王佳 林雪容 高恒波 張志斌

1河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院急診科（河北張家口075000）；2河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院急診科（石家莊050000）

急性腎損傷（acute kidney injury，AKI）是膿毒癥常見的合并癥，會加重膿毒癥病情、增加病死率［1-2］。相關(guān)研究認(rèn)為，急性腎小管上皮細(xì)胞損傷是膿毒癥致AKI主要的病理生理改變［3-5］，但膿毒癥發(fā)病過程中腎小管上皮細(xì)胞損傷的調(diào)控機(jī)制尚不明確。Janus激酶2（janus kinase 2，JAK2）/信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）通路是參與炎癥及凋亡調(diào)控的重要信號通路［6-7］，LEVENTHAL等［8］的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)，注射脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）建立膿毒癥小鼠模型后，腎臟中STAT3顯著激活，表明膿毒癥發(fā)病過程中腎小管上皮細(xì)胞的凋亡可能與JAK2/STAT3通路的激活有關(guān)。

微小RNA（microRNA，miR）是近年來在重癥醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域受到越來越多重視的一類非編碼小分子RNA，具有廣泛的生物學(xué)作用。miR調(diào)控STAT3的研究表明，miR-29a靶向抑制STAT3的表達(dá)［9-10］；膿毒癥相關(guān)的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)［11-12］表明，膿毒癥大鼠miR-29a表達(dá)減少且與腎損傷、心肌損害有關(guān)。以上結(jié)果表明，miR-29a表達(dá)減少可能與膿毒癥引起的臟器損傷有關(guān)，且靶向STAT3可能是miR-29a參與膿毒癥病程中臟器損傷的機(jī)制。本研究將以大鼠腎小管上皮細(xì)胞株NRK-52E為實(shí)驗(yàn)對象，具體分析miR-29a靶向STAT3調(diào)控炎癥反應(yīng)在LPS誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞損傷中的作用，旨在為闡明膿毒癥發(fā)病過程中腎小管上皮細(xì)胞損傷的調(diào)控機(jī)制、發(fā)現(xiàn)膿毒癥導(dǎo)致AKI新的治療手段提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞大鼠腎小管上皮細(xì)胞株NRK-52E購自寧波明舟生物科技有限公司。

1.1.2 試劑miR-29a、miR-陰性對照（NC）由上海吉瑪公司設(shè)計(jì)并合成；STAT3抑制劑AG490購自MCE公司；空白的pcDNA3.1質(zhì)粒及表達(dá)STAT3的pcDNA3.1質(zhì)粒由上海生工公司設(shè)計(jì)并提供；STAT3基因mRNA 3′UTR的雙熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒由廣州云舟生物公司設(shè)計(jì)并合成；轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine2000為 美 國Thermo公 司；miRNA提取試劑盒、miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒、miRNA熒光定量PCR檢測試劑盒購自北京天根公司；MTS細(xì)胞活力檢測試劑盒、雙熒光素酶報(bào)告基因檢測系統(tǒng)購自Promega公司；STAT3、p-STAT3、Bcl-2的抗體為Abcam公司。TNF-α、IL-1β的酶聯(lián)免疫吸附法（Elisa）試劑盒為上海西唐公司。

1.1.3 儀器離心機(jī)、細(xì)胞培養(yǎng)箱為Thermo公司，熒光定量PCR儀為Bio-rad公司，多功能酶標(biāo)儀為Bio-tek公司，電泳儀及凝膠成像系統(tǒng)為上海天能公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)NRK-52E細(xì)胞復(fù)蘇后在含有10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基中貼壁培養(yǎng)，每2天更換1次完全培養(yǎng)基，待貼壁生長的細(xì)胞密度達(dá)到90%后用0.25%胰蛋白酶進(jìn)行消化，按照1∶3的比例傳代并繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.2 細(xì)胞分組處理細(xì)胞分組處理的實(shí)驗(yàn)分為3部分。第一部分實(shí)驗(yàn)分4組：（1）對照組；（2）LPS組：用含有1 μg/L LPS的培養(yǎng)基處理；（3）LPS+miR-NC組：轉(zhuǎn)染miR-NC，同時(shí)加入LPS使終濃度達(dá)到1 μg/L；（4）LPS+miR-29a組：轉(zhuǎn)染miR-29a，同時(shí)加入LPS使終濃度達(dá)到1 μg/L。第二部分實(shí)驗(yàn)分4組：（1）對照組；（2）LPS組：同前；（3）LPS+AG490組：用含有1 μg/L LPS及20 μmol/L AG490的培養(yǎng)基處理；（4）AG490組：用含有20 μmol/L AG490的培養(yǎng)基處理。第三部分實(shí)驗(yàn)分5組：（1）對照組；（2）pcDNA3.1組：轉(zhuǎn)染pcDNA3.1質(zhì)粒；（3）pcDNA3.1+LPS組：轉(zhuǎn)染pcDNA3.1質(zhì)粒，同時(shí)加入LPS使終濃度達(dá)到1 μg/L；（4）pcDNA3.1+miR-29a+LPS組：轉(zhuǎn)染pcDNA3.1質(zhì)粒和miR-29a，同時(shí)加入LPS使終濃度達(dá)到1 μg/L；（5）pcDNA3.1-STAT3+miR-29a+LPS組：轉(zhuǎn) 染pcDNA3.1-STAT3質(zhì)粒 和miR-29a，同時(shí)加入LPS使終濃度達(dá)到1 μg/L。

第一和第三部分的轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)均使用Lipofectamine2000，按照轉(zhuǎn)染試劑說明書進(jìn)行操作。

1.2.3 miR-29a 表達(dá)水平檢測NRK-52E細(xì)胞接種在12孔板內(nèi)，按照1.2.2的方法分組干預(yù)24 h后，采用miRNA提取試劑盒分離miRNA，按照miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒操作、將miRNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，按照miRNA熒光定量PCR檢測試劑盒配置反應(yīng)體系、對miR-29a及U6進(jìn)行PCR反應(yīng)，PCR程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性3 min、95 ℃15 s及60 ℃34 s重復(fù)40個(gè)循環(huán)，軟件中生成PCR循環(huán)曲線及循環(huán)閾值（Ct），根據(jù)公式2-ΔΔCt計(jì)算miR-29a的表達(dá)量。

1.2.4 細(xì)胞活力的MTS 法檢測NRK-52E細(xì)胞接種在96孔板內(nèi)，按照1.2.2的方法分組干預(yù)24 h后，采用MTS試劑盒檢測細(xì)胞活力，將試劑盒內(nèi)的檢測液加入培養(yǎng)孔、20 μL/孔，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后在多功能酶標(biāo)儀上檢測490 nm波長的吸光度、為A490。

1.2.5 蛋白表達(dá)的Western blot 檢測NRK-52E細(xì)胞接種在12孔板內(nèi)，按照1.2.2的方法分組干預(yù)24 h后，用RIPA裂解液裂解細(xì)胞、提取蛋白，BCA試劑盒測定蛋白含量，根據(jù)測定結(jié)果取含有30 μg蛋白的樣本進(jìn)行Western blot檢測，電泳、電轉(zhuǎn)膜、封閉、孵育一抗、孵育二抗后在凝膠成像系統(tǒng)中曝光得到蛋白條帶，根據(jù)條帶的灰度值、以β-actin為內(nèi)參計(jì)算STAT3、p-STAT3、Bcl-2的表達(dá)水平。

1.2.6 細(xì)胞因子的Elisa 檢測NRK-52E細(xì)胞接種在12孔板內(nèi)，按照1.2.2的方法分組干預(yù)24 h后，取培養(yǎng)基并采用Elisa試劑盒檢測TNF-α、IL-1β的含量，提取細(xì)胞中的蛋白并采用BCA試劑盒檢測蛋白含量，計(jì)算每毫克細(xì)胞蛋白對應(yīng)的培養(yǎng)基TNF-α、IL-1β含量。

1.2.7 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)NRK-52E細(xì)胞接種在24孔板內(nèi)，將雙熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒及miR-181mimic或NC mimic共同轉(zhuǎn)染進(jìn)入細(xì)胞，24 h后保留細(xì)胞，采用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測系統(tǒng)分別檢測螢火蟲熒光活力及海腎熒光活力，計(jì)算螢火蟲熒光活力/海腎熒光活力的比值，以該比值作為雙熒光素酶報(bào)告基因的熒光素酶活力。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 22.0軟件錄入數(shù)據(jù)，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組間的比較采用方差分析，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的資料進(jìn)一步進(jìn)行LSD-t兩兩比較，P ＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-29a 對NRK-52E 細(xì)胞活力的影響與對照組比較，LPS組NRK-52E細(xì)胞的miR-29a表達(dá)水平及A490水平均明顯降低（P ＜0.05）；與LPS組比較，LPS+miR-NC組NRK-52E細(xì)胞的miR-29a表達(dá)水平及A490水平無明顯變化（P ＞0.05），LPS+miR-29a組NRK-52E細(xì)胞的miR-29a表達(dá)水平及A490水平均明顯增加（P ＜0.05）。見表1。

2.2 miR-29a 對NRK-52E 細(xì)胞STAT3 途徑的影響與對照組比較，LPS組STAT3、p-STAT3的表達(dá)水平及TNF-α、IL-1β的含量均明顯增加，Bcl-2的表達(dá)水平明顯降低（P ＜0.05）；與LPS組比較，LPS+miR-NC組STAT3、p-STAT3、Bcl-2的表達(dá)水平及TNF-α、IL-1β的含量無明顯變化（P ＞0.05），LPS+miR-29a組STAT3、p-STAT3的表達(dá)水平及TNF-α、IL-1β的含量均明顯降低，Bcl-2的表達(dá)水平明顯增加（P ＜0.05）。見圖1、表2。

表1 miR-29a 對NRK-52E 細(xì) 胞miR-29a 及A490 水 平 的影響Tab.1 Effect of miR-29a on miR-29a and A490 levels of NRK-52E cells ±s

表1 miR-29a 對NRK-52E 細(xì) 胞miR-29a 及A490 水 平 的影響Tab.1 Effect of miR-29a on miR-29a and A490 levels of NRK-52E cells ±s

注：與對照組比較，*P ＜0.05；與LPS 組比較，#P ＜0.05

組別對照組LPS 組LPS+miR-NC 組LPS+miR-29a 組例數(shù)5 5 5 5 miR-29a 0.83±0.16 0.39±0.09*0.41±0.08 1.21±0.29#A490 1.02±0.24 0.45±0.09*0.50±0.01 0.95±0.20#

圖1 轉(zhuǎn)染miR-29a 后NRK-52E 細(xì)胞中STAT3、p-STAT3、Bcl-2 的蛋白條帶Fig.1 Protein bands of STAT3，p-STAT3 and Bcl-2 in NRK-52E cells after miR-29a transfection

表2 miR-29a 對NRK-52E 細(xì)胞中STAT3、p-STAT3、Bcl-2 表達(dá)及培養(yǎng)基中TNF-α、IL-1β含量的影響Tab.2 Effect of miR-29a on STAT3，p-STAT3，bcl-2 expression in NRK-52E cells and TNF-α，IL-1 β content in culture medium ±s

表2 miR-29a 對NRK-52E 細(xì)胞中STAT3、p-STAT3、Bcl-2 表達(dá)及培養(yǎng)基中TNF-α、IL-1β含量的影響Tab.2 Effect of miR-29a on STAT3，p-STAT3，bcl-2 expression in NRK-52E cells and TNF-α，IL-1 β content in culture medium ±s

注：與對照組比較，*P ＜0.05；與LPS 組比較，#P ＜0.05

組別對照組LPS 組LPS+miR-NC 組LPS+miR-29a 組例數(shù)5 5 5 5 STAT3（/β-actin）0.40±0.08 0.84±0.20*0.81±0.23 0.32±0.09#p-STAT3（/β-actin）0.28±0.05 0.60±0.13*0.67±0.14 0.41±0.09#Bcl-2（/β-actin）0.88±0.21 0.40±0.08*0.42±0.09 0.85±0.22#TNF-α（pg/mgPro）1.83±0.42 6.58±1.24*6.61±1.33 3.04±0.67#IL-1β（pg/mgPro）1.09±0.32 4.42±0.75*4.77±0.91 2.14±0.46#

2.3 miR-29a靶向STAT3基因mRNA 3′UTR的驗(yàn)證經(jīng)Targetscan的生物信息學(xué)分析，miR-29a靶向STAT3基因mRNA 3′UTR第1011-1017堿 基，見圖2A；經(jīng)雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)，miR-29a組野生型STAT3基因雙熒光素酶報(bào)告基因的熒光活力低于miR-NC組（P ＜0.05），突變型STAT3基因雙熒光素酶報(bào)告基因的熒光活力與對照組比較無差異（P ＞0.05），見圖2B。

2.4 STAT3抑制劑對NRK-52E細(xì)胞活力及STAT3途徑的影響與對照組比較，LPS組各項(xiàng)指標(biāo)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05），AG490組各項(xiàng)指標(biāo)均無明顯變化（P ＞0.05）；與LPS組比較，LPS+AG490組A490水平及Bcl-2的表達(dá)水平均明顯增加，STAT3、p-STAT3的表達(dá)水平及TNF-α、IL-1β的含量均明顯減少（P ＜0.05），STAT3的表達(dá)水平無明顯變化（P ＞0.05）。見圖3、表3。

圖2 miR-29a 靶向STAT3 基因mRNA 的3′UTRFig.2 miR-29a target 3′UTR of STAT3 gene mRNA

圖3 加用AG490 后NRK-52E 細(xì)胞中STAT3、p-STAT3、Bcl-2 的蛋白條帶Fig.3 Protein bands of STAT3，p-STAT3 and Bcl-2 in NRK-52E cells after AG4 90 intervention

2.5 過表達(dá)STAT3對miR-29a減輕LPS誘導(dǎo)NRK-52E 細(xì)胞損傷的影響與pcDNA3.1組比較，pcDNA3.1+LPS組各項(xiàng)指標(biāo)均有顯著變化（P ＜0.05）；與pcDNA3.1+LPS組比較，pcDNA3.1+LPS+miR-29a組各項(xiàng)指標(biāo)均明顯改善（P ＜0.05）；與pcDNA3.1+LPS+miR-29a組比較，pcDNA3.1-STAT3+LPS+miR-29a組A490水平及Bcl-2的表達(dá)水平均明顯降低，STAT3、p-STAT3的表達(dá)水平及TNF-α、IL-1β的含量均明顯增加（P ＜0.05）。見圖4、表4。

表3 STAT3 抑制劑對NRK-52E 細(xì)胞A490 水平、STAT3、p-STAT3 及Bcl-2 表達(dá)、TNF-α及IL-1β含量的影響Tab.3 Effects of STAT3 inhibitor on A490 level，STAT3，p-STAT3 and bcl-2 expression，TNF-α and IL-1β content of NRK-52E cells ±s

表3 STAT3 抑制劑對NRK-52E 細(xì)胞A490 水平、STAT3、p-STAT3 及Bcl-2 表達(dá)、TNF-α及IL-1β含量的影響Tab.3 Effects of STAT3 inhibitor on A490 level，STAT3，p-STAT3 and bcl-2 expression，TNF-α and IL-1β content of NRK-52E cells ±s

注：與對照組比較，*P ＜0.05；與LPS 組比較，#P ＜0.05

組別對照組LPS 組LPS+AG490 組AG490 組例數(shù)5 5 5 5 A490 1.07±0.25 0.42±0.08*0.91±0.27#1.10±0.24 STAT3 0.37±0.09 0.89±0.21*0.84±0.24#0.30±0.08 p-STAT3 0.25±0.06 0.69±0.14*0.34±0.08#0.31±0.08 Bcl-2 0.95±0.23 0.42±0.07*0.99±0.25#0.87±0.20 TNF-α 1.69±0.31 6.22±1.41*2.62±0.42#1.84±0.27 IL-1β 1.02±0.34 4.89±0.81*2.18±0.44#1.28±0.36

3 討論

AKI是膿毒癥常見的合并癥，也是影響膿毒癥預(yù)后、增加疾病救治難度及病死率的重要原因［13-16］。近些年YE等［3］、ZHENG等［4］、張澤英等［5］、等多項(xiàng)研究表明，LPS誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞損傷是膿毒癥引起AKI的重要因素，但細(xì)胞損傷的具體調(diào)控機(jī)制尚不十分清除。MiR-29a與膿毒癥臟器損傷有關(guān)，多項(xiàng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，膿毒癥模型大鼠腎臟及心肌中miR-29a的表達(dá)均明顯減少［11-12］；ZHANG等［11］的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，LPS刺激NRK-52E細(xì)胞能夠抑制miR-29a的表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)采用與SONG等［12］相同的方法用LPS刺激NRK-52E細(xì)胞并發(fā)現(xiàn)miR-29a表達(dá)減少。同時(shí)，本實(shí)驗(yàn)還觀察到：LPS刺激NRK-52E細(xì)胞后細(xì)胞活力降低、表明細(xì)胞發(fā)生損傷。在此基礎(chǔ)上，本實(shí)驗(yàn)將深入探究miR-29a在LPS引起NRK-52E細(xì)胞損傷中的具體作用及機(jī)制。

圖4 過表達(dá)STAT3 后NRK-52E 細(xì)胞中STAT3、p-STAT3、Bcl-2 的蛋白條帶Fig.4 Protein bands of STAT3，p-STAT3 and Bcl-2 in NRK-52E cells after overexpression of STAT3

在膿毒癥及類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的研究中，miR-29a分別靶向抑制單核細(xì)胞及滑膜細(xì)胞中的STAT3，進(jìn)而抑制炎癥反應(yīng)的激活［9-10］。STAT3是促進(jìn)炎癥反應(yīng)放大及細(xì)胞凋亡激活的重要信號分子［17-19］，在LPS誘導(dǎo)腎小球內(nèi)皮細(xì)胞損傷、膿毒癥急性肺損傷大鼠及缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞損傷的模型中，p-STAT3的表達(dá)均明顯增加，同時(shí)下游促炎細(xì)胞因子TNF-α及IL-1β釋放增多、抗凋亡基因Bcl-2表達(dá)下調(diào)［20-22］。本實(shí)驗(yàn)觀察到：LPS刺激NRK-52E細(xì)胞后，STAT3、p-STAT3的表達(dá)及TNF-α、IL-1β的含量均增加，而Bcl-2的表達(dá)減少；加用STAT3抑制劑AG490后，LPS誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞的損傷明顯減輕。以上結(jié)果表明在LPS誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞損傷的過程中，STAT3表達(dá)增加及過度激活起重要作用。

表4 過表達(dá)STAT3 對miR-29a 調(diào)控NRK-52E 細(xì)胞A490 水平、STAT3、p-STAT3 及Bcl-2 表達(dá)、TNF-α及IL-1β含量的影響Tab.4 Effects of overexpression of STAT3 on miR-29a regulating A490 level，STAT3，p-STAT3 and bcl-2 expression，TNF-α and IL-1 β content in NRK-52E cells ±s

表4 過表達(dá)STAT3 對miR-29a 調(diào)控NRK-52E 細(xì)胞A490 水平、STAT3、p-STAT3 及Bcl-2 表達(dá)、TNF-α及IL-1β含量的影響Tab.4 Effects of overexpression of STAT3 on miR-29a regulating A490 level，STAT3，p-STAT3 and bcl-2 expression，TNF-α and IL-1 β content in NRK-52E cells ±s

注：與pcDNA3.1 組比較，*P ＜0.05；與pcDNA3.1+LPS 組比較，#P ＜0.05；與pcDNA3.1+LPS+miR-29a 組比較，&P ＜0.05

組別對照組pcDNA3.1 組pcDNA3.1+LPS 組pcDNA3.1+LPS+miR-29a 組pcDNA3.1-STAT3+LPS+miR-29a 組例數(shù)5 5 5 5 5 A490 1.04±0.25 1.07±0.29 0.45±0.09*0.94±0.21#0.42±0.08&STAT3 0.39±0.08 0.35±0.09 0.82±0.20*0.29±0.07#0.79±0.13&p-STAT3 0.26±0.06 0.24±0.07 0.74±0.12*0.24±0.05#0.70±0.15&Bcl-2 0.88±0.14 0.84±0.17 0.40±0.09*0.95±0.16#0.55±0.07&TNF-α 1.59±0.25 1.66±0.28 6.11±1.32*3.08±0.62#6.52±1.44&IL-1β 1.04±0.27 1.08±0.31 4.58±0.95*2.28±0.52#4.29±0.88&

LPS能夠抑制miR-29a表達(dá)、增 加STAT3表達(dá)，由此推測LPS可能通過miR-29a增加STAT3表達(dá)并引起腎小管上皮細(xì)胞損傷。為了驗(yàn)證上述推測，本實(shí)驗(yàn)在過表達(dá)miR-29a后觀察到LPS誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞的損傷明顯減輕、STAT3表達(dá)明顯減少，且經(jīng)雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)miR-29a靶向STAT3基因mRNA的3′UTR，表明miR-29a在LPS誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞損傷中起保護(hù)作用且能靶向抑制STAT3。在此基礎(chǔ)上，通過轉(zhuǎn)染STAT3表達(dá)質(zhì)粒進(jìn)行驗(yàn)證，在LPS刺激并轉(zhuǎn)染miR-29a的同時(shí)過表達(dá)STAT3后觀察到miR-29a增加細(xì)胞活力及bcl-2表達(dá)、減少TNF-α及IL-1β含量的作用均明顯減弱，由此證實(shí)了miR-29a減輕LPS誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞損傷的作用與抑制STAT3的表達(dá)及激活有關(guān)。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明，在LPS誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞損傷的過程中，miR-29a表達(dá)減少、STAT3的表達(dá)增加及激活過度，下游抗凋亡基因Bcl-2表達(dá)減少、促炎因子TNF-α及IL-1β釋放增加；miR-29a能靶向抑制STAT3并在LPS誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞損傷中發(fā)揮保護(hù)作用。未來，miR-29a/STAT3軸有望成為研究膿毒癥引起AKI發(fā)病機(jī)制的靶點(diǎn)，也能為研究膿毒癥合并AKI的治療提供新思路。