李根華 馮嵩 韓光魁 馬文淵 劉臣 孔令勝 靳峰

膠質(zhì)瘤是成年人中最常見、最具有侵襲性的原發(fā)腦腫瘤，約占中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤的30%，雖然近年來治療技術(shù)不斷進步，但膠質(zhì)瘤患者的預(yù)后仍不理想[1-2]。膠質(zhì)母細胞瘤（glioblastoma multiforme，GBM）是Ⅳ級膠質(zhì)瘤，患者1年生存率低于30%，高級別惡性膠質(zhì)瘤患者中期生存時間僅有約15個月[3]。腫瘤干細胞概念的提出給腫瘤生物學和治療方法帶來本質(zhì)的變化，相關(guān)文獻提示靶向腫瘤干細胞殺傷或者分化可能是對高侵襲性腫瘤最好的治療策略[4]。

在膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展中涉及到多種基因的失調(diào)。Livin是凋亡蛋白抑制基因（inhibitor of apoptosis protein，IAP）家族成員，既往研究發(fā)現(xiàn)Livin基因過表達與細胞增殖/凋亡、化學治療耐藥關(guān)系密切，而且Livin基因在不同細胞系表達量存在差異性[5]。IAP家族的抗凋亡機制主要是阻斷Caspase途徑激活而引起的細胞凋亡過程，致使細胞凋亡停止，細胞增殖能力增強并延長細胞的存活時間。為進一步研究Livin基因與化學治療藥物干預(yù)后細胞增殖/凋亡的關(guān)系，課題組利用免疫磁珠分選方法從TJ905細胞系中分離培養(yǎng)出CD133+干細胞，使用慢病毒載體轉(zhuǎn)染技術(shù)將細胞凋亡抑制基因Livin轉(zhuǎn)染進膠質(zhì)瘤TJ905細胞和TJ905干細胞，上調(diào)細胞中Livin基因表達量，建立相關(guān)細胞模型，給予不同濃度的替莫唑胺 （temozolomide，TMZ）干預(yù)，使用反轉(zhuǎn)錄PCR（reverse transcription-PCR，RT-PCR）、流式細胞儀、CCK-8等技術(shù)檢測干預(yù)后細胞增殖活性及Livin、Caspase-3/7表達量的變化，探討TMZ對Livin基因介導(dǎo)的膠質(zhì)瘤干細胞細胞增殖活性的影響。

材料與方法

一、主要試劑和儀器

試劑：DMEM/F12培養(yǎng)基、胎牛血清（Hyclone，美國），PI試劑盒（四季青公司，中國），表皮生長因子（epidermal growthfactor，EGF）、堿性成纖維細胞生長因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）、白血病抑制因子（leukemiainhibitory factor，LIF）（Peprotech公司，美國）、胰蛋白酶、B27（Gibco公司，美國），兔抗人CD133抗體、免疫磁珠（CD133+）細胞分選試劑盒（Miltenyi Biotec公司，德國），CCK-8試劑盒（日本同仁化學研究所，日本），Livin基因慢病毒過表達載體（上海吉凱基因有限公司）。

儀器：Multiskan酶標儀（Thermo公司，美國），生物安全柜Ⅱ.A2（力康生物醫(yī)療科技控股有限公司），熒光顯微OLYMPUS IX71 （奧林巴斯有限公司，日本），流式細胞儀BD LSRⅡ型（Becton Dickinson公司，美國），免疫磁珠分選儀（Miltenyi Biotec公司，德國），實時定量PCR儀Applied Biosystems（7900HT公司，美國）。

二、細胞培養(yǎng)及分選

膠質(zhì)瘤TJ905細胞由天津神經(jīng)病學研究所建系并饋贈。

細胞培養(yǎng)：條件均為37℃、5%CO2，TJ905細胞置于含10%胎牛血清的常規(guī)DMEM/F12培養(yǎng)基中培養(yǎng)，TJ905干細胞置于含有EGF（20 ng/mL）、bFGF（20 ng/mL）、LIF（10 ng/mL）、B27（1×）的無血清DMEM/F12培養(yǎng)基中培養(yǎng)。

免疫磁珠分選CD133+細胞[6]：TJ905細胞在無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)10 d后，利用免疫磁珠分離方法分選、培養(yǎng)CD133+干細胞，成球后用胰蛋白酶消化，5000個/孔接種96孔板，CCK-8檢測增殖活性，重復(fù)3次。

三、Livin基因過表達細胞模型構(gòu)建

按照預(yù)實驗摸索出的感染復(fù)數(shù)（multiplicity of infection，MOI）值（TJ905細胞：MOI=5；TJ905干細胞：MOI=10）計算需要病毒數(shù)量，polybrene作用是增強慢病毒感染力，使用濃度為5 μg/mL，將計算好的慢病毒過表達載體病毒液體直接加入Enhanced Infection Solution（慢病毒稀釋液），混均后滴加到算好所需培養(yǎng)基中。在慢病毒過表達載體轉(zhuǎn)染20 h后棄掉培養(yǎng)基，換用新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。慢病毒載體攜帶綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP），轉(zhuǎn)染進細胞內(nèi)培養(yǎng)72 h后能在熒光顯微鏡下呈現(xiàn)綠色熒光，RT-PCR檢測Livin表達量的變化。細胞分組：TJ905細胞Livin過表達組 （TJ905 ACC-OE組：轉(zhuǎn)染慢病毒Livin過表達載體）、TJ905細胞Livin過表達對照組（TJ905 ACC-CON組：轉(zhuǎn)染慢病毒空載體）；TJ905干細胞Livin過表達組（TJ905 CSC-OE組：轉(zhuǎn)染慢病毒Livin過表達載體）、TJ905干細胞Livin過表達對照組（TJ905 CSC-CON組：轉(zhuǎn)染慢病毒空載體）。

四、CCK-8檢測細胞增殖及TMZ干預(yù)后細胞毒效應(yīng)

提前24 h在96孔板按105個/孔分別接種TJ905細胞及其干細胞，次日吸掉培養(yǎng)基后每孔添加TMZ濃度分別為0（空白對照）、25、50、100、200、400 μmol/L的TMZ培養(yǎng)基100 μL （空白對照以DMSO代替TMZ），每孔設(shè)2個副孔。TMZ干預(yù)48 h后棄掉培養(yǎng)基，每孔加100 μL CCK-8溶液（DMEM/F12∶CCK-8為9∶1），37℃溫箱孵育90 min，上機檢測，檢測波長450 nm，參照波長630 nm，每組重復(fù)2次。

五、RT-PCR檢測Livin及Caspase-3/7基因表達量

分別用上述濃度的TMZ干預(yù)TJ905細胞及TJ905干細胞，并在干預(yù)48 h后收集細胞，提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄-擴增產(chǎn)物使用RT-PCR技術(shù)進行定量分析。PRIMER5.0設(shè)計Livin、Caspase-3/7引物序列，引物序列信息見表1，在反應(yīng)過程中每次擴增的同時設(shè)無cDNA做陰性對照。獲取各組標本的標準曲線結(jié)果分析采用熒光定量PCR儀器自帶分析軟件分析標本的Ct值，待測樣品相對值=2-△Ct，△Ct=Ct陰性對照-Ct待測樣品。

六、流式細胞儀檢測細胞周期

按照實驗設(shè)計分組，將所得細胞制成單細胞懸液后使用70%乙醇4℃固定過夜，次日PBS漂洗，添加500 μL配制好的PI染色液，37℃孵育30 min，4℃冰盒待檢。流式細胞儀采用激發(fā)波長488 nm檢測紅色熒光，同時檢測光散射情況，流式細胞儀自帶分析軟件分析數(shù)據(jù)。

表1 引物序列

七、統(tǒng)計學分析

應(yīng)用SPSS19.0軟件進行數(shù)據(jù)處理，符合正態(tài)分布的計量資料 （RT-PCR數(shù)據(jù)）以均數(shù)±標準差（Mean±SD）表示，組間比較采用單因素方差分析，組內(nèi)數(shù)據(jù)兩兩比較采用t檢驗，P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

結(jié)果

一、Livin基因轉(zhuǎn)染鑒定

慢病毒載體攜帶GFP蛋白，轉(zhuǎn)染進細胞內(nèi)培養(yǎng)72 h后能在熒光顯微鏡下呈現(xiàn)綠色熒光：普通倒置顯微鏡下觀察TJ905細胞呈正常膠質(zhì)瘤細胞形態(tài)（圖1A），TJ905干細胞呈正常膠質(zhì)瘤干細胞形態(tài)（圖1B），熒光顯微鏡下均呈現(xiàn)相應(yīng)的綠色熒光（圖1C～D）。

二、CCK-8檢測Livin轉(zhuǎn)染前后及TMZ干預(yù)后細胞增殖活性

Livin基因轉(zhuǎn)染后細胞增殖速度變快，而在化學治療藥物TMZ干預(yù)后細胞增殖速度減慢，CCK-8檢測發(fā)現(xiàn)TMZ能明顯降低4組膠質(zhì)瘤細胞的增殖速度，抑制膠質(zhì)瘤細胞增殖（表2）。

三、RT-PCR檢測Livin、Caspase-3/7基因表達量

圖1 慢病毒轉(zhuǎn)染前后膠質(zhì)瘤TJ905細胞及其干細胞顯微鏡下觀察

表2 CCK-8檢測TMZ干預(yù)各組細胞48 h后細胞增殖活性

（1）TJ905細胞Livin基因表達量[（245.245±4.521）×10-5]高于TJ905干細胞[（23.566±1.231）×10-5]，兩者比較差異具有統(tǒng)計學意義（t=81.953，P＜0.001）。慢病毒載體轉(zhuǎn)染后Livin基因過表達組表達量升高，Caspase-3表達量減低，Caspase-7表達量升高，與慢病毒空載體0 μmol/L對照差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。（2）TMZ干預(yù)后隨著藥物干預(yù)濃度的增大Livin表達量降低，Caspase-3/7表達量增高，同組細胞藥物干預(yù)后與0 μmol/L對照，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），說明TMZ能有效抑制Livin基因表達，促進Caspase-3/7基因表達，誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤TJ905細胞及其干細胞凋亡。具體信息見表3～5。

四、流式細胞儀檢測細胞周期變化

TMZ干預(yù)細胞模型48 h后，TJ905 CSC-OE組誘導(dǎo)在S、G2/M停滯，CSC-CON組則是在S期停滯；TJ905 ACC-OE組在S期停滯，對G2/M則是低濃度誘導(dǎo)停滯，隨藥物濃度增加其誘導(dǎo)作用減弱，ACCCON在G2/M期停滯；TJ905 CSC-OE組與CSC-CON組、TJ905 ACC-OE組與ACC-CON組的上述周期檢測對比差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。具體信息見表6、圖2。

討論

目前，GBM患者的預(yù)后仍極差，即使接受手術(shù)切除聯(lián)合放射治療和化學治療的綜合治療方式，患者的5年生存率僅有10%[7]。目前膠質(zhì)瘤的標準治療方案即手術(shù)切除，輔助以放射治療和化學治療，延長患者生存時間。與其他烷化劑比較，TMZ是新型烷化劑、小分子物質(zhì)，能有效穿過血腦屏障，具有獨一無二的特性。多種研究已經(jīng)證實TMZ是高級別膠質(zhì)瘤的有效藥物，能有效延長GBM患者的生存時間，使GBM患者單獨放射治療的2年生存率10.4%提高到聯(lián)合治療的26.5%[8-9]。但無論何種治療方式均不能有效改善患者預(yù)后，提高患者生存質(zhì)量。越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，膠質(zhì)瘤患者經(jīng)TMZ治療后很快出現(xiàn)化學治療耐藥，治療效果變差?；谀z質(zhì)瘤的治療現(xiàn)狀，本研究采用GBM細胞系TJ905及其干細胞，探討目前臨床一線化學治療藥物TMZ對TJ905細胞及其干細胞的細胞增殖/凋亡的影響，為膠質(zhì)瘤化學治療耐藥研究提供一定的實驗及理論基礎(chǔ)。

表3 RT-PCR檢測TMZ干預(yù)各組細胞48 h Livin mRNA表達變化（×10-5）

表4 RT-PCR檢測TMZ干預(yù)各組細胞48 h Caspase-3 mRNA表達變化（×10-5）

表5 RT-PCR檢測TMZ干預(yù)各組細胞48 h Caspase-7 mRNA表達變化（×10-5）

表6 流式細胞儀檢測TMZ干預(yù)48 h細胞周期變化（%）

Livin是IAP家族成員，在細胞凋亡、細胞增殖和控制細胞周期方面起著關(guān)鍵作用[10]。細胞凋亡是Caspase激活的協(xié)調(diào)效應(yīng)，Caspase-3/7在細胞凋亡過程中起著細胞凋亡啟動、細胞凋亡執(zhí)行的重要作用，尤其在內(nèi)源性細胞凋亡途徑，細胞色素C從線粒體解除，并與Apaf-1結(jié)合，導(dǎo)致Caspase-9重組和凋亡小體形成，Caspase-9激活介導(dǎo)的凋亡小體激活Caspase-3和Caspase-7，其促進細胞死亡，但是激活的Caspase能被內(nèi)源性抑制劑IAP抑制[11-13]。

腫瘤干細胞存在類似于正常干細胞的細胞休眠靜止狀態(tài)的特性，對放射治療和化學治療敏感性差，導(dǎo)致其能在放射治療和化學治療后仍能存活一部分，而正是僅存的這部分腫瘤干細胞成為膠質(zhì)瘤復(fù)發(fā)的源頭[14]。為了解Livin基因?qū)瘜W治療藥物干預(yù)前后細胞增殖/凋亡的影響，本研究構(gòu)建了Livin基因慢病毒過表達細胞模型，并使用不同藥物濃度的TMZ干預(yù)，檢測藥物干預(yù)后細胞模型中Livin基因的變化，了解細胞增殖/凋亡的變化，有助于進一步研究Livin基因與細胞增殖/凋亡、化學治療耐藥的關(guān)系。

圖2 TMZ干預(yù)各組細胞48 h細胞周期變化

本研究發(fā)現(xiàn)，Livin基因在膠質(zhì)瘤TJ905細胞表達量顯著高于TJ905干細胞，與之前研究膠質(zhì)瘤U251細胞時結(jié)果相反，說明膠質(zhì)瘤干細胞在分化、增殖過程中可能存在不穩(wěn)定性[15]。CCK-8檢測發(fā)現(xiàn)Livin基因表達量的多少可能與細胞增殖速度有關(guān)，說明細胞凋亡抑制基因Livin在細胞增殖過程中起著重要作用，但由于大多數(shù)干細胞為休眠狀態(tài)，只有在激活條件下才能分裂、增殖，因此要檢測Livin基因表達量的多少與細胞增殖之間的關(guān)系，需在同種細胞內(nèi)完成，單純檢測Livin基因表達量的高低并不能比較普通腫瘤細胞與其干細胞增殖活性強弱。藥物干預(yù)后，膠質(zhì)瘤TJ905細胞和TJ905干細胞中Livin基因表達量隨著藥物濃度增加而降低，Caspase-3/7基因表達增高，再次說明Livin基因與Caspase之間存在密切關(guān)系，在膠質(zhì)瘤的細胞增殖與細胞凋亡過程中具有重要作用。

運用慢病毒轉(zhuǎn)染技術(shù)將Livin基因轉(zhuǎn)染進膠質(zhì)瘤TJ905細胞和TJ905干細胞后，細胞周期發(fā)生變化，Livin基因過表達導(dǎo)致膠質(zhì)瘤干細胞的細胞周期G0/G1增加明顯，而TJ905細胞周期則是G2/M期少量增加，研究結(jié)果說明Livin基因在膠質(zhì)瘤TJ905細胞和TJ905干細胞中對細胞周期的影響機制存在差異，也可能是膠質(zhì)瘤干細胞存在休眠狀態(tài)，轉(zhuǎn)染后激活干細胞細胞分裂所致。而在TMZ干預(yù)后膠質(zhì)瘤細胞及其干細胞細胞周期停滯在不同的分裂周期，導(dǎo)致細胞增殖減緩。TMZ能明顯抑制膠質(zhì)瘤TJ905細胞和TJ905干細胞的增殖活性，且相同干預(yù)條件下，對TJ905細胞的抑制作用明顯強于TJ905干細胞，干細胞比普通細胞的表現(xiàn)出有更強的化學治療藥物耐藥。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)TMZ能有效抑制TJ905細胞及其干細胞的增殖，由于腫瘤干細胞在分化過程中存在不穩(wěn)定性，Livin、Caspase基因雖然在細胞抗凋亡過程中起著關(guān)鍵作用，且TMZ可有效地抑制膠質(zhì)瘤TJ905細胞及TJ905干細胞的增殖，促進細胞凋亡，但考慮細胞凋亡有著不同的細胞凋亡途徑，單純給予TMZ治療并不能有效徹底地抑制腫瘤增殖。因此，膠質(zhì)瘤的治療需要多種治療方式聯(lián)合應(yīng)用。單純針對干細胞中Livin、Caspase-3/7基因靶向治療并不能有效解決膠質(zhì)瘤化學治療耐藥及復(fù)發(fā)。鑒于細胞實驗的局限性，后期將根據(jù)本研究結(jié)果進一步完善相關(guān)動物實驗。