嚴世杰，芮萍，宋濤，付琦媛，王春芳，馬增軍

（河北科技師范學(xué)院，河北 秦皇島 066000）

毛皮動物人工飼養(yǎng)為高效益養(yǎng)殖行業(yè)。毛皮動物養(yǎng)殖在我國起步較晚，但發(fā)展很快，目前國內(nèi)毛皮動物養(yǎng)殖分布在15個省（區(qū)），河北省擁有多個“國家級標準化特種動物養(yǎng)殖示范區(qū)”和“裘皮服裝加工出口基地”，毛皮動物養(yǎng)殖規(guī)模大，效益高[1]。但當前由于缺乏與之相適應(yīng)的技術(shù)人才及具可操作性的標準化、規(guī)范化疫病防控技術(shù)體系，加之病毒的變異，病原多重感染，非典型化、亞臨床病征增多，仔貉發(fā)生腹瀉的病例屢見不鮮，嚴重限制了毛皮產(chǎn)業(yè)的健康快速發(fā)展。臨床研究發(fā)現(xiàn)引起仔貉腹瀉的病因復(fù)雜，氣候環(huán)境因素、飼喂不科學(xué)和病原感染等因素均可引起仔貉發(fā)病，病原感染主要包括病毒、細菌和寄生蟲感染[2]。其中，仔貉的細菌性腹瀉流行范圍較廣，菌株易產(chǎn)生耐藥性，引起仔貉腹瀉的細菌主要包括大腸桿菌、魏氏梭菌和沙門氏菌等[3,4]。多數(shù)貉患腹瀉病具有傳染性，導(dǎo)致仔貉生長緩慢、營養(yǎng)不良，進而影響毛皮質(zhì)量，造成嚴重的經(jīng)濟損失。

為了解秦皇島地區(qū)導(dǎo)致仔貉腹瀉的主要病原菌流行分布情況，本實驗室分別采集來自秦皇島地區(qū)5個規(guī)模化毛皮動物飼養(yǎng)場的10 只腹瀉病死仔貉，進行細菌分離鑒定、毒力基因檢測、致病性試驗和藥敏試驗，旨在確定致病菌株的耐藥性與致病性，以期為預(yù)防、控制該地區(qū)仔貉細菌性腹瀉流行與敏感藥物的篩選提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1 試驗動物

30 只6～8 周齡雌性Balb/c 小鼠（約25 g），購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司。

1.2 主要試劑

普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、鮮血營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、麥康凱培養(yǎng)基、伊紅美藍培養(yǎng)基及LB 肉湯（北京路橋生物技術(shù)有限公司）；ID32 GN 革蘭氏陰性桿菌鑒定試條（法國梅里埃公司）；DL2000 Marker 和2 Es Taq MasterMix（北京賽百盛基因技術(shù)有限公司）；藥敏紙片（北京天壇藥物生物技術(shù)開發(fā)公司）。

2 方法

2.1 細菌分離培養(yǎng)及生化特性鑒定

無菌采集腹瀉仔貉小腸內(nèi)容物、腸系膜淋巴結(jié)、肝臟和脾臟樣本，劃線接種于麥康凱瓊脂培養(yǎng)基，置37℃恒溫培養(yǎng)箱，培養(yǎng)24～48 h 后觀察菌落特征，挑取紅色單個菌落接種于普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基進行純化，將純化菌株接種于伊紅美蘭瓊脂培養(yǎng)基和鮮血營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，經(jīng)37 ℃培養(yǎng)18～24 h 后觀察其溶血性等，并將疑似菌株用ID32 E 腸道桿菌鑒定試條進行生化鑒定。

2.2 小鼠致病性試驗

將30 只Balb/c 小鼠隨機分成6 組，每組5 只。將分離獲得的5 株優(yōu)勢菌株分別接種于LB 液體培養(yǎng)基，37 ℃增菌培養(yǎng)18 h，分別接種至各實驗組小鼠，實驗組每只小鼠腹腔注射菌液0.2mL（約含菌3.0108CFU/mL），同時設(shè)置對照組，對照組每只小鼠腹腔注射滅菌LB培養(yǎng)基0.2 mL。各組小鼠單獨隔離飼養(yǎng)，觀察發(fā)病和死亡情況，對死亡小鼠進行剖檢，無菌取其肝、脾、肺組織進行細菌分離鑒定，確定菌株致病性。

2.3 藥敏試驗

選擇常用的阿莫西林、四環(huán)素、復(fù)方新諾明、環(huán)丙沙星、氟苯尼考、克林霉素、頭孢氨芐、頭孢唑林、頭孢噻呋、慶大霉素、多粘菌素和強力霉素等12種抗生素的藥敏紙片，按照美國臨床檢驗標準委員會（NCCLS）推薦的標準用K-B 紙片法進行試驗操作和結(jié)果判斷[5]。

2.4 大腸桿菌毒力基因PCR 檢測

2.4.1 引物合成

按GenBank 公布的基因序列，參照文獻[6,7]中有關(guān)致病性大腸桿菌的9個毒力相關(guān)基因iutA、papC、afa、fyuA、astA、escV、eaeA、ler、irp2，共設(shè)計9 對引物，用于鑒定大腸桿菌毒力因子基因表型，引物由北京奧科鼎盛生物科技有限公司合成，見表1。

表1 引物序列和擴增條件Table 1 primer sequence and amplification program

2.4.2 PCR 擴增

利用水煮模板法提取細菌DNA，以DNA 為模板，用本研究設(shè)計合成的9 對大腸桿菌毒力基因特異性引物對分離菌株進行毒力因子基因表型檢測。PCR 反應(yīng)擴增體系為：DNA 模板4L，2 Es Taq MasterMix 預(yù)混液25L，上下游引物各1L，去離子水補足至50L。PCR 擴增程序為：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，根據(jù)各對引物的退火溫度退火30 s；72 ℃延伸1 min，進行35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR 產(chǎn)物經(jīng)由1%瓊脂糖凝膠電泳試驗進行檢測。

3 結(jié)果分析

3.1 細菌分離鑒定結(jié)果

從10 只以腹瀉為主病死仔貉的小腸和肝臟樣本培養(yǎng)物中分離獲得5 株細菌，分離菌株在鮮血平板培養(yǎng)基上生長良好，呈 溶血；在麥康凱瓊脂培養(yǎng)基呈紅色菌落，在伊紅美蘭瓊脂培養(yǎng)基上形成具有金屬光澤的中等大小表面光滑菌落，革蘭氏染色鏡檢為革蘭氏陰性桿菌。

3.2 生化鑒定結(jié)果

5株分離菌株經(jīng)NEWATB微生物鑒定分析系統(tǒng)檢測，結(jié)果顯示，生化鑒定結(jié)果與大腸埃希菌一致，見表2。

表2 分離菌株生化特性鑒定結(jié)果Table 2 Identification results of biochemical characteristics of the isolated strains

3.3 致病性試驗

5 株大腸桿菌分離物接種Balb/c 小鼠，3 h 后小鼠出現(xiàn)精神萎靡、食欲減退及反應(yīng)遲鈍等癥狀，試驗組小鼠在14～72 h 內(nèi)全部發(fā)病死亡，剖檢可見小鼠腸道出血，肝臟輕微腫大。取死亡小鼠的小腸、肝臟、脾臟及肺臟樣本，劃線接種于麥康凱瓊脂培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)24 h后在麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上生長出邊緣整齊、表面光滑的紅色圓形菌落（見圖1），經(jīng)生化鑒定與原接種菌生化特性一致。對照組小鼠生長正常，全部存活且未出現(xiàn)任何癥狀。

圖1 分離細菌的菌落形態(tài)Fig 1 Colonymorphologyofisolatedbacteria

3.4 藥敏試驗結(jié)果

藥敏試驗結(jié)果顯示，分離菌株對臨床常用抗菌藥物產(chǎn)生高度耐藥性，而且以多重耐藥為主。對阿莫西林、四環(huán)素、復(fù)方新諾明、環(huán)丙沙星、氟苯尼考和克林霉素的耐藥率高達80%～100%，對頭孢菌素類、慶大霉素、多粘菌素和強力霉素仍保持一定的抗菌活性，其中多粘菌素敏感性最高為100%，抗菌效果良好，結(jié)果見圖2。

圖2 藥敏試驗結(jié)果Fig 2 The result of antimicrobial susceptibility testing

3.5 大腸桿菌毒力基因檢測結(jié)果

對5 株分離菌株進行了9種毒力基因的PCR 檢測及測序鑒定，檢測結(jié)果見表3。ler、irp2、iutA、fyuA、astA、papC 6種基因檢出率分別為100%、100%、40%、40%、20%、20%。

表3 5 株大腸桿菌毒力基因檢測結(jié)果Table 3 Detection results of virulence genes of 5 isolated strains

4 討論

大腸桿菌是廣泛存在于人和動物的腸道及土壤、水中的一種重要的人畜共患病原菌[8]，引起人和動物發(fā)生腹瀉的大腸桿菌被稱為致瀉性大腸桿菌，準確鑒定致瀉性大腸桿菌對于腹瀉病的治療和防控尤為重要。血清型鑒定是臨床上區(qū)分大腸桿菌的傳統(tǒng)方法，但存在工作量較大、可重復(fù)性低的弊端。致瀉性大腸桿菌往往攜帶特定的毒力因子，利用PCR 擴增技術(shù)對特定的毒力因子進行檢測，有效提高檢測率的同時亦能極大地縮短檢測時間[9-11]。

貉源大腸桿菌可引起不同日齡仔貉發(fā)生急性或慢性腸道傳染病，仔貉、幼貉尤為易感，病貉多表現(xiàn)以腹瀉和敗血癥為主的臨床癥狀，呼吸系統(tǒng)及中樞神經(jīng)系統(tǒng)亦受到不同程度的侵害，嚴重者可導(dǎo)致急性死亡[12,13]。本研究在秦皇島市的5個規(guī)?；游镲曫B(yǎng)場的腹瀉病死仔貉中分離出5 株優(yōu)勢菌株，生化鑒定結(jié)果顯示導(dǎo)致仔貉腹瀉的主要病原菌為大腸桿菌。毒力因子檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)分離出的5 株與腹瀉仔貉的大腸桿菌均攜帶ler、irp2 毒力基因，部分菌株攜帶iutA、fyuA、astA、papC 毒力基因，結(jié)合致病性試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，5 株大腸桿菌具有較強致病性，對毛皮動物的生長發(fā)育存在較大威脅，需引起廣大養(yǎng)殖戶的高度重視。

近年來，由于抗生素的濫用以及細菌對抗生素類藥物的選擇壓力增加導(dǎo)致大腸桿菌對常用的抗生素產(chǎn)生了不同程度的耐藥性，此外，細菌的很多耐藥基因甚至可通過食物鏈傳遞給人類，對人類的生命健康造成嚴重威脅[14]。Zhang 等[15]人在2008-2015年間對我國多個省區(qū)的一萬余份豬、雞樣品進行檢測，發(fā)現(xiàn)大腸桿菌對氟苯尼考、頭孢噻呋等多種抗生素的耐藥性呈逐年增加趨勢，對氨芐青霉素、磺胺異噁唑及四環(huán)素3種抗生素的耐藥性甚至超過80%，表明抗生素耐藥性的問題日益嚴重。本研究通過藥敏試驗對分離到的5 株大腸桿菌進行檢測發(fā)現(xiàn)，其對多粘菌素和頭孢菌素類藥物保有抗菌活性，對阿莫西林、四環(huán)素等抗生素均產(chǎn)生了強耐藥性，且耐藥譜復(fù)雜，提示我們在防治大腸桿菌腹瀉病時應(yīng)注意規(guī)范抗生素的使用，選用敏感藥物并定期更換藥品種類，防止產(chǎn)生耐藥性。

仔貉腹瀉病發(fā)病率近年來呈逐年上升趨勢，且引起仔貉發(fā)病病因復(fù)雜，飼喂不合理、環(huán)境消毒不到位或更換飼料等應(yīng)激刺激可直接導(dǎo)致仔貉發(fā)病[2]，多種病毒病或寄生蟲感染通常易繼發(fā)大腸桿菌感染，同時存在多種病原菌混合感染的可能，極大地增加了防控難度[16,17]，因此，廣大養(yǎng)殖戶應(yīng)高度重視養(yǎng)殖場的衛(wèi)生防控工作，并制定科學(xué)合理的免疫程序和飼養(yǎng)計劃。

綜上所述，本研究通過細菌分離鑒定、藥敏試驗、生化鑒定及毒力基因檢測等對分離自腹瀉仔貉中的大腸桿菌進行了系統(tǒng)研究，可為臨床上貉源大腸桿菌病的防控奠定理論基礎(chǔ)。