朱朝陽 賴冬萍 張濤 丁明健 卓少元 黃曉燕

1廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬瑞康醫(yī)院（南寧530011）；2廣西中醫(yī)藥大學(xué)（南寧530000）；3廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院（南寧530000）

微小RNA（miRNA，microRNA）是短的（20 ～24 nt）非編碼核糖核酸，通過影響微小核糖核酸的穩(wěn)定性和翻譯，參與多細胞生物中基因表達的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)。miRNAs表達異常與細胞自噬、蛋白質(zhì)折疊等密切相關(guān)，可致靶基因活動異常，作為致癌或抑癌基因，在結(jié)腸癌中占據(jù)重要地位［1-2］。筆者前期通過收集6例病理證實結(jié)腸癌（炎癥相關(guān)）患者的術(shù)后腸道標(biāo)本，及6例健康志愿者腸道活檢取材，利用基因芯片識別差異表達的miRNAs，篩選差異表達基因及相關(guān)通路。應(yīng)用生物信息學(xué)，采用基因本體GO分析和途徑富集分析發(fā)現(xiàn)大腸癌存在74個表達上調(diào)miRNA、26個表達下調(diào)miRNA，其中miR-222上調(diào)通過靶向調(diào)節(jié)TGF-β、MAPK信號通路，參與炎癥相關(guān)結(jié)腸癌的發(fā)生、發(fā)展［3-4］。為證實miR-222在結(jié)腸癌中的致病地位及其生物學(xué)效應(yīng)，本研究擬篩選、構(gòu)建慢病毒miR-222穩(wěn)定沉默的結(jié)腸癌細胞株，觀察穩(wěn)定沉默miR-222基因后，HCT-116結(jié)腸癌細胞增殖、凋亡、周期進程以及細胞遷移的變化，探討miR-222與結(jié)腸癌發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗材料人結(jié)腸癌細胞CaCO2、HTC-15、HT-29、HCT-116、sw480、sw620。以上細胞由賽百慷（上海）生物技術(shù)股份有限公司提供，STR鑒定。293T細胞（人胚腎細胞）購自中國科學(xué)院細胞庫。

1.1.2 主要試劑胎牛血清、DMEM-高糖培養(yǎng)基、RPMI-1640培養(yǎng)基、青鏈霉素、PBS磷酸鉀緩沖液均購自Hyclone公司，胰酶Trypsin-EDTA Solution購自GIBCO公司，SYBR Green qPCR SuperMix購自Invitrogen公司；慢病毒載體（GenePharma提供的重組Lentivirus顆粒），重組穿梭質(zhì)粒和包裝質(zhì)粒pGag/Pol、pRev、pVSV-G由廣州銘善上生物公司構(gòu)建制備，Puromycin Dihydrochloride（Thermo公司提供）。Hepes AMRESCO 7365-45-9，LipofectamineTM 2000轉(zhuǎn)染試劑，Polybrene Sigma H9268，T4 DNA Ligase酶（購于TaKaRa公司），氨芐青霉素，DNA凝膠回收試劑盒（DONGSHENG BIOTECH），cellTiter96AQ單溶液細胞增殖檢測試劑（Promega，Cat.No.G3582），Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒（keygen，貨號KGA106），凱基細胞周期檢測試劑盒（貨號KGA511）。

1.2 方法

1.2.1 RT-PCR 檢測不同結(jié)腸癌細胞miR-222 的mRNA表達分別收集已成功培養(yǎng)CaCO2、HTC-15、HT-29、HCT-116、sw480、sw620結(jié)腸癌細胞（1 ×106）。RT-PCR步驟如下：總RNA抽提去基因組總RNA純度和完整性檢測逆轉(zhuǎn)錄定量PCR。PCR反應(yīng)條件為：95 ℃5 min；95 ℃15 s，60 ℃32 s讀板，40 cycles；熔解曲線分析：溫度60 ～95 ℃。委托上海生工技術(shù)有限公司合成miR-222、內(nèi)參U6引物序列（表1）。

表1 miR-222、內(nèi)參U6 引物序列及擴增片段Tab.1 miR-222，U6 primer sequence and amplified fragment

1.2.2 TUD-hsa-miR-222-3p Inhibitor 慢病毒載體構(gòu)建應(yīng)用TuD RNA（Tough Decoy RNA）的設(shè)計方法構(gòu)建miRNA的抑制慢病毒載體。將穩(wěn)定沉默miR-222有效序列合成、退火形成miR-222 DNA雙鏈，將plvx-shRNAPuro載體XhoI與EcoRII雙酶切載體，在T4 DNA Ligase連接酶的作用下與雙鏈miR-222 DNA于16 ℃1 h進行連接反應(yīng)制備克隆連接液，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細胞，挑取若干個陽性單克隆質(zhì)粒菌落，由上海生工基因公司進行測序鑒定。

1.2.3 病毒包裝制備編碼慢病毒顆粒的重組病毒質(zhì)粒及其三種輔助包裝原件載體質(zhì)粒（pGag/Pol、pRev、pVSV-G），運用質(zhì)粒載體進行高純度無內(nèi)毒素抽提，用轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM 2000轉(zhuǎn)染293T細胞，轉(zhuǎn)染后更換為完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)、收集富含慢病毒顆粒的細胞上清液，濃縮為高滴度的慢病毒濃縮液，感染293T細胞后用有限稀釋法標(biāo)定病毒滴度。慢病毒包裝完成，將其存放于-80 ℃中備用。

1.2.4 穩(wěn)定細胞株篩選及轉(zhuǎn)染培養(yǎng)結(jié)腸癌細胞HCT-116，取對數(shù)生長期的細胞進行實驗。接種（3 ～5）× 103個結(jié)腸癌HCT-116細胞于96孔培養(yǎng)板中，調(diào)整細胞融合度為30%～50%，用常規(guī)培養(yǎng)基稀釋病毒作濃度梯度篩選，Polybrene（6 μg/mL）感染細胞后動態(tài)觀察細胞活性。篩選感染細胞最佳MOI后，以接種密度為2×104個細胞，體積100 μL，接種于96孔板中，用慢病毒感染結(jié)腸癌HCT-116細胞，Puromycin壓力篩選1周后，挑選陽性克隆細胞，進行細胞擴增、RT-PCR檢測miR-222相對表達量，在倒置熒光顯微鏡下觀察細胞GFP熒光表達情況，評價感染效率，以確定成功構(gòu)建穩(wěn)定沉默miR-222結(jié)腸癌HCT-116細胞系及陰性對照細胞（NC組）。收集同期未轉(zhuǎn)染的細胞設(shè)為空白對照組（HCT-116組）。

1.2.5 MTS 法檢測細胞存活率分別收集轉(zhuǎn)染后24、48 h各組細胞1×104，加入10%cellTiter96AQ單溶液細胞增殖檢測試劑，在孵育4 h后，酶標(biāo)儀讀板，MTS檢測讀取OD490數(shù)據(jù)。參照公式計算細胞存活率=（其他時間點OD值均值÷0 h OD值均值-1）×100%（同一樣品）。

1.2.6 Annexin V-FITC 檢測細胞凋亡分別收集各組細胞（1 × 106），胰酶消化細胞，將1.25 μLAnnexin V-FITC加入細胞懸液中，室溫（18 ～24 ℃）避光反應(yīng)15 min；去上清后，重懸細胞，加入10 μL Propidium Iodide，立即上機用流式細胞儀檢測分析細胞凋亡率。

1.2.7 流式細胞儀檢測細胞周期分別收集各組細胞（1 × 106），用乙醇進行細胞固定，加入溴化丙錠、100 μg/mL RNase A，0.2% Triton X-100，4 ℃避光孵育30 min，進行細胞染色。以標(biāo)準(zhǔn)程序用流式細胞儀檢測，計數(shù)（2 ～3）×104個細胞，用ModFit分析細胞周期結(jié)果。

1.2.8 Transwell 小室模型檢測細胞遷移分別收集各組細胞1 × 105，用100 μL無血清培養(yǎng)基重懸后，平鋪至Transwell細胞培養(yǎng)板的小室上室，在下室加入600 μL完全培養(yǎng)基，放置37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，孵育48 h后，取出小室，用棉簽輕輕拭掉上室的細胞，PBS漂洗，4%多聚甲醛固定，結(jié)晶紫染色，倒置顯微鏡選取5個視野，計數(shù)穿膜細胞，取均值，評價穩(wěn)定沉默miR-222結(jié)腸癌HCT-116細胞的遷移能力。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法用Graphpad 8.0軟件進行數(shù)據(jù)分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間比較采用t檢驗，P ＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-222 在結(jié)腸癌HCT-116 細胞中高表達RT-PCR顯示HCT-116的miR-222 mRNA定量表達最高，CaCO2表達最低，因此選擇HCT-116細胞為后續(xù)穩(wěn)定沉默miR-222的實驗細胞。

2.2 TUD-hsa-miR-222-3p Inhibitor 慢病毒高效轉(zhuǎn)染HCT-116 細胞建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞系測序分析證實TUD-hsa-miR-222-3p Inhibitor慢病毒載體構(gòu)建成功。篩選最佳MOI為40，確定最佳殺傷濃度是0.2 μg/mL的Puromycin篩選細胞后，應(yīng)用含有綠色熒光報告基因（GFP）標(biāo)記觀察穩(wěn)定細胞株，與NC組對照，熒光轉(zhuǎn)染效率達80%以上，慢病毒轉(zhuǎn)染成功并穩(wěn)定表達（圖1）。RT-PCR結(jié)果顯示miR-222基因的相對表達量降低了53.42%，miR-222在HCT-116細胞中穩(wěn)定沉默。

圖1 HCT-116-hsa-miR-222 Inhibitor 穩(wěn)定細胞株10×10 拍照（與NC 組對照）Fig.1 HCT-116-hsa-miR-222 Inhibitor stable cell line（10×10）

2.3 穩(wěn)定沉默miR-222 降低結(jié)腸癌HCT-116 細胞存活率MTS法檢測穩(wěn)定沉默miR-222后，HCT-116結(jié)腸癌細胞存活率變化。轉(zhuǎn)染24 h后，與NC組和正常組比較，miR-222穩(wěn)定沉默組細胞增殖率下降（P ＜0.05）?？梢姺€(wěn)定沉默miR-222組細胞較NC組和正常組生長緩慢，并且該作用隨著時間的增加而更為明顯。轉(zhuǎn)染48 h后，穩(wěn)定沉默組細胞增殖率明顯下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜0.01）。根據(jù)MTS結(jié)果，繪制增值率差異和細胞生長曲線（圖3）。采用Annexin V-FITC檢測細胞凋亡，結(jié)果穩(wěn)定沉默miR-222后，HCT-116結(jié)腸癌細胞早期凋亡率為17.7%；NC組為1.11%；正常組為6.92%（圖4）。綜合細胞活性下降和凋亡率升高，表明沉默miR-222后，抑制了HCH-116結(jié)腸癌細胞增殖力，誘導(dǎo)癌細胞凋亡，從而降低了結(jié)腸癌細胞的存活率。

2.4 穩(wěn)定沉默miR-222 減緩結(jié)腸癌HCT-116 細胞周期進程流式細胞儀檢測細胞周期變化，發(fā)現(xiàn)沉默miR-222后，miR-222穩(wěn)定沉默組細胞處于S期的細胞比例明顯降低，表明沉默miR-222阻滯癌細胞周期進程（圖4）。

2.5 穩(wěn)定沉默miR-222 抑制結(jié)腸癌HCT-116 細胞遷移能力應(yīng)用Transwell小室模型檢測各細胞組細胞的遷移能力，結(jié)果穩(wěn)定沉默miR-222組細胞遷移數(shù)減少，與NC組和HCT-116組比較，遷移能力下降（P ＜0.05，圖5）。

3 討論

圖2 穩(wěn)定沉默miR-222 結(jié)腸癌HCT-116 細胞活性比較Fig.2 Comparison of Proliferation Rates of Stable Silenced MiR-222 Colon Cancer HCT-116 Cells

圖3 穩(wěn)定沉默miR-222 結(jié)腸癌HCT-116 細胞凋亡率比較Fig.3 Comparison of the apoptosis rate of stable and silent miR-222 colon cancer HCT-116 cells

圖4 各細胞組HCT-116 結(jié)腸癌細胞周期分布差異比較Fig.4 Comparison of cycle distribution of HCT-116 colon cancer cells in each cell group

圖5 穩(wěn)定沉默miR-222 結(jié)腸癌HCT-116 細胞遷移檢測比較Fig.5 Stable and silent miR-222 colon cancer HCT-116 cell migration detection ratio

腫瘤是基因異常表達的結(jié)果，miRNAs通過與各種癌基因和抑癌基因mRNA的3′UTR區(qū)結(jié)合，影響靶基因的表達來實現(xiàn)對疾病的調(diào)控。microRNAs在癌間質(zhì)中的異常表達與腫瘤的進展相關(guān)［5］。KHOSHINANI等［6］通過RT-PCR檢測miR-222/PTEN的表達，表明miR-222通過靶向調(diào)節(jié)PTEN基因誘導(dǎo)大腸癌的放射抵抗。亦有研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)腸癌患者糞便中miR-222定量檢測與腫瘤的分期、治療預(yù)后等關(guān)聯(lián)密切［7］。miR-222在結(jié)直腸癌發(fā)生、發(fā)展過程中不同時期所發(fā)揮的作用不同，提示了miRNAs作用的復(fù)雜性［8-9］，基因靶向調(diào)控是多網(wǎng)絡(luò)、多靶點調(diào)節(jié)的結(jié)果［10］。LIU等［11］在人結(jié)直腸癌組織中發(fā)現(xiàn)miR-222的異常高表達，與RelA和STAT3 mRNAs水平的升高相關(guān)，miR-222抑制劑培養(yǎng)大腸癌細胞可降低其增殖率和集落形成，減少了結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸腫瘤的生長。miR-222可能通過上調(diào)MST3表達，增加帕西林磷酸化，減少黏附，降低CRC細胞遷移和侵襲［12］。越來越多的證據(jù)表明miRNA的異常表達與細胞耐藥性密切相關(guān)。細胞實驗證實了miR-222-3p通過下調(diào)FOXP2可以改變結(jié)腸癌LoVo細胞對DOX的敏感性［13］。而miR-222高表達參與CRC細胞多重耐藥形成［14］，推測ADAM-17抑制劑與化療藥物聯(lián)合應(yīng)用可能對結(jié)直腸癌具有治療潛力。

遷移和侵襲是惡性腫瘤普遍的生物學(xué)特性，也是影響腫瘤患者生存和預(yù)后的關(guān)鍵因素，成為治療失敗的主要原因［15］，近年研究［16-17］發(fā)現(xiàn)，癌細胞對抗癌藥物具有多重耐藥性亦是引起CRC高病死率的又一原因。所以，尋找癌癥的新型生物學(xué)標(biāo)志物及治療靶點，研發(fā)化療藥物增敏劑，成為防治結(jié)直腸癌的重要課題。本研究采用TuD RNA（Tough Decoy RNA）的設(shè)計方法構(gòu)建miRNA的抑制慢病毒載體TUD-hsa-miR-222-3p Inhibitor。TuD RNA是含有頸環(huán)結(jié)構(gòu)的雙鏈RNA，能夠抵抗胞內(nèi)核酸酶的降解，并且TuD RNA的兩條鏈都包含一個miRNA結(jié)合位點，能夠更高效地隔離濃度較低的目標(biāo)miRNA。因此TuD RNA能夠更長效的抑制miRNA。病毒靶向特定組織和細胞是科研的挑戰(zhàn)，慢病毒載體是當(dāng)前癌癥基因治療中最有前途的基因傳遞系統(tǒng)之一［18］。本研究采用的慢病毒載體是以國際通用的第三代載體系統(tǒng)為基礎(chǔ)，通過改建，構(gòu)成四質(zhì)粒體系。體外成功構(gòu)建TUD-hsa-miR-222-3p Inhibitor慢病毒載體并轉(zhuǎn)染HCT-116細胞得到了miR-222穩(wěn)定沉默的結(jié)腸癌細胞系，明確了miR-222對HCT-16細胞的生物學(xué)影響。MICHIHISA等［5］通過ISH分析發(fā)現(xiàn)miR-222在癌間質(zhì)中的高表達與結(jié)直腸癌的轉(zhuǎn)移活性和惡性潛能正相關(guān)。這說明了miR-222的水平與腫瘤細胞的增殖有極大的關(guān)系，與腫瘤的早期形成相關(guān)。我們的MTS檢測結(jié)果提示穩(wěn)定沉默miR-222后的HCT-116細胞生長緩慢，各時間點的細胞生長活力均顯著降低。同時穩(wěn)定沉默miR-222組細胞早期凋亡率明顯升高，細胞存活率下降，說明穩(wěn)定沉默miR-222具有抗結(jié)腸癌HCT-116細胞生長并誘導(dǎo)早期凋亡的作用，這證實miR-222低表達在結(jié)腸癌細胞早期形成中發(fā)揮抑制作用。CDKN1B（p27）阻止細胞周期蛋白E-CDK2或細胞周期蛋白D-CDK4復(fù)合物的激活而控制細胞周期進程［19-20］。本研究發(fā)現(xiàn)穩(wěn)定沉默miR-222組細胞，S期細胞所占比例明顯減少。S期是細胞DNA復(fù)制的主要階段，miR-222低表達通過上調(diào)G1/CDK阻斷劑CDKN1B（p27），使更多的細胞阻滯在G0/G1期，減少腫瘤細胞合成和DNA修復(fù)。由此筆者推測，穩(wěn)定沉默miR-222可能通過抑制癌基因表達，從而降低細胞生長活性，介導(dǎo)細胞周期阻滯并促進細胞凋亡，表現(xiàn)為抑癌基因的功能。GAO等［21］研究分析了miR-222介導(dǎo)的MIA3基因敲除及其結(jié)果證明下調(diào)MIA3可增強大腸癌細胞的遷移和侵襲。miR-141-3p過表達靶向TRAF5起腫瘤抑制作用［22］。與本研究結(jié)論類似。本研究通過Transwell小室模型檢測細胞的遷移能力，結(jié)果提示穩(wěn)定沉默miR-222后HCT-116細胞穿膜進入下室的細胞數(shù)明顯減少，表明miR-222穩(wěn)定沉默細胞株的遷移能力顯著低于NC組和正常組，進一步說明miR-222在結(jié)腸癌晚期轉(zhuǎn)移中發(fā)揮負(fù)向調(diào)控作用。

抑癌基因表達下調(diào)或失活被認(rèn)為是腫瘤發(fā)生的早期事件。TGF-β激活后可誘導(dǎo)不同細胞類型的上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）和細胞遷移［23-24］。研究表明TGF-β通過蛋白質(zhì)代謝參與炎癥性腸病癌變［25］。下調(diào)miR-222-3p表達量，推測miR-222-3p可能通過靶基因TGF-β/MAPK通路負(fù)性調(diào)控結(jié)腸癌HCT-116細胞的惡性生物學(xué)行為，其下游信號傳導(dǎo)途徑中的作用尚未完全闡明。

綜上，本研究高通量篩選癌基因，采用慢病毒感染技術(shù)，將TUD-hsa-miR-222-3p Inhibito慢病毒載體成功轉(zhuǎn)染結(jié)腸癌HCT-116細胞，產(chǎn)生特異性的miR-222沉默效應(yīng)，抑制了結(jié)腸癌HCT-116細胞的活性、周期進程和遷移能力，誘導(dǎo)癌細胞凋亡，下一步擬在體構(gòu)建裸鼠結(jié)腸癌模型，探索miRNA-222下游靶基因表達的調(diào)控。