顧術(shù)東 繆捷飛 沈洪 張曙 茅國新

南通大學(xué)附屬醫(yī)院1腫瘤科，2病理科（江蘇南通226001）

長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）是一類無蛋白質(zhì)編碼功能的RNA，其長度一般超過200個(gè)核苷酸，具有調(diào)控基因表達(dá)功能，在細(xì)胞的增殖、侵襲、遷移、凋亡等多個(gè)生物過程中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用［1-2］。研究［3-6］發(fā)現(xiàn)lncRNA在多種惡性腫瘤中表達(dá)異常，并可以通過調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為促進(jìn)腫瘤的發(fā)生和進(jìn)展。淋巴細(xì)胞白血病缺失基因1（deleted in lymphocytic leukemia 1，DLEU1）定位于染色體13q14.3上，研究發(fā)現(xiàn)其在多種惡性腫瘤中表達(dá)升高并發(fā)揮重要作用，但目前其在食管鱗癌（esophageal squamous cell carcinoma，ESCC）中表達(dá)的臨床意義及對細(xì)胞生物學(xué)行為的影響尚不清楚［7-8］。本研究通過檢測DLEU1在ESCC中的表達(dá)，對ESCC患者DLEU1的表達(dá)與臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系進(jìn)行分析，探討ESCC細(xì)胞中DLEU1表達(dá)對細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響。

1 材料與方法

1.1 一般材料收集南通大學(xué)附屬醫(yī)院2016年1月至2018年6月間收治的食管癌術(shù)后病例50例，均經(jīng)組織病理學(xué)診斷為鱗癌?；颊吣挲g31 ～77歲，均為初治，術(shù)前未接受放化療等新輔助治療，隨訪截至?xí)r間為2019年12月31日。

1.2 試劑材料Trizol試劑（美國Invitrogen公司），RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒（美國Thermo公司），含綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GTP）基因的DLEU1特異性干擾質(zhì)粒（上海吉?jiǎng)P基因），LipofectamineTM 2000（美國Invitrogen公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染ESCC細(xì)胞株（ECA109、EC9706、TE13）購自上海生命科學(xué)研究院，放置于37 ℃含5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。小干擾RNA（small interfering RNA，siRNA）干擾質(zhì)粒由上海吉?jiǎng)P基因有限公司設(shè)計(jì)合成，DLEU1 siRNA1序列：5′-CAACGGAAUGUAUCAAUGA-3′，DLEU1 siRNA2序 列：5′-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3′，DLEU1 siRNA3序列：5′-GCAGAAAGGAAGTTTAT-3′。根據(jù)說明書，使用LipofectamineTM 2000將DLEU1 siRNA轉(zhuǎn)染至ESCC細(xì)胞，48 h后收集轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測轉(zhuǎn)染效率。

1.3.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-qPCR）參照試劑說明書進(jìn)行總RNA的提取，超微量核酸蛋白分析儀測定RNA濃度，瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整度，采用RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，在PCR儀上進(jìn)行檢測。PCR特異性引物序列如下：DLEU1正向引物序列：5′-CACGTGCATTTAAAACCGCC-3′，反向引物序列：5′-AAGACTTTGGGGCAGATTTCTT-3′，GAPDH正向引物序列：5′-CCTGGATACCGCAGCTAGGA-3′，反向引物序列：5′-GCGGCGCATACGAATGCCCC-3′。采用熒光定量PCR儀進(jìn)行DLEU1表達(dá)的相對定量分析。以GAPDH作為內(nèi)參，每個(gè)標(biāo)本檢測3次取平均值，采用2-ΔΔCt法計(jì)算DLEU1的相對表達(dá)量，以DLEU1的中位表達(dá)值為截點(diǎn)，高于中位表達(dá)值定義為高表達(dá)。

1.3.3 劃痕實(shí)驗(yàn)取轉(zhuǎn)染后細(xì)胞，在6孔板中種入6 × 105細(xì)胞，待細(xì)胞長滿單層后進(jìn)行劃痕實(shí)驗(yàn)，磷酸鹽緩沖液沖洗，去除劃下細(xì)胞，培養(yǎng)24 h后觀察并拍照。

1.3.4 Transwell 侵襲試驗(yàn)按Transwell小室操作說明書分別將轉(zhuǎn)染后細(xì)胞及對照組細(xì)胞懸液接種于上室，小室下面加入培養(yǎng)液作為化學(xué)引誘劑，在37 ℃培養(yǎng)箱中孵育48 h后，吸去培養(yǎng)基，甲醛固定侵入下室的細(xì)胞，結(jié)晶紫染色，顯微鏡計(jì)數(shù)移到膜下層的細(xì)胞，并拍照。

1.3.5 CCK-8 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)取轉(zhuǎn)染后的試驗(yàn)組及對照組食管癌細(xì)胞，以5×103個(gè)/孔接種至96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，常規(guī)培養(yǎng)。分別于0、12、24、48和72 h收集細(xì)胞，加入10 μL CCK-8液，37 ℃孵育2 h，用酶標(biāo)儀檢測450 nm波長處的吸光度，利用GraphPad Prism 8軟件繪制細(xì)胞生長曲線。

1.3.6 預(yù)后評價(jià)計(jì)算總生存期（overall survival，OS），總生存期指ESCC患者從手術(shù)至死亡或最后一次隨訪的時(shí)間（失訪患者）。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS 25.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)或Fisher確切概率法分析，計(jì)量資料采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行比較，生存分析采用Kaplan-Meier法。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 DLEU1 在ESCC 中的表達(dá)及其與臨床病理特征的關(guān)系RT-qPCR示，DLEU1在ESCC中的相對表達(dá)量顯著高于癌旁組織，表達(dá)量分別為（3.156±0.622）和（1.638 ± 0.355），兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=14.35，P ＜0.001），見圖1。ESCC中DLEU1相對表達(dá)量的中位數(shù)為3.192，定義DLEU1表達(dá)量＜3.192為低表達(dá)，3.192為高表達(dá)。ESCC組織中DLEU1的相對表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（P=0.023）和TNM分期（P=0.047）相關(guān)，而與患者的年齡、性別、腫瘤分化程度和浸潤深度均無關(guān)（P ＞0.05），見表1。

2.2 DLEU1 的表達(dá)與ESCC 患者預(yù)后的關(guān)系生存分析示，DLEU1高表達(dá)患者OS較低表達(dá)患者明顯縮短，兩組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2 =4.672，P=0.031），見圖2。

圖1 RT-qPCR 示ESCC 中DLEU1 的相對表達(dá)量顯著高于癌旁組織Fig.1 RT-qPCR showed that the expression of DLEU1 in ESCC tissues was significantly higher than that in adjacent tissues

表1 DLEU1 表達(dá)與ESCC 患者臨床病理特征的關(guān)系Tab.1 Relationships between DLEU1 expression and clinicopathological characteristics of ESCC patients 例

圖2 DLEU1 高表達(dá)與低表達(dá)ESCC 患者生存曲線圖Fig.2 Survival curves of ESCC patients with high and low expression of DLEU1

2.3 干擾DLEU1表達(dá)對TE-13細(xì)胞增殖的影響ECA109、EC9706和TE-13細(xì) 胞中DLEU1的相 對表達(dá)量分別為（1.610 ± 0.141）、（1.691 ± 0.104）和（2.552 ± 0.103），TE-13的DLEU1表達(dá)量較高。本研究采用DLEU1 siRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染TE-13細(xì)胞，干擾DLEU1的表達(dá)。RT-qPCR篩選干擾效率最高的siRNA，結(jié)果表明DLEU1 siRNA3轉(zhuǎn)染組的DLEU1表達(dá)水平最低，干擾效率最高（圖3），后續(xù)采用DLEU1 siRNA3進(jìn)行研究。分別取對照組和干擾組細(xì)胞進(jìn)行CCK-8實(shí)驗(yàn)，干擾后48 h對照組的吸光度值（1.130 ± 0.122）高于干擾組（0.696 ± 0.099）（P=0.009），72 h對照組的吸光度值（1.979±0.196）高于干擾組（1.049 ± 0.136）（P = 0.003），表明干擾DLEU1表達(dá)能抑制TE-13細(xì)胞的增殖（圖4）。

圖3 RT-qPCR 示siRNA3 轉(zhuǎn)染組干擾效率最高Fig.3 RT-qPCR detection showed that siRNA3 group had the highest interference efficiency

圖4 CCK-8 實(shí)驗(yàn)表明，干擾DLEU1 表達(dá)可以抑制TE-13細(xì)胞的增殖Fig.4 CCK-8 assay showed that interference with DLEU1 expression could inhibit the proliferation of TE-13 cells

2.4 干擾DLEU1 表達(dá)對TE-13 細(xì)胞遷移、侵襲的影響用Image J軟件計(jì)算劃痕后愈合面積百分比，結(jié)果顯示，劃痕24 h后，對照組的愈合面積為（47.23±6.10）%，干擾組愈合面積為（22.97±4.10）%，干擾組細(xì)胞愈合速度顯著慢于對照組（t = 5.714，P = 0.004），表明干擾DLEU1表達(dá)可以抑制TE-13細(xì)胞的遷移（圖5）。Transwell侵襲試驗(yàn)顯示，干擾組和對照組的穿膜細(xì)胞數(shù)分別為（164.0±22.6）個(gè)和（246.3 ± 44.0）個(gè)，干擾組較對照組穿膜細(xì)胞數(shù)顯著減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=2.882，P=0.045），表明干擾DLEU1表達(dá)可以抑制TE-13細(xì)胞的侵襲（圖6）。

3 討論

圖5 劃痕實(shí)驗(yàn)示干擾DLEU1 表達(dá)可以抑制TE-13 細(xì)胞的遷移（×200）Fig.5 Wound healing assay showed that knowdown of DLEU1could inhibit the migration of TE-13 cells（×200）

圖6 Transwell 侵襲實(shí)驗(yàn)示干擾DLEU1 表達(dá)可以抑制TE-13 細(xì)胞的侵襲（×200）Fig.6 Transwell invasion assay showed that knowdown of DLEU1 could inhibit the invasion of TE-13 cells（×200）

食管癌是高發(fā)惡性腫瘤之一，全球近一半的食管癌新發(fā)病例和死亡病例發(fā)生在我國，與歐美國家食管癌病理類型以腺癌為主不同，我國的食管癌90%以上為鱗癌［9-10］。盡管采取手術(shù)、放化療、靶向及免疫治療等綜合治療手段，但是食管癌的預(yù)后并未能得到明顯改善，很多患者仍死于腫瘤的復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移，食管癌的總體5年生存率＜20%［11-12］。越來越多的研究［13-15］表明lncRNA的表達(dá)異常與食管癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，lncRNA有可能成為食管癌診斷和預(yù)后監(jiān)測的有效標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)。

研究［16-19］發(fā)現(xiàn)lncRNA DLEU1在肝癌、結(jié)直腸癌等多種惡性腫瘤中表達(dá)上調(diào)，并與預(yù)后相關(guān)，有可能成為新的診斷標(biāo)志物及預(yù)后預(yù)測指標(biāo)。在肝癌中的研究［16］發(fā)現(xiàn)，DLEU1在肝癌組織中表達(dá)明顯上調(diào)，并與更晚的臨床分期、血行轉(zhuǎn)移和不良預(yù)后密切相關(guān)。在直腸癌中的研究［20］發(fā)現(xiàn)，DLEU1在直腸癌腫瘤組織中較鄰近組織表達(dá)上調(diào)，并與患者的不良預(yù)后相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，DLEU1在ESCC腫瘤組織中的表達(dá)較癌旁正常組織中明顯升高，并且在ESCC細(xì)胞株TE-13中也發(fā)現(xiàn)DLEU1的表達(dá)水平升高，提示DLEU1參與了ESCC的發(fā)生和發(fā)展過程。本研究還發(fā)現(xiàn)，DLEU1的表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、更晚的臨床分期相關(guān)，DLEU1在低分化患者中高表達(dá)比例（64.7%）高于高中分化患者（42.4%），T3+T4患者中高表達(dá)比例（58.1%）高于T1+T2患者（36.8%），但經(jīng)檢驗(yàn)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可能與本研究入組病例較少有關(guān)，研究結(jié)果表明DLEU1高表達(dá)提示患者預(yù)后不良，同時(shí)生存分析也提示DLEU1高表達(dá)患者生存時(shí)間明顯縮短，DLEU1表達(dá)水平上調(diào)可能是ESCC患者預(yù)后不良的標(biāo)志。DLEU1有可能成為ESCC診斷及預(yù)后預(yù)測的分子標(biāo)志物。

研究還發(fā)現(xiàn)DLEU1參與了腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲和凋亡等許多重要的生物學(xué)過程，在腫瘤發(fā)生過程中發(fā)揮了類似癌基因的作用。在胃癌中的研究［21］發(fā)現(xiàn)，上調(diào)DLEU1可以促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖，而干擾表達(dá)則可以明顯抑制胃癌細(xì)胞的增殖能力，引起細(xì)胞周期阻滯，導(dǎo)致凋亡，DLEU1還可以通過對賴氨酸特異性去甲基化酶1啟動子的調(diào)節(jié)來調(diào)控轉(zhuǎn)錄。在非小細(xì)胞肺癌中的研究［22］發(fā)現(xiàn)，DLEU1的高表達(dá)促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，并通過上調(diào)CDK1的表達(dá)抑制腫瘤細(xì)胞凋亡，動物實(shí)驗(yàn)也證實(shí)DLEU1的過表達(dá)能促進(jìn)腫瘤的生長。本研究發(fā)現(xiàn)干擾DLEU1的表達(dá)可以抑制TE-13細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，DLEU1有可能成為ESCC治療的潛在靶點(diǎn)。但是DLEU1對ESCC細(xì)胞生物學(xué)行為的影響及相關(guān)機(jī)制，仍有待進(jìn)一步的研究。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)lncRNA DLEU1在ESCC中表達(dá)上調(diào)，并與不良預(yù)后相關(guān)，DLEU1對食管鱗癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲可能具有調(diào)節(jié)作用，有可能成為ESCC治療的潛在靶點(diǎn)。