楊夏 張西 龍秋蓉

貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院眼科（貴陽(yáng)550004）

眼瞼基底細(xì)胞癌是眼瞼常見(jiàn)惡性腫瘤，常發(fā)生于表皮基底細(xì)胞或皮膚附屬器，發(fā)病緩慢，惡性程度和轉(zhuǎn)移程度較低，但可侵襲性破壞局部組織，影響患者眼部功能和面部外觀［1-2］。腫瘤微環(huán)境包括腫瘤周?chē)|(zhì)細(xì)胞及其分泌的細(xì)胞因子、趨化因子等，這些因素之間相互作用及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)在腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用［3］。成纖維細(xì)胞是最主要的基質(zhì)細(xì)胞，在機(jī)體處于損傷、炎癥或腫瘤狀態(tài)下被激活，癌相關(guān)成纖維細(xì)胞（carcinomaassociated fibroblasts，CAFs）是腫瘤間質(zhì)活化的成纖維細(xì)胞，具有成纖維細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞共同特征，能為上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化提供促癌信號(hào)，在血管生成及腫瘤細(xì)胞增殖、遷移和侵襲過(guò)程中發(fā)揮重要作用［4-5］。成纖維細(xì)胞活化蛋白（fibroblast activation protein，F(xiàn)AP）是成纖維細(xì)胞活化后特異性表達(dá)的標(biāo)志物，可增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞侵襲力，促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)和增殖［6］。第10號(hào)染色體上磷酸酶和張力蛋白同源缺失的基因（phosphatase and tensin homology deleted on chromosome ten，PTEN）是一種抑癌基因，主要通過(guò)抑制磷脂酰肌醇3激酶（phosphatidyl inositol-3-kinase，PI3K）/絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶（serine-threonine protein kinase，AKT）通路在多種腫瘤組織中發(fā)揮抑癌作用［7］。既往人們對(duì)眼瞼基底細(xì)胞癌的研究多集中于癌細(xì)胞本身，對(duì)基質(zhì)成纖維細(xì)胞關(guān)注較少，眼瞼基底細(xì)胞癌細(xì)胞學(xué)特征提示，CAFs可能與其發(fā)生發(fā)展過(guò)程有關(guān)，目前相關(guān)報(bào)道尚少，本研究通過(guò)分離、培養(yǎng)人眼瞼基底細(xì)胞癌CAFs，探討FAP對(duì)其細(xì)胞增殖和凋亡的影響及可能作用機(jī)制，旨在為臨床治療眼瞼基底細(xì)胞癌提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 標(biāo)本來(lái)源選擇2018年6月至2019年8月期間本院收治的眼瞼基底細(xì)胞癌患者4例以及3例行上瞼皮膚松弛矯正術(shù)患者作為研究對(duì)象，患者均接受手術(shù)治療，收集手術(shù)切除組織，術(shù)后經(jīng)病理學(xué)鑒定為眼瞼基底細(xì)胞癌和正常眼瞼皮膚。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)審批通過(guò)，研究獲得患者同意并簽署知情同意書(shū)。

1.1.2 主要試劑FAP過(guò)表達(dá)、FAP shRNA及隨機(jī)序列shRNA慢病毒載體pLKO.1（美國(guó)Open biosystem公司），細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（碧云天生物技術(shù)有限公司），鼠抗人細(xì)胞角蛋白（cytokeratin，CK）單抗、鼠抗人α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）單抗、兔抗人波形蛋白（vimentin，VIM）單抗、兔抗人FAP多抗（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司），PTEN抑制劑bpv、兔抗人PTEN多抗、PI3K單抗、p-PI3K單抗、AKT多抗、p-AKT多抗（美國(guó)Abcam公司）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞分離、培養(yǎng)將眼瞼基底細(xì)胞癌和正常眼瞼皮膚組織置于無(wú)菌條件下，PBS沖洗干凈，剪去多余上皮和脂肪組織，用眼科剪將剩余組織剪碎，平鋪于培養(yǎng)瓶中，加入DMEM培養(yǎng)基，于體積分?jǐn)?shù)5%CO2，37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，2 ～3 d換液1次。獲得眼瞼CAFs和正常成纖維細(xì)胞（normal fibroblasts，NFs），于顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。

1.2.2 細(xì)胞鑒定細(xì)胞培養(yǎng)到第3代，制作細(xì)胞爬片，4%多聚甲醛固定30 min，PBS洗滌；加入1%Triton X-100，室溫孵育5 min，PBS洗滌；3% H2O2封閉10 min，PBS洗滌；山羊血清封閉15 min；滴加1∶100稀釋的CK、α-SMA、VIM、FAP一抗（以PBS代替一抗作為陰性對(duì)照），4 ℃孵育過(guò)夜，PBS洗滌；滴加二抗，37 ℃孵育30 min，PBS洗滌；滴加DAB顯色，自來(lái)水沖洗；蘇木素復(fù)染，封片，顯微鏡下觀察，細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)棕色顆粒判定為陽(yáng)性。

1.2.3 細(xì)胞分組及干預(yù)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期第3代純化的眼瞼CAFs隨機(jī)分為對(duì)照組、過(guò)表達(dá)組、敲降組、空載組、抑制劑組，過(guò)表達(dá)組、敲降組、空載組細(xì)胞分別用含有FAP、FAP shRNA、空載隨機(jī)序列慢病毒轉(zhuǎn)染，抑制劑組轉(zhuǎn)染含有FAP shRNA的慢病毒，同時(shí)培養(yǎng)基中加入250 nmol/L的bpv，對(duì)照組不做轉(zhuǎn)染處理。48 h后，熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率，均＞85%，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.4 眼瞼CAFs 增殖檢測(cè)各組細(xì)胞以1.0×104個(gè)/孔濃度接種于96孔板，每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔，置于體積分?jǐn)?shù)5% CO2，37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)分別培養(yǎng)24、48、72 h，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)結(jié)束前4 h按20 μL/孔加入0.5 mg/mL的MTT溶液，繼續(xù)孵育4 h，棄上清，按150 μL/孔加入DMSO，震蕩10 min，以充分溶解結(jié)晶，使用酶標(biāo)儀在490 nm處讀取各孔吸光度（A）值，以空白孔為對(duì)照，記錄數(shù)據(jù)，繪制生長(zhǎng)曲線。

1.2.5 眼瞼CAFs 凋亡檢測(cè)各組細(xì)胞，PBS洗滌2次，1 000 r/min（離心半徑8 cm）離心5 min，加入Binding buffer重懸細(xì)胞，加入5 μL AnnexinV-FITC避光條件下4 ℃孵育15 min，加入10 μL PI核酸染料染色5 min，上流式細(xì)胞儀，檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。

1.2.6 眼瞼CAFs FAP、PTEN、PI3K、Akt、p-Akt蛋白水平檢測(cè)細(xì)胞加入RIPA裂解液，離心取上清，BCA法定量，配制蛋白樣品，100 ℃水浴變性，進(jìn)行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂牛奶封閉2 h，加入FAP、PTEN、PI3K、Akt、p-Akt（1∶1 000）一抗，4 ℃孵育過(guò)夜，TBST洗膜，加入HRP耦連的二抗（1∶5 000），室溫孵育2 h，TBST洗膜，加入ECL發(fā)光液，曝光顯影，計(jì)算目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 25.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析數(shù)據(jù)，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多樣本計(jì)量資料比較采用單因素方差分析，兩兩樣本比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P ＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察倒置顯微鏡下可見(jiàn)：眼瞼CAFs呈長(zhǎng)梭形，細(xì)胞大小不一，數(shù)量較多，生長(zhǎng)速度快，排列紊亂，喪失密度抑制和接觸抑制；NFs呈扁平狀，細(xì)胞大小接近，細(xì)胞數(shù)量較少，生長(zhǎng)速度慢，排列規(guī)則，無(wú)重疊生長(zhǎng)。見(jiàn)圖1。

圖1 細(xì)胞形態(tài)Fig.1 Cell morphology

2.2 眼瞼CAFs 鑒定CAFs和NFs均不表達(dá)CK，均表達(dá)VIM陽(yáng)性；CAFs表達(dá)α-SMA、FAP陽(yáng)性，NFs表達(dá)α-SMA、FAP陰性。見(jiàn)圖2。

圖2 免疫組化染色（SP×200）Fig.2 Immunohistochemical staining（SP×200）

2.3 眼瞼CAFs 增殖情況與對(duì)照組、空載組比較，過(guò)表達(dá)組24、48、72 h MTT實(shí)驗(yàn)A值增大，敲降組及抑制劑組24、48、72 h MTT實(shí)驗(yàn)A值減?。≒ ＜0.05）；抑制劑組24、48、72 h MTT實(shí)驗(yàn)A值大于敲降組（P ＜0.05）。見(jiàn)圖3。

2.4 眼瞼CAFs 凋亡情況與對(duì)照組、空載組比較，過(guò)表達(dá)組凋亡率降低，敲降組、抑制劑組凋亡率升高（P ＜0.05）；抑制劑組凋亡率低于敲降組（P ＜0.05）。見(jiàn)圖4。

2.5 眼瞼CAFs FAP、PTEN、PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt 蛋白表達(dá)與對(duì)照組、空載組比較，過(guò)表達(dá)組FAP、p-PI3K、p-Akt表達(dá)升高，PTEN表達(dá)降低，敲降組、抑制劑組FAP、p-PI3K、p-Akt表達(dá)降低，PTEN表達(dá)升高（P ＜0.05）；抑制劑組PTEN表達(dá)低于敲降組，p-PI3K、p-Akt高于敲降組（P ＜0.05）。見(jiàn)圖5。

圖3 CAFs 生長(zhǎng)曲線Fig.3 CAFs growth curve

圖4 細(xì)胞凋亡率比較Fig.4 Comparison of apoptosis rates

圖5 細(xì)胞中蛋白表達(dá)Fig.5 Expression levels of various proteins in cells

3 討論

眼瞼基底細(xì)胞癌病因復(fù)雜，與放射線、紫外線、砷制劑、遺傳等因素有關(guān)，臨床治療以手術(shù)切除為主，部分患者術(shù)后存在局部復(fù)發(fā)現(xiàn)象，放射治療可減少術(shù)后復(fù)發(fā)率，但易引起放射性角膜炎、白內(nèi)障等其他眼部并發(fā)癥［8］。CAFs是腫瘤微環(huán)境中最豐富的細(xì)胞，其標(biāo)志著細(xì)胞間質(zhì)被激活，F(xiàn)AP在多數(shù)上皮細(xì)胞癌CAFs和部分腫瘤細(xì)胞間質(zhì)中高表達(dá)，與血管生成、腫瘤增殖及細(xì)胞外基質(zhì)侵襲、重塑之間關(guān)系密切，研究FAP對(duì)CAFs增殖、凋亡等生物學(xué)特征的影響，對(duì)治療眼瞼基底細(xì)胞癌有重要臨床意義［9］。

本研究成功培養(yǎng)出眼瞼CAFs和NFs，顯微鏡下CAFs與NFs形態(tài)上差異顯CAFs喪失接觸抑制和密度抑制。CAFs與NFs同屬于成纖維細(xì)胞，均不表達(dá)上皮細(xì)胞標(biāo)志物CK，表達(dá)成纖維細(xì)胞標(biāo)志物VIM，同時(shí)CAFs還可特異性表達(dá)α-SMA和FAP，既往研究均已證實(shí)α-SMA和FAP在NFs中不表達(dá)或極低表達(dá)，免疫組化方法無(wú)法檢出［10］。本研究經(jīng)免疫組化染色，結(jié)果顯示，CAFs除表達(dá)CK陰性外，VIM、α-SMA和FAP均表達(dá)陽(yáng)性，而NFs只有VIM表達(dá)陽(yáng)性。研究顯示，來(lái)源口腔癌、前列腺癌的CAFs表達(dá)α-SMA和FAP陽(yáng)性［11］，本研究與其他腫瘤來(lái)源CAFs特性一致，成功分離純化CAFs，并與NFs作出區(qū)別，進(jìn)一步研究其增殖、凋亡情況。

腫瘤微環(huán)境中基質(zhì)細(xì)胞功能變化會(huì)影響腫瘤細(xì)胞惡性生物潛能，癌組織中成纖維細(xì)胞CAFs能提高腫瘤細(xì)胞免疫力和抵抗力。FAP是CAFs活化的特異性標(biāo)志物，在正常成纖維組織中不表達(dá)，在卵巢癌、乳腺癌等上皮惡性腫瘤的基質(zhì)成纖維細(xì)胞中高表達(dá)，可以促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖，改變腫瘤微環(huán)境，激活鄰近上皮細(xì)胞內(nèi)增長(zhǎng)信號(hào)，增加腫瘤細(xì)胞惡性表型，參與腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程［12-13］。CAFs是腫瘤微環(huán)境中主要基質(zhì)細(xì)胞，參與腫瘤細(xì)胞外基質(zhì)合成、降解、分布，并與腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲等生物學(xué)行為密切相關(guān)。FAP由CAFs分泌，同時(shí)又可以反過(guò)來(lái)促進(jìn)CAFs增殖，抑制其凋亡，增加腫瘤微環(huán)境中FAP濃度，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞惡性潛能［14］。表達(dá)FAP是CAFs主要特征之一，F(xiàn)AP陽(yáng)性的間質(zhì)細(xì)胞是腫瘤基質(zhì)主要成分，F(xiàn)AP促進(jìn)CAFs增殖，引起FAP分泌增加，且FAP基因組穩(wěn)定，不易耐藥，表面抗原表達(dá)穩(wěn)定，可以作為腫瘤免疫診治靶分子。本研究過(guò)表達(dá)組CAFs A值升高，凋亡率下降，通過(guò)敲降FAP基因后，A值降低，凋亡率升高，提示過(guò)表達(dá)FAP促進(jìn)CAFs增殖，抑制細(xì)胞凋亡。

PTEN/PI3K/Akt通路是細(xì)胞內(nèi)重要信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路之一，通路表達(dá)異常與糖尿病等多種疾病有關(guān)，同時(shí)與腫瘤發(fā)展有密切關(guān)系，在細(xì)胞增殖中發(fā)揮重要作用［15］。PTEN是一種抑癌基因，在細(xì)胞增殖、凋亡等過(guò)程中發(fā)揮調(diào)控作用。PI3K參與多種細(xì)胞調(diào)控，Akt是PI3K下游靶蛋白，通過(guò)調(diào)節(jié)下游分子目標(biāo)，抑制細(xì)胞凋亡，促進(jìn)惡性腫瘤發(fā)展。PTEN是PI3K/Akt通路重要的負(fù)性調(diào)節(jié)劑，通過(guò)去磷酸化PI3K底物，抑制Akt及其下游分子活化，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。研究表明，PTEN/PI3K/Akt信號(hào)通路通過(guò)阻滯細(xì)胞周期，參與誘導(dǎo)小鼠骨髓細(xì)胞的凋亡［16］。上調(diào)PTEN表達(dá)，可負(fù)性抑制PI3K/Akt通路，抑制膽管癌細(xì)胞增殖［17］。本研究過(guò)表達(dá)組PTEN表達(dá)顯著降低，激活PI3K/Akt通路，促進(jìn)CAFs增殖，抑制其凋亡，敲降FAP基因后，PTEN表達(dá)升高，阻滯PI3K/Akt通路，減少CAFs增殖，在敲降FAP基因基礎(chǔ)上加入PTEN抑制劑，可促進(jìn)CAFs增殖，提示過(guò)表達(dá)FAP通過(guò)調(diào)節(jié)PTEN/PI3K/Akt信號(hào)通路促進(jìn)CAFs增殖，抑制其凋亡。PTEN在多種腫瘤或癌相關(guān)成纖維組織中低表達(dá)，通過(guò)激活PI3K/Akt通路促進(jìn)細(xì)胞增殖［18］。PTEN促進(jìn)CAFs增殖并抑制其凋亡，引起腫瘤微環(huán)境失衡，從而影響腫瘤細(xì)胞或癌細(xì)胞惡性生物學(xué)行為。

綜上所述，過(guò)表達(dá)FAP可能通過(guò)調(diào)控PTEN/PI3K/Akt信號(hào)通路促進(jìn)眼瞼CAFs增殖，抑制其凋亡，顯示出其診斷治療眼瞼基底細(xì)胞癌的潛能，F(xiàn)AP對(duì)眼瞼CAFs侵襲及遷移作用還需進(jìn)一步研究，可能為臨床提供新靶點(diǎn)。