何奇松，閉璟珊，李廣平，文 明，蔣先彪，秦建有，周慶安，熊 毅，馬 琳※

(1.廣西壯族自治區(qū)動物疫病預(yù)防控制中心，廣西 南寧 530001；2.廣西恭城瑤族自治縣動物疫病預(yù)防控制中心，廣西 恭城 542599；3.廣西陽朔縣動物疫病預(yù)防控制中心，廣西 陽朔 541900)

目前國內(nèi)外關(guān)于竹鼠病毒性疾病的研究和報道較少，臨床上也沒有針對竹鼠病毒性疾病防治的相關(guān)措施，因此，對竹鼠開展相關(guān)病毒性疾病的研究對竹鼠疾病的防治具有重要意義。細(xì)小病毒（Parvovirus）是自然界中存在的最小的DNA 病毒之一，是一種無囊膜單鏈DNA 病毒，其基因組大約5 kb[1-2]。細(xì)小病毒可以感染哺乳動物（豬、牛和犬等）、禽類、節(jié)肢動物（蝦等）、昆蟲等50 多種生物[3]。根據(jù)所感染的宿主類型可以分為細(xì)小病毒亞科及濃核病毒亞科。細(xì)小病毒亞科進(jìn)一步可以分成8個屬，即阿留申病毒屬、禽細(xì)小病毒屬、博卡病毒屬、依賴病毒屬、紅病毒屬、細(xì)小病毒屬、四型病毒屬以及復(fù)制病毒屬[3]。其中，豬細(xì)小病毒1 型、犬細(xì)小病毒、水貂腸炎病毒等均能引起宿主產(chǎn)生嚴(yán)重的病理變化、且傳染性強，給養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大經(jīng)濟損失[4]。細(xì)小病毒的病毒粒子無囊膜，不含糖類及脂質(zhì)，結(jié)構(gòu)堅實致密，對外界環(huán)境具有很強的抵抗力，病毒可在糞便及固體污染物中存活數(shù)月至數(shù)年。因此，動物養(yǎng)殖場一旦感染細(xì)小病毒，想要通過消毒來徹底殺滅病毒是很難的。竹鼠養(yǎng)殖具有需要場地小，污染少，容易上手等優(yōu)點，曾被政府列為扶貧項目[5]。竹鼠抵抗力較強，在研究人員實地走訪的多個養(yǎng)殖場（戶）中得知，竹鼠的主要疫病集中在腹瀉方面，也給竹鼠養(yǎng)殖造成了不小的經(jīng)濟損失[6]。目前，我國對竹鼠常見疾病的調(diào)查及研究資料十分有限[7-11]，本文通過對竹鼠腹瀉病例的診斷和竹鼠細(xì)小病毒序列分析，為我國竹鼠病毒流行病學(xué)研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗病料為2019年初廣西某竹鼠養(yǎng)殖規(guī)模場送檢的發(fā)病竹鼠組織樣品。動物組織DNA 抽提試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、膠回收試劑盒及DL2000 DNA Marker 等購自天根生化科技有限公司，Ex taqDNA 聚合酶、pMD18-T 載體、內(nèi)切酶Hind III 和EcoR I 及大腸桿菌DH5 感受態(tài)細(xì)胞等購自寶生物工程有限公司。

1.2 引物設(shè)計和合成

參考Genbank 公布的細(xì)小病毒NS1 基因序列，用Premier 5.0 和Oligo 6.0 軟件設(shè)計一對特異引物擴增竹鼠細(xì)小病毒的NS1 基因，引物由寶生物工程有限公司合成，具體引物序列見表1。

表1 引物序列Table.1 Sequences of the primers

1.3 模版的提取及擴增

根據(jù)DNA 抽提試劑盒按說明書步驟提取模版，以提取后的DNA 為模板，用引物A1/A2 進(jìn)行NS1基因克隆。擴增體系為：模板DNA 5.0L，Premix Taq 12.5L，引物A1、A2 各1.0L，用ddH2O 加至25.0L。擴增程序：95℃3 min；94 ℃60 s，55 ℃50 s，72 ℃60 s，35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。用凝膠電泳檢測PCR 擴增產(chǎn)物。

1.4 產(chǎn)物的回收及鑒定

按膠回收試劑盒說明書步驟對擴增產(chǎn)物的目的片段進(jìn)行回收純化，與pMD18-T 載體連接后，轉(zhuǎn)化至DH5 感受態(tài)細(xì)胞，用玻璃棒均勻涂板，過夜培養(yǎng)，挑取白色菌落在LB 培養(yǎng)基上進(jìn)行擴大培養(yǎng)，然后提取質(zhì)粒，對質(zhì)粒進(jìn)行酶切和PCR 鑒定，陽性質(zhì)粒送至寶生物工程有限公司測序。

1.5 NS1基因序列分析

用Lasergene DNASTAR 7.1 軟件中MegAlign 程序?qū)δ康幕蛐蛄信cGenBank 上的細(xì)小病毒NS1 基因核苷酸序列進(jìn)行同源性比對分析，其中參考序列包括竹鼠細(xì)小病毒代表毒株（GenBank No.MF497824、GenBank No.MF497825）、國內(nèi)蝙蝠細(xì)小病毒代表毒株（GenBankNo.KJ641666）、牛細(xì)小病毒代表毒株（GenBank No.M14363）、犬細(xì)小病毒代表毒株CPV（GenBank No.M19296）、貓細(xì)小病毒代表毒株（GenBankNo.EU659111）、鵝細(xì)小病弱毒疫苗株（GenBank No.KC996729）、番鴨細(xì)小病毒代表毒株（GenBank No.KM093740）、水貂細(xì)小病毒代表毒株（GenBank No.D00765）、老鼠細(xì)小病毒代表毒株（GenBank No.U12469）、豬細(xì)小病毒弱毒株（GenBank No.NC001718）、浣熊細(xì)小病毒代表毒株（GenBank No.JN867610）及人類細(xì)小病毒毒株（Gen-Bank No.NC000883），并繪制遺傳進(jìn)化樹。

2 結(jié)果和分析

2.1 NS1基因擴增和鑒定結(jié)果

用凝膠電泳檢測擴增產(chǎn)物，結(jié)果在1000bp處出現(xiàn)特異性目的帶（見圖1），與擴增片段預(yù)期結(jié)果相符。重組質(zhì)粒用EcoRⅠ及Hind Ⅲ雙酶切，也得到1000 bp的目的帶（見圖2）。將陽性重組質(zhì)粒送至寶生物工程有限公司進(jìn)行測序，確定NS1 基因片段的大小為1000 bp。

圖1 NS1 基因片段的PCR 電泳圖Fig.1 Electrophoretogram of NS1 amplified by PCR

圖2 NS1 基因片段的酶切電泳圖Fig.2 Electrophoretogram of NS1 digested by enzyme

2.2 同源性分析結(jié)果

將測序所得的2 株細(xì)小病毒NS1 基因序列（分別將其命名為1-XQ 和3-ZQ）利用NCBI 中的Blast 進(jìn)行比對分析，結(jié)果顯示為細(xì)小病毒。應(yīng)用Lasergene DNASTAR 7.1 軟件中的MegAlign 程序 將1-XQ、3-ZQ 與GenBank 上收錄的細(xì)小病毒序列進(jìn)行比較分析（見圖3）。結(jié)果顯示，本實驗中，2 株細(xì)小病毒NS1基因序列（1-XQ，3-ZQ）核苷酸同源性為99.9%；與另外兩株廣西竹鼠細(xì)小病毒分離株（MF497824、MF497825）的核苷酸同源性分別為96.8%～97.5% 和96.9%～97.6%；與蝙蝠細(xì)小病毒（KJ641666）的同源性較高，為98.9%～99.0%；與老鼠細(xì)小病毒（U12469）的同源性為87.3%～87.6%；與犬細(xì)小病毒（M19296）的同源性為67.7%～68.6%、與貓細(xì)小病毒（EU659111 的同源性為69.0%～69.9%；與水貂細(xì)小病毒（D00765）的同源性為67.1%～68.5%；與豬細(xì)小病毒（NC001718）的同源性為64.8%～64.9%；與浣熊細(xì)小病毒（JN867610）的同源性為67.8%～68.6%；與牛、鵝、番鴨、人類等其他種類細(xì)小病毒核苷酸同源性較低，為31.8%～41.6%。

2.3 NS1基因遺傳進(jìn)化樹

應(yīng)用軟件MegAlign 6.0 分析實驗測序得到的2株竹鼠細(xì)小病毒株序列與參考毒株的親緣性和進(jìn)化關(guān)系，并構(gòu)建遺傳進(jìn)化樹（見圖4）。結(jié)果顯示本次檢測到的竹鼠細(xì)小病毒1-XQ 和3-ZQ 株與廣西竹鼠分離毒株（MF497824、MF497825）、中國分離到的蝙蝠毒株（KJ641666）親緣關(guān)系最近，屬于同一分支，而與牛、鵝、番鴨以及人類等其他種類細(xì)小病毒核苷酸序列遺傳進(jìn)化關(guān)系較遠(yuǎn)。

圖3 1-XQ、3-ZQ 與參考毒株NS1 基因核苷酸序列的同源性比較Fig.3 Homology comparison on nucleotide of NS1 gene among 1-XQ、3-ZQ strain and reference strains

圖4 基于NS1 基因片段核苷酸遺傳進(jìn)化樹Fig.4 Phylogenetic tree based on nucleotide sequences of NS1

3 討論

本實驗通過PCR 方法確診患病竹鼠感染了細(xì)小病毒，經(jīng)過測序分析、核苷酸同源性比較和遺傳進(jìn)化樹分析，2 株毒株與我國境內(nèi)的蝙蝠細(xì)小病毒株核苷酸同源性最高為98.9%～99.0%，親緣關(guān)系最為接近，說明該場竹鼠極有可能是通過蝙蝠而感染細(xì)小病毒。該2株毒株與廣西已發(fā)現(xiàn)的兩株毒株GX04、GX05 核苷酸同源性分別為96.8%～97.5%和96.9%～97.6%，說明廣西流行的竹鼠細(xì)小病毒毒株同源性較高，推測他們可能有共同祖源。該場雖在兩個不同月份都檢測出細(xì)小病毒，但無傳染性，都是零星發(fā)病，且無明顯季節(jié)性。

目前，對竹鼠免疫系統(tǒng)以及竹鼠感染細(xì)小病毒致病機理的研究還很少，只是從廣大養(yǎng)殖戶口中得知竹鼠甚少感染傳染病，發(fā)病大多集中在腹瀉和牙齒上，這是否是由于竹鼠自身的免疫系統(tǒng)功能強大，還是竹鼠細(xì)小病毒致病性較弱，還需要進(jìn)一步的研究。

近年來，新發(fā)傳染性疾病給全世界公共衛(wèi)生帶來極大威脅，人類新發(fā)傳染病中有60%～80%來源于野生動物[12]，竹鼠是我國南方省區(qū)分布較廣的野生動物，也屬哺乳動物的一員，吸血節(jié)肢動物可以通過叮咬的途徑將其攜帶的病毒傳播給人類。因此，積極監(jiān)測竹鼠及其他野生動物中的病毒性感染情況，不僅對野生動物疾病的防治具有重要意義，還能為早期預(yù)警和防控其向人類傳播提供科學(xué)依據(jù)，進(jìn)一步維護(hù)人類的公共衛(wèi)生安全。

4 結(jié)論

1-XQ、3-ZQ 毒株與廣西竹鼠細(xì)小病毒分離株及國內(nèi)蝙蝠細(xì)小病毒分離株親緣關(guān)系最近，屬于同一分支。