李慶超，劉艷環(huán)，李海濤，朱言柱，肖家美，趙艷，苗利光※

（1.山東師范大學(xué)，山東 濟(jì)南 250014；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所，吉林 長春 130112）

牛病毒性腹瀉病毒（Bovine viral diarrhea virus,BVDV）是引起牛腹瀉的主要病原，主要宿主為牛、羊、豬和鹿等，造成牛病毒性腹瀉/粘膜病。目前，該病毒在世界范圍內(nèi)廣泛分布。牛病毒性腹瀉病毒基因組為12300 nt 左右的正鏈RNA，無Poly（A）尾[1]，含有1個(gè)開放閱讀框，編碼1個(gè)約4000個(gè)氨基酸的多聚蛋白[2]。病毒進(jìn)入細(xì)胞后，基因組首先指導(dǎo)合成1個(gè)多聚蛋白，后者隨后被加工成成熟的病毒蛋白?？勺x框兩側(cè)具有的5'和3'端非編碼區(qū)對(duì)病毒RNA 基因組的轉(zhuǎn)譯起始和穩(wěn)定性具有重要意義[3-4]。根據(jù)BVDV 基因組5'端序列差異，可將其分為1、2 兩種基因型，每種基因型下分為若干個(gè)亞型，主要有4種，2a1、2a2、2b1和2b2[5]。

目前，對(duì)該病防治的主要手段是疫苗免疫和淘汰持續(xù)感染牛。BVDV 疫苗以BVDV-1 株為主，但嚴(yán)重的臨床癥狀和急性感染多由BVDV-2 引起，BVDV-1疫苗不足以保護(hù)BVDV-2型病毒所引起的急性感染[6-8]，所以亟待加強(qiáng)BVDV-2 型疫苗的研究。BVDV JZ05-1毒株為中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所預(yù)防獸醫(yī)研究室分離的1 株牛源BVDV，鑒定為BVDV-2 型毒株，在牛胎腎細(xì)胞（madin darby bovine kidney cells）上可以穩(wěn)定增殖傳代，產(chǎn)生典型的細(xì)胞病變。早期動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，JZ05-1 是弱毒株，攻毒后鼻拭子分離病毒不返強(qiáng)，能夠產(chǎn)生很好的免疫保護(hù)作用。JZ05-1 毒株全基因組序列與BVDV-2 型其他毒株的全基因序列有較大差異[9]，為進(jìn)一步確定該病毒的特性，本試驗(yàn)通過預(yù)測5'、3'-UTR 二級(jí)結(jié)構(gòu)、毒力標(biāo)記、結(jié)構(gòu)蛋白編碼區(qū)突變以及RdRp 同源建模等方法對(duì)該病毒的基因進(jìn)行分析，詳細(xì)確定該毒株與其他2 型毒株的關(guān)系、探討非編碼區(qū)結(jié)構(gòu)特征以及編碼區(qū)突變規(guī)律，為疫苗研制提供理論基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 毒株及基因組序列

BVDV JZ05-1 分離株基因組序列GenBank 登錄號(hào)為GQ888686；其它基因序列所屬BVDV 分離株名稱有BVDV-2：V-FLL、NY'93、NY'97、XJ-04、4C5174、104/98、SW90、17011、BS-95-II、Giessen-1、Soldan、VS-63、VS-123.4、34b、C413、bv54、p11Q、1373、P24515；BVDV-1：NY1、ZM-95、C24V、NADL、Singer、Osloss、SD1、KE9、VEDEVAC、CP7-5A、ILLNC。

1.2 生物信息學(xué)軟件

生物信息學(xué)軟件主要有Vector NTI Advance 11（Invitrogen）、CLC RNA Workbench 4（CLCBio）、MEGA 4（the biodesign Institute,arizona state university）、Swiss-PdbViewer（the swiss institute of bioinformatics）等由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所經(jīng)濟(jì)動(dòng)物疫病研究室提供。

2 方法

2.1 非編碼區(qū)RNA 二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測

使用Vector NTI Advance 11 查找BVDV JZ05-1全基因組序列開放閱讀框，確定病毒3'-UTR 及5'-UTR區(qū)域；使用AlignX 程序?qū)Y'93、p11Q、XJ-04 非編碼區(qū)進(jìn)行多序列比對(duì)，并使用CLC RNA Workbench 4 預(yù)測非編碼區(qū)RNA 二級(jí)結(jié)構(gòu)，進(jìn)而探討非編碼區(qū)RNA一級(jí)結(jié)構(gòu)與二級(jí)結(jié)構(gòu)間的關(guān)系。

2.2 結(jié)構(gòu)蛋白編碼區(qū)突變分析

以BVDV-2 標(biāo)準(zhǔn)株NY'93 毒株、加拿大p11Q 毒株、我國XJ-04 株及JZ05-1 毒株為研究對(duì)象，統(tǒng)計(jì)比較包括BVDV 結(jié)構(gòu)蛋白和部分p7 蛋白在內(nèi)的可讀框前4kb 堿基變化。

2.3 同源建模及蛋白突變分析

選取BVDV 非結(jié)構(gòu)蛋白NS5B（RNA 依賴RNA聚合酶，RdRp）為代表，通過Swiss-model 服務(wù)器，以已發(fā)表的BVDV RdRp（PDB：1s4f）結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)，進(jìn)行同源建模。利用Swiss-PdbViewer 生物信息學(xué)軟件進(jìn)行分析。

2.4 毒力標(biāo)記分析

選取JZ05-1 毒株的5'-UTR 序列與BVDV-1 型毒株Osloss、SD1、NADL、NY1 和BVDV-2 型強(qiáng)度毒株NY'93、890、17583、23025 及BVDV-2 型弱毒株17011、7937、713、5521 的5'-UTR 序列進(jìn)行毒力標(biāo)記比較，分析JZ05-1 毒株毒力位點(diǎn)堿基類型與毒力的關(guān)系。

3 結(jié)果

3.1 非編碼區(qū)RNA 二級(jí)結(jié)構(gòu)

選取BVDV-2 代表株NY'93 以及我國2 型毒株XJ-04 及本實(shí)驗(yàn)所用JZ05-1 毒株的5'、3'-UTR，利用RNA 生物學(xué)分析軟CLC RNA Workbench 4 預(yù)測RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，3個(gè)2 型毒株間具有明顯的保守二級(jí)結(jié)構(gòu)；5'-UTR 可分為Ⅰ區(qū)、Ⅱ區(qū)和Ⅲ區(qū)3個(gè)結(jié)構(gòu)域（圖1A），其中，Ⅰ區(qū)和Ⅲb～Ⅲe 區(qū)在BVDV 病毒中結(jié)構(gòu)最為保守；Ⅱ區(qū)結(jié)構(gòu)可變性強(qiáng)，3個(gè)毒株間Ⅱ區(qū)結(jié)構(gòu)差異明顯；JZ05-1 在Ⅲa 區(qū)與其他2個(gè)毒株結(jié)構(gòu)具有明顯差異，在150 nt 左右區(qū)域形成1個(gè)獨(dú)特的頸環(huán)結(jié)構(gòu)。結(jié)合序列比對(duì)可知，5'-UTR 具有1個(gè)可變區(qū)，即Ⅱ區(qū)，造成RNA 二級(jí)結(jié)構(gòu)較大的變化；其他堿基突變則主要分布于RNA 二級(jí)結(jié)構(gòu)頸環(huán)交界處，造成loop 環(huán)大小的細(xì)微變化，基本不影響RNA 二級(jí)結(jié)構(gòu)。

BVDV 3'-UTR 與5'-UTR 相比，結(jié)構(gòu)保守性差。JZ05-1 的3'-UTR 可分為3個(gè)獨(dú)立的結(jié)構(gòu)區(qū)域，但其他毒株不具備此特征（圖1B）。JZ05-1 與NY'93 在150～200 nt 區(qū)形成極其相似的折疊，而與XJ-04 株在40 nt 左右處形成相似的折疊區(qū)域。通常3'-UTR 結(jié)構(gòu)可變性強(qiáng)，但JZ05-1 結(jié)構(gòu)與NY'93 更相似。結(jié)合序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，3'-UTR 可變區(qū)存在于JZ05-13'-UTR 第一折疊區(qū)，同樣，可變區(qū)外的堿基突變主要分布于頸環(huán)交界處。

圖1 JZ05-1 毒株5'-UTR（A）和3'-UTR（B）非編碼區(qū)二級(jí)結(jié)構(gòu)Fig.1 Secondary structure of 5'-UTR(A)and 3'-UTR(B) of JZ05-1 strain

3.2 結(jié)構(gòu)蛋白編碼區(qū)序列突變

選取JZ05-1 毒株結(jié)構(gòu)蛋白編碼區(qū)共4 kb 序列作為分析對(duì)象，結(jié)合我國XJ-04、美國NY'93 以及加拿大p11Q，分析其毒株間差異堿基位點(diǎn)、堿基突變類型、堿基位置以及氨基酸突變類型。4 株BVDV-2 毒株在結(jié)構(gòu)蛋白編碼區(qū)共有661 處差異，占4 kb 堿基的16.5%，其中，多數(shù)為1個(gè)毒株特有或者2個(gè)毒株共有堿基。JZ05-1 特有堿基位點(diǎn)為201 處，XJ-04 特有堿基位點(diǎn)為174 處，中國JZ05-1 和XJ-04 共有的與另外2 株美洲毒株間差異為117 處，這些堿基突變位點(diǎn)占全部堿基突變位點(diǎn)的74.4%，美洲毒株NY'93 及p11Q 的特有堿基位點(diǎn)分別僅為66 處和42 處（圖2A）。堿基突變主要發(fā)生于氨基酸密碼子的第3 位，共377 處，占全部突變的57.0%（圖2B）。突變類型主要為嘌呤間（A/G）或者嘧啶間（U/C）的替換，其中嘌呤堿基替換268 處，嘧啶堿基替換282 處，分別占全部堿基突變的40.5%和42.7%（圖2C）。4個(gè)毒株間結(jié)構(gòu)蛋白編碼區(qū)編碼氨基酸差異181 處，占氨基酸殘基總量的13.5%。不帶電氨基酸之間的替換占總量的61.3%，其中，以側(cè)鏈較小的非極性氨基酸間替換最多，共有64 處（圖2D）。

圖2 結(jié)構(gòu)蛋白編碼區(qū)突變分析Fig.2 Mutations in structure protein coding region

3.3 RdRp 同源建模

根據(jù)已測的BVDV RdRp 蛋白晶體結(jié)構(gòu)（1s4f），利用Swiss-model 服務(wù)器，對(duì)JZ05-1RdRp 進(jìn)行同源建模[10-12]。利用Swiss-PdbViewer 生物信息學(xué)軟件顯示預(yù)測結(jié)果，并與原模版進(jìn)行比較[12]。BVDV 的RdRp 具有核酸復(fù)制酶典型的手狀結(jié)構(gòu)，具有“手掌”、“拇指”以及“四指”結(jié)構(gòu)域，活性部位位于手掌內(nèi)側(cè)，由“拇指”及“四指”結(jié)構(gòu)域包圍，是典型的RNA 合成酶構(gòu)型。但與丙型肝炎病毒（HCV）等的RdRp 分子比較，BVDV RdRp 的N 端具有1個(gè)較長的突出結(jié)構(gòu)域。氨基酸殘基可及性和氨基酸差異標(biāo)記晶體結(jié)構(gòu)預(yù)測模型結(jié)果表明，差異氨基酸主要存在于RdRp 蛋白表面可及性好的區(qū)域，位于疏水區(qū)以及蛋白內(nèi)部活性中心區(qū)域的氨基酸位點(diǎn)極少突變，結(jié)果見圖3。

圖3 BVDV RdRp 三維結(jié)構(gòu)模型Fig.3 Structure of BVDV RdRp. There are taken on a different color acceding to accessibility and alignment diversity

3.4 毒力標(biāo)記

按照Christina L[13]的BVDV 毒力標(biāo)記規(guī)律，強(qiáng)毒株在219 和278 位分別為U 和C 堿基，弱毒株為C 和U 堿基（圖4A）。JZ05-1 毒株分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，219 位為弱毒標(biāo)記（圖4B），278 位為強(qiáng)毒株標(biāo)記（圖4C），說明JZ05-1 毒株毒性不完全符合BVDV 毒力標(biāo)記規(guī)律。

4 討論與結(jié)論

BVDV 屬正鏈RNA 病毒，僅轉(zhuǎn)染基因組RNA 進(jìn)入細(xì)胞即可產(chǎn)生具有感染性的成熟病毒粒子，因此病毒基因組RNA序列幾乎可以代表該病毒的全部生物學(xué)特性。該病毒基因組共有3 部分組成，5'-末端莖環(huán)結(jié)構(gòu)在RNA 翻譯起始和有效復(fù)制過程中起關(guān)鍵作用[14-15]；單個(gè)大的ORF 編碼1個(gè)多聚蛋白，直接影響病毒抗原性、致細(xì)胞病變以及病毒復(fù)制能力；ORF 之后，3'-NCR 的具有1個(gè)可變區(qū)和1個(gè)保守的3'-末端莖環(huán)結(jié)構(gòu)以及1個(gè)單鏈區(qū)，對(duì)病毒RNA 穩(wěn)定性以及負(fù)鏈RNA合成至關(guān)重要[16-17]。

非編碼區(qū)是RNA 基因組表達(dá)及復(fù)制所必須的結(jié)構(gòu)，有重要的初級(jí)和二級(jí)結(jié)構(gòu)元件，可與病毒及宿主蛋白因子結(jié)合[18]。分析表明，BVDV-2 型毒株在5'-UTR具有保守二級(jí)結(jié)構(gòu)區(qū)域Ⅰ區(qū)和Ⅲb～Ⅲe 區(qū)，后者是IRES 所在處，介導(dǎo)病毒RNA 5'-帽子非依賴的翻譯起始。毒株間Ⅱ區(qū)的二級(jí)結(jié)構(gòu)差異較大，且具有較高的可變性，JZ05-1 毒株在Ⅲa 區(qū)與其他毒株存在差異，具有獨(dú)特的二級(jí)結(jié)構(gòu)。3'-UTR 涉及RNA 翻譯的正確終止以及病毒RNA 穩(wěn)定性和復(fù)制的完成。通過研究比較表明，BVDV 3'-UTR 雖然序列具有較高的保守性，但不具有明顯的保守二級(jí)結(jié)構(gòu)，因此，3'-UTR 可能主要以初級(jí)結(jié)構(gòu)元件發(fā)揮其作用，這一點(diǎn)與5'-UTR 不同。JZ05-1 的3'-UTR 分別與NY'93 和XJ-04 具有相似之處，與美國NY'93 株更接近。

圖4 BVDV-2 位于5'-UTR 的毒力標(biāo)記Fig.4 Virulence markers in the 5'-UTR of BVDV-2

早在1998年，Christina L 等人分析了BVDV-1 以及BVDV-2 數(shù)十株強(qiáng)、弱毒株5'-UTR 序列，總結(jié)了位于Ⅲ區(qū)的2個(gè)毒力標(biāo)記發(fā)現(xiàn)，強(qiáng)毒株在219 和278 位分別為U 和C 堿基，而弱毒株為C 和U。本試驗(yàn)所用JZ05-1 經(jīng)實(shí)驗(yàn)證明為1 株弱毒株，分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，其在219 位為弱毒標(biāo)記，但在278 位為強(qiáng)毒株標(biāo)記，由此可見，JZ05-1 不符合上述毒力標(biāo)記結(jié)論。通過將非編碼區(qū)二級(jí)結(jié)構(gòu)和多序列比對(duì)結(jié)合的研究表明，堿基突變除發(fā)生于5'-UTR Ⅱ區(qū)以及3'-UTR Ⅰ區(qū)可變區(qū)外，多數(shù)位于頸環(huán)結(jié)構(gòu)交接處，這些突變的存在基本不影響RNA 保守二級(jí)結(jié)構(gòu)，特別是5'-UTR 的Ⅲ區(qū)。然而上述兩個(gè)毒力標(biāo)記恰位于這些容易突變的區(qū)域，這些突變?nèi)绾斡绊懖《径玖δ壳斑€不清楚，但是分析結(jié)果表明，278 位做為毒力標(biāo)記的結(jié)論不適用于JZ05-1毒株。

結(jié)構(gòu)蛋白決定病毒粒子組成、病毒吸附侵入以及抗原性，發(fā)生突變會(huì)直接影響疫苗毒株與野毒交叉保護(hù)效應(yīng)。同時(shí)，包膜蛋白雖然是該病毒突變能力最強(qiáng)的蛋白，但其可變性要受到自然選擇的限制。本試驗(yàn)以病毒結(jié)構(gòu)蛋白編碼序列區(qū)為研究對(duì)象，探討病毒突變類型以及位置，結(jié)果顯示，分離自我國的2 株BVDV-2 毒株具有大量的獨(dú)特堿基，與美洲NY'93 以及p11Q 毒株差異很大，這可能造成國外BVDV-2 疫苗用于我國BVDV 防控不能達(dá)到良好效果的原因。通常情況下，堿基突變主要發(fā)生在密碼子第3 位，以A/G 以及U/C間的替換為主，不會(huì)造成氨基酸種類的改變，因此，病毒突變堿基的分布特征造成堿基突變大部分為中性突變。氨基酸種類發(fā)生變化的突變則主要集中于不帶電氨基酸的替換，特別是小氨基酸殘基的非極性氨基酸。BVDV 屬RNA 病毒，具有高度可變性，但是其宿主是以DNA 為遺傳物質(zhì)的哺乳生物，遺傳穩(wěn)定性極強(qiáng)，這造成病毒生存環(huán)境的穩(wěn)定，由此產(chǎn)生的自然選擇壓力限制了其可變性，只有大多數(shù)中性突變以及次要氨基酸的突變被保留下來。但是，為何我國BVDV-2 毒株與其他國家和地區(qū)分離株具有較大差異，還需要進(jìn)一步研究。

BVDV 非結(jié)構(gòu)蛋白與病毒蛋白加工、致細(xì)胞病變的產(chǎn)生以及RNA 復(fù)制密切相關(guān)。研究表明，NS2-3 裂解是RNA 復(fù)制所必需的，且被極微量的細(xì)胞伴侶分子Jiv 所調(diào)控。ncpBVDV 感染早期，NS2-3 幾乎完全裂解，致使產(chǎn)生NS3 并參與RNA 復(fù)制。感染后期Jiv 含量有限，NS2-3 自剪切加工不能進(jìn)行，NS2-3 含量提高且病毒RNA 合成效率下降[19]。病毒基因組重組插入病毒（Npro、NS2）或者宿主基因（Jiv、Ub）片段造成NS2-3 的組成性切割，使病毒可無限制地產(chǎn)生NS3 蛋白，RNA 復(fù)制得不到控制，繼而引發(fā)細(xì)胞病變以及凋亡。JZ05-1 毒株基因組不具有插入和缺失，是1 株無基因重組但具有cpe 的BVDV-2 毒株。此種cpeBVDV 分離株，NS2-3 自切蛋白酶活性增加是因?yàn)樵贜S2 基因上的點(diǎn)突變積累所造成的[20]，至于是哪些氨基酸的突變導(dǎo)致其自切酶活性增加，還有待于進(jìn)一步研究。