jié)果

通過(guò)網(wǎng)站 https://npsa-prabi.ibcp.fr/NPSA/npsa_sopma.html 預(yù)測(cè)E1B-55K 的二級(jí)結(jié)構(gòu)，見(jiàn)圖6，結(jié)果發(fā)現(xiàn)53個(gè)氨基酸（12.50%）參與 折疊的形成，164個(gè)氨基酸（38.68%）參與 螺旋的形成，有100個(gè)氨基酸（23.58%）和107個(gè)氨基酸（25.24%）分別構(gòu)成了無(wú)規(guī)卷曲和延伸鏈。

圖6 E1B-55K 二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)圖Fig. 6 Secondary structure prediction diagram of E1B-55K

2.6 E1B-55K三級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)結(jié)果

采用phyre2 預(yù)測(cè)E1B-55K 蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)，見(jiàn)圖7，結(jié)果發(fā)現(xiàn)E1B-55K 蛋白的可信度和覆蓋率分別為38.6%和2%。

2.7 E1B-55K抗原表位的預(yù)測(cè)結(jié)果

采用Predicting Anti-genic Peptides 預(yù)測(cè)E1B-55K蛋白抗原決定簇，見(jiàn)表2，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，E1B-55K 蛋白有17個(gè)抗原決定簇。通過(guò)ABCpred 預(yù)測(cè)E1B-55K 的B細(xì)胞抗原，見(jiàn)表3，結(jié)果發(fā)現(xiàn)45個(gè)優(yōu)勢(shì)的B 細(xì)胞抗原表位存在于E1B-55K 蛋白中。

圖7 E1B-55K 三級(jí)結(jié)構(gòu)的測(cè)定生成圖Fig. 7 Generated diagram of determination of E1B-55K tertiary structure

表2 E1B-55K 抗原表位的預(yù)測(cè)表Table 2 Prediction table of antigen epitope of E1B-55K

表3 E1B-55K 的B 細(xì)胞抗原的預(yù)測(cè)Table 3 Prediction of B cell antigen of E1B-55K

3 討論

CAdV-1 的E1區(qū)包括E1A、E1B-55K 和E1B-19K。其中E1B-55K 可延緩細(xì)胞過(guò)早凋亡，并協(xié)助mRNA的翻譯。使用生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)E1B-55K 蛋白的理化性質(zhì)、親疏水性、跨膜區(qū)結(jié)構(gòu)、二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)、磷酸化及糖基化位點(diǎn)和抗原表位，并分析其功能和結(jié)構(gòu)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)E1B -55K 有424個(gè)氨基酸。原子組成為C2199H3535N575O538S39，分子量為47887.13，帶負(fù)電與正電的氨基酸殘基數(shù)分別為25 和46，不穩(wěn)定指數(shù)為42.53。E1B-55K 蛋白有23個(gè)磷酸化位點(diǎn)。只有1個(gè)糖基化位點(diǎn)位于第64 位。E1B-55K 是平均親水系數(shù)為0.662 的疏水蛋白，無(wú)信號(hào)肽和跨膜區(qū)結(jié)構(gòu)。二級(jí)結(jié)構(gòu)中 折疊占12.5%、螺旋占38.68%、無(wú)規(guī)卷曲和延伸鏈分別為23.58%和25.24%。在三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)時(shí)，獲得E1B-55K 蛋白的可信度和覆蓋率分別為38.6%和2%。有17個(gè)抗原決定簇和45個(gè)優(yōu)勢(shì)的B 細(xì)胞抗原表位存在于E1B-55K 蛋白中。預(yù)測(cè)E1B-55K 的性質(zhì)、結(jié)構(gòu)和功能有助于E1B-55K 蛋白的表達(dá)和純化。

預(yù)測(cè)E1B-55K 理化性質(zhì)與一級(jí)結(jié)構(gòu)后，可利用E1B-55K 的親水膠體性質(zhì)，使用透析的方法達(dá)到純化E1B-55K 蛋白的目的；根據(jù)獲得的等電點(diǎn)，可利用電泳法分離純化E1B-55K；利用蛋白質(zhì)的變性失活實(shí)現(xiàn)消毒滅菌；了解E1B-55K 蛋白的相關(guān)性質(zhì)有利于目的蛋白的分離，可促進(jìn)下一步反應(yīng)的進(jìn)行。

蛋白的磷酸化是調(diào)節(jié)和控制蛋白功能和細(xì)胞信號(hào)傳遞最重要的反應(yīng)機(jī)制之一。酪氨酸與絲氨酸位點(diǎn)不僅能進(jìn)行蛋白的磷酸化反應(yīng)，還可激活蛋白活力。多蛋白復(fù)合體是酪氨酸與其他蛋白作用形成的，多蛋白復(fù)合體使細(xì)胞分裂和DNA 復(fù)制加速，并促進(jìn)蛋白磷酸化的循環(huán)。2017年，錢(qián)海[10]等人將胃癌細(xì)胞EGFR 介導(dǎo)的蛋白進(jìn)行磷酸化，并聯(lián)合雙向電泳和質(zhì)譜分析技術(shù)，發(fā)現(xiàn)Ⅱ型cGMP 依賴(lài)性蛋白激酶抑制EGFR 蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激活，進(jìn)而影響胃癌細(xì)胞的活動(dòng)。激發(fā)蛋白酪氨酸磷酸化的酶是酪氨酸激酶，此酶有助于進(jìn)行抗腫瘤藥物的研制與開(kāi)發(fā)。劉順利[11]以結(jié)合蛋白（FSCB）為實(shí)驗(yàn)材料利用蛋白激酶A（PKA）進(jìn)行體外磷酸化實(shí)驗(yàn)，將產(chǎn)物進(jìn)行電泳，用抗磷酸化PKA 底物抗體和抗磷酸化酪氨酸抗體進(jìn)行免疫印跡試驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)FSCB可促進(jìn)精子獲能，PKA磷酸化和酪氨酸磷酸化均有發(fā)生。E1B-55K 蛋白有23個(gè)磷酸化位點(diǎn)，其中絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸分別為13個(gè)、9個(gè)和1個(gè)。E1B-55K 蛋白的磷酸化反應(yīng)促進(jìn)機(jī)體進(jìn)行共價(jià)修飾，降低DNA 相互結(jié)合的幾率，使DNA 解螺旋進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞周期。

蛋白質(zhì)糖基化可提高蛋白的穩(wěn)定性，促進(jìn)蛋白構(gòu)象的正確折疊，有利于蛋白定位等[12]。蛋白糖基化之后對(duì)熱變形有一定的抗性，糖蛋白是蛋白質(zhì)經(jīng)糖基化作用形成的，調(diào)節(jié)蛋白的功能。蛋白糖基化主要通過(guò)調(diào)節(jié)蛋白表面的糖鏈，調(diào)控蛋白的半衰期、溶解度和活性。通過(guò)與蛋白相適應(yīng)的載體進(jìn)行糖基化反應(yīng)，可顯著提高蛋白的治療效果并減小毒副作用，促進(jìn)人體對(duì)藥物的消化吸收[13]。大多數(shù)參與機(jī)體固有免疫和適應(yīng)性免疫的關(guān)鍵分子都是糖蛋白，其影響了病毒對(duì)機(jī)體的繁殖與侵襲，比如艾滋病，其受體為CD4，當(dāng)CD4 的4個(gè)N-糖基化位點(diǎn)全部表達(dá)時(shí)，CD4 形成正確折疊導(dǎo)致艾滋病[14]。采用生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)E1B-55K 蛋白，發(fā)現(xiàn)在第64 位存在1個(gè)糖基化位點(diǎn)，E1B-55K 蛋白糖基化對(duì)蛋白質(zhì)的翻譯和信號(hào)的傳遞具有重要作用，并促進(jìn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)折疊成正確的多肽。

蛋白的親疏水性決定 螺旋的形成，與蛋白的穩(wěn)定性有關(guān)。蛋白的親疏水性是形成二級(jí)結(jié)構(gòu)、三級(jí)結(jié)構(gòu)和結(jié)構(gòu)域等的基礎(chǔ)。CAdV-1 中的E1B-55K 蛋白為疏水蛋白，采用疏水作圖法，分析E1B-55K 蛋白多肽鏈中不同肽段的疏水性，預(yù)測(cè)其抗原決定簇，為分析抗原決定簇奠定基礎(chǔ)，同時(shí)也促進(jìn)機(jī)體蛋白折疊成更加復(fù)雜的高級(jí)結(jié)構(gòu)，發(fā)揮生物學(xué)功能。

蛋白質(zhì)跨膜區(qū)是含有20～25個(gè)氨基酸殘基的 螺旋結(jié)構(gòu)，但絕大多數(shù)都是疏水氨基酸。呂麗珊[15]采用RT-PCR 技術(shù)將流感病毒HA 跨膜區(qū)基因克隆到pFast Dual 載體，將獲得的質(zhì)粒進(jìn)行轉(zhuǎn)化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)流感病毒HA 跨膜區(qū)能增加IBV 的交叉免疫性。E1B-55K 蛋白形成的跨膜結(jié)構(gòu)，有利于E1B-55K 蛋白在生物體的定位，協(xié)助膜蛋白與細(xì)胞膜的黏附，為分析E1B-55K 的功能和表達(dá)方式提供幫助。

疏水氨基酸是構(gòu)成蛋白信號(hào)肽的主要元件，在N和C末端分別有正電氨基酸和極性氨基酸。將蛋白引導(dǎo)到細(xì)胞各種亞細(xì)胞器內(nèi)是由信號(hào)肽完成的。徐棟生[16]采用PCR 技術(shù)用不同類(lèi)型信號(hào)肽代替肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子的信號(hào)肽，并載入中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞，以此來(lái)挑選適合其生長(zhǎng)的最佳信號(hào)肽，促進(jìn)中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞分泌外源蛋白。齊安生[17]利用PCR 方法將帶有和不帶有信號(hào)肽序列的溶血素基因分別轉(zhuǎn)載到大腸桿菌中，進(jìn)行溶血和免疫印跡試驗(yàn)，結(jié)果表明帶有信號(hào)肽序列的溶血素基因有利于大腸桿菌的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)。通過(guò)分析發(fā)現(xiàn)CAdV-1 中的E1B-55K 蛋白無(wú)信號(hào)肽，說(shuō)明E1B-55K不是分泌型蛋白。

掌握蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)有利于研制亞單位疫苗。張德峰[18]采用生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)結(jié)核分枝桿菌CarD 蛋白的結(jié)構(gòu)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CarD 可與RNA 聚合酶結(jié)合，控制轉(zhuǎn)錄方向，并且CarD 的C 和N 末端結(jié)構(gòu)域穩(wěn)定，可作為特異性抗結(jié)核的新靶標(biāo)。白皓等[19]首先采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 技術(shù)研究小鼠CYP2J5基因的差異表達(dá)，隨之利用在線軟件預(yù)測(cè)CYP2J5 基因結(jié)構(gòu)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該基因蛋白的二、三級(jí)結(jié)構(gòu)在性激素的合成、脂代謝及脂肪酸代謝中發(fā)揮重要作用。

蛋白的抗原表位可人工合成，刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體反應(yīng)，增強(qiáng)機(jī)體免疫原性。程凱慧等[20]利用基因合成技術(shù)合成牛冠狀病毒（BCoV）S 蛋白抗原表位的基因串聯(lián)體，進(jìn)行基因重組，轉(zhuǎn)載到大腸桿菌中并獲得了BCoV抗血清，促進(jìn)BCoV多表位疫苗的研究。于天飛[21]以抗原表位C 的編碼核酸為實(shí)驗(yàn)材料，以串聯(lián)方式進(jìn)行重組蛋白的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)重組蛋白的抗原性增強(qiáng)，有利于進(jìn)行豬的傳染性胃腸炎的血清學(xué)診斷。E1B-55K蛋白有17個(gè)抗原決定簇和45個(gè)優(yōu)勢(shì)的B 細(xì)胞抗原表位，促進(jìn)E1B-55K 與其他蛋白的結(jié)合，增強(qiáng)生物體細(xì)胞免疫和體液免疫。

因此，預(yù)測(cè)E1B-55K 蛋白的二和三級(jí)結(jié)構(gòu)有利于進(jìn)行蛋白的生物合成與臨床用藥的研究。預(yù)測(cè)E1B-55K 蛋白的抗原表位，有助于篩選相應(yīng)的抗原決定簇和靶向目標(biāo)分子，可進(jìn)一步利用其研發(fā)疫苗。雖然本實(shí)驗(yàn)預(yù)測(cè)了E1B-55K 的理化性質(zhì)和結(jié)構(gòu)特征，為其應(yīng)用奠定基礎(chǔ)，但是仍需開(kāi)展實(shí)驗(yàn)進(jìn)行證實(shí)。