孫萍萍 郭正紅 楊武德 羊波 沈成俊 沈祥春 陶玲 肖婷

摘 要 目的：建立生/醋延胡索飲片及配方顆粒的指紋圖譜，并測定其中5種生物堿成分（原阿片堿、延胡索乙素、延胡索甲素、鹽酸小檗堿、鹽酸巴馬?。┑暮?。方法：采用高效液相色譜法。色譜柱為Agilent TC-C18，流動相為0.1%磷酸水溶液-甲醇（梯度洗脫），流速為1.0 mL/min，檢測波長為280 nm，柱溫為30 ℃，進樣量為10 μL。以鹽酸巴馬汀為參照，利用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2012版）》建立11批生延胡索飲片、7批生延胡索配方顆粒、12批醋延胡索飲片、11批醋延胡索配方顆粒的指紋圖譜并進行相似度評價;采用上述HPLC法測定41批生/醋延胡索飲片及配方顆粒中原阿片堿、延胡索乙素、延胡索甲素、鹽酸小檗堿、鹽酸巴馬汀的含量。結果：生延胡索飲片及其配方顆粒分別確定共有峰12、20個，醋延胡索飲片及其配方顆粒分別確定共有峰14、16個;各批次同類樣品的相似度分別為0.529～0.981、0.342～0.985、0.711～0.999、0.437～0.998。原阿片堿、延胡索乙素、延胡索甲素、鹽酸小檗堿、鹽酸巴馬汀檢測質量濃度的線性范圍分別為1.9～38.0、2.0～40.0、2.2～44.0、2.6～52.0、2.3～46.0 μg/mL（R 2均大于0.999 0），加樣回收率為100.12%～100.98%（RSD=1.05%～1.90%，n=9），精密度、重復性、穩(wěn)定性（24 h）、耐用性試驗的RSD均小于2.0%。不同批次的生/醋延胡索飲片及配方顆粒中上述5種生物堿成分的平均含量分別為0.24～0.46、0.37～0.82、0.24～0.58、0.07～0.75、0.24～0.76 mg/g，RSD為12.27%～147.48%。結論：成功建立生/醋延胡索飲片及配方顆粒的指紋圖譜;醋制前后延胡索飲片及配方顆粒指紋圖譜相似度不一，且其中上述5種生物堿含量差異較大。

關鍵詞 延胡索;醋制;高效液相色譜法;生物堿;指紋圖譜;含量測定

中圖分類號 R917 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2020）20-2462-07

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2020.20.06

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To establish the fingerprint of crude/vinegar-processed Corydalis yanhusuo decoction pieces and their dispensing granules， and to determine the contents of five alkaloids （protopine， tetrahydropalmatine， corydaline， berberine hydrochloride， palmatine hydrochloride）. METHODS： HPLC method was adopted. The determination was performed on Agilent TC-C18 column with mobile phase consisted of 0.1% phosphoric acid solution-methanol （gradient elution） at the flow rate of 1.0 mL/min. The detection wavelength was set at 280 nm， and the column temperature was 30 ℃. The sample size was 10 μL. Using palmatine hydrochloride as reference， Similarity Evaluation System of TCM Chromatographic Fingerprint （2012 edition） was used to establish the fingerprint of 11 batches of C. yanhusuo decoction pieces， 7 batches of crude C. yanhusuo dispensing granules， 12 batches of vinegar- processed C. yanhusuo decoction pieces and 11 batches of vinegar-processed C. yanhusuo dispensing granules. The same HPLC method was adopted to determine the contents of protopine， tetrahydropalmatine， corydaline， berberine hydrochloride and palmatine hydrochloride in 41 batches of crude/vinegar-processed C. yanhusuo decoction pieces and their dispensing granules. RESULTS： There were 12 and 20 common peaks for crude C. yanhusuo decoction pieces and its dispensing granules， and 14 and 16 common peaks for vinegar-processed C. yanhusuo decoction pieces and its dispensing granules. The similarity of each batch of same type were 0.529-0.981， 0.342-0.985， 0.711-0.999， 0.437-0.998， respectively. The linear range of protopine， tetrahydropalmatine， corydaline， berberine hydrochloride and? palmatine hydrochloride were 1.9-38.0， 2.0-40.0， 2.2-44.0， 2.6-52.0， 2.3-46.0 μg/mL（R 2>0.999 0）. The recoveries were 100.12%-100.98%（RSD=1.05%-1.90%，n=9）. RSDs of precision， reproducibility， stability （24 h） and durability tests were all lower than 2.0%. The average contents of five alkaloids in different batches of crude/vinegar-processed C. yanhusuo decoction pieces and its dispensing granules were 0.24-0.46， 0.37-0.82， 0.24-0.58， 0.07-0.75， 0.24-0.76 mg/g. RSDs were 12.27%-147.48%. CONCLUSIONS： The fingerprint of crude/vinegar-processed C. yanhusuo decoction pieces and its dispensing granules is established successfully. The similarities of fingerprint are different before and after processing with vinegar， and the contents of five alkaloids in C. yanhusuo decoction pieces and its dispensing granules are greatly different.

KEYWORDS? ?Corydalis yanhusuo; Vinegar-procession; HPLC; Alkaloids; Fingerprint; Content determination

延胡索Corydalis Rhizoma為罌粟科紫堇屬植物延胡索Corydalis yanhusuo W. T. Wang的干燥塊莖，具有活血、行氣、止痛的功效，被稱為“止痛之要藥”，專治上下一身諸痛[1]。該藥主產于浙江省東陽、磐安一帶，是著名的“浙八味”之一。延胡索配方顆粒是以單味延胡索飲片經一定工藝加工制成的一種新型配方藥物，因其保存、服用方便，近年來已逐步在各級醫(yī)院應用[2-3]，但目前尚缺乏安全性、生物等效性等方面的系統(tǒng)研究[4]。

隨著分析化學及相關儀器的迅速發(fā)展，有關延胡索活性成分的研究也得以深入。目前，已在延胡索中發(fā)現(xiàn)了40多種生物堿，主要包括原小檗堿類、阿樸菲類、原阿片堿類、異喹啉芐咪唑類、異喹啉苯并菲啶類、雙芐基異喹啉類等[5]?，F(xiàn)代研究表明，生物堿是延胡索的主要活性成分[6-8]，具有顯著的鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜、催眠作用，對冠心病、心律失常、胃潰瘍等疾病有較好的臨床療效[9-11]。其中，原阿片堿具有鎮(zhèn)痛、解痙、改善微血管循環(huán)、抗血小板聚集、擴血管等作用[12];延胡索乙素和延胡索甲素同為延胡索行血鎮(zhèn)痛的主要活性成分，具有鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜、催眠、抗心律失常、降血壓等作用[13];鹽酸小檗堿具有抗炎、抗菌、抗腫瘤等作用[14];鹽酸巴馬汀具有抗炎、抗菌、降血糖等作用[15]，上述5種生物堿均為延胡索抗炎鎮(zhèn)痛的主要指標性成分。延胡索作為一味常用中藥，在經典方劑、配方顆粒和中成藥等傳統(tǒng)中醫(yī)藥的各個領域均有廣泛應用，建立其統(tǒng)一的質量標準意義重大。

為了緩和中藥藥性、增強藥效、降低毒副作用，通常會對生藥材進行炮制加工。生延胡索為延胡索干燥塊莖，常用的炮制方法為醋制。研究表明，在醋制延胡索中，原阿片堿、延胡索乙素、巴馬汀、小檗堿、去氫延胡索等生物堿含量均有不同程度升高[16]，同時延胡索乙素的穩(wěn)定性亦有所增強[17]，提示炮制會對延胡索的生物堿含量造成一定影響。

目前，對延胡索的質量控制和評價方法主要有兩種：一種是以《中國藥典》為基礎，以延胡索中主要化學成分的含量作為藥材和制劑的質量控制指標，即2015年版《中國藥典》（一部）對延胡索原藥材及飲片的含量測定均以延胡索乙素為對象，對單一化合物進行含量檢測與控制[1];另一種方法是建立指紋圖譜，指紋圖譜具有全面性、整體性、層次性、關聯(lián)性和動態(tài)性的特點[18]，有助于實現(xiàn)對中藥內在和整體質量的綜合評價。基于此，本研究采用高效液相色譜法（HPLC），建立11批生延胡索飲片、7批生延胡索配方顆粒、12批醋延胡索飲片、11批醋延胡索配方顆粒的指紋圖譜;同時，對這41批樣品中原阿片堿、延胡索乙素、延胡索甲素、鹽酸小檗堿、鹽酸巴馬汀的含量進行測定，以期為生/醋延胡索飲片及其配方顆粒的整體質量控制提供參考。

1 材料

1.1 儀器

Agilent 1260型HPLC儀和Agilent TC-C18色譜柱、Agilent HC-C18色譜柱（美國Agilent公司）;Daisogel-C18色譜柱（上海宸喬生物科技有限公司）;SG8200HE型數(shù)控超聲波清洗器（上海冠特超聲儀器有限公司）;AUW220D型十萬分之一天平（日本Shimadzu公司）;HC-800Y高速多功能粉碎機（武義海納電器有限公司）。

1.2 藥品與試劑

11批生延胡索飲片（編號：A1～A11）、7批生延胡索配方顆粒（編號：B1～B7，規(guī)格：1 g/袋）、12批醋延胡索飲片（編號：C1～C12）、11批醋延胡索配方顆粒（編號：D1～D11，規(guī)格：1 g/袋）樣品來源信息詳見表1。其中，生/醋延胡索飲片由貴州醫(yī)科大學藥學院生藥學教研室龍慶德副教授鑒定為罌粟科紫堇屬植物延胡索C.yanhusuo W. T. Wang的干燥塊莖或塊莖炮制品。原阿片堿、延胡索乙素、延胡索甲素、鹽酸小檗堿、鹽酸巴馬汀對照品（成都植標化純生物技術有限公司，批號分別為PCS0963、PCS0603、PCS0604、PCS0133、PCS0470，純度均不低于98.0%）;甲醇為色譜純，甲酸等其余試劑均為分析純，水為超純水。

2 方法與結果

2.1 溶液的制備

2.1.1 混合對照品溶液 分別精密稱取原阿片堿、延胡索乙素、延胡索甲素、鹽酸小檗堿、鹽酸巴馬汀對照品適量，置于1 mL量瓶中，加入少量甲醇搖勻，超聲（功率：500 W，頻率：59 kHz，下同）使完全溶解后，用甲醇定容，制得原阿片堿、延胡索乙素、延胡索甲素、鹽酸小檗堿、鹽酸巴馬汀質量濃度分別為1.9、2.0、2.2、2.6、2.3 mg/mL的混合對照品溶液，置于4 ℃冰箱內保存，備用。

2.1.2 飲片供試品溶液 分別取生/醋延胡索飲片適量，粉碎，過四號篩，取粉末約0.5 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，加入70%乙醇25 mL，稱定質量，超聲處理45 min，取出，冷卻至室溫，再次稱定質量，用70%乙醇補足減失質量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液作為飲片供試品溶液。

2.1.3 配方顆粒供試品溶液 取生/醋延胡索配方顆粒適量，研細，過四號篩，取粉末約0.45 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，加入70%乙醇100 mL，稱定質量，超聲處理45 min，取出，冷卻至室溫，再次稱定質量，用70%乙醇補足失質量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液作為配方顆粒供試品溶液。

2.2 色譜條件

色譜柱：Agilent TC-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）;流動相：0.1%磷酸水溶液（A）-甲醇（B），梯度洗脫（0～15 min，5%B→25%B;15～30 min，25%B→27%B;30～45 min，27%B→30%B，45～55 min，30%B→31%B;55～60 min，31%B→45%B;60～65 min，45%B→95%B;65～70 min，95%B;70～75 min，95%B→5%B;75～85 min，5%B）;流速：1.0 mL/min;柱溫：30 ℃;檢測波長：280 nm;進樣量：10 μL。分別精密吸取“2.1”項下混合對照品溶液、“2.2”項下供試品溶液（生延胡索飲片，編號：A3）和陰性對照溶液（70%乙醇溶液）各10 μL，按“2.2”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖，詳見圖1。由圖1可見，5個待測生物堿成分均基線分離，相鄰峰間的分離度均大于1.5，且陰性對照溶液無干擾，表明該方法專屬性較好。

2.3 指紋譜圖的建立

2.3.1 精密度試驗 精密稱取同一批生延胡索飲片粉末（編號：A3）約0.5 g，按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.2”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。以鹽酸巴馬汀（峰5）作為參照，計算得到各共有峰相對保留時間和相對峰面積的RSD均小于1.50%（n=6），表明該方法精密度良好。

2.3.2 穩(wěn)定性試驗 精密稱取同一批生延胡索飲片粉末（編號：A3）約0.5 g，按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，分別于室溫下放置0、2、4、8、12、24 h時按“2.2”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。以鹽酸巴馬?。ǚ?）作為參照，計算得到各共有峰相對保留時間和相對峰面積的RSD均小于1.50%（n=6），表明供試品溶液在室溫下放置24 h內穩(wěn)定性良好。

2.3.3 重復性試驗 分別精密稱取同一批生延胡索飲片粉末（編號：A3）6份，每份約0.5 g，按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.2”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。以鹽酸巴馬?。ǚ?）作為參照，計算得到各共有峰相對保留時間和相對峰面積的RSD均小于1.50%（n=6），表明該方法重復性良好。

2.3.4 HPLC指紋圖譜生成及共有峰指認 取41批生/醋延胡索飲片及配方顆粒適量，按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.2”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。利用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2012版）》[19]，分別以A1、B1、C1、D1為參照樣品，設置時間窗寬度為0.2 min，圖譜間距為50，通過多點校正及自動峰匹配生成疊加指紋圖譜，采用中位數(shù)法生成生/醋延胡索飲片和配方顆粒樣品的對照指紋圖譜（R），詳見圖2。在上述指紋圖譜中，分別確定了共有峰12個（生延胡索飲片）、20個（生延胡索配方顆粒）、14個（醋延胡索飲片）、16個（醋延胡索配方顆粒）。通過與對照品（見圖1A）比對，指認了其中5個色譜峰，即峰1、2、3、4、5分別為原阿片堿、延胡索乙素、延胡索甲素、鹽酸小檗堿、鹽酸巴馬汀。

2.3.5 HPLC指紋圖譜相似度分析 利用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2012版）》[20]對41批生/醋延胡索飲片及配方顆粒的HPLC指紋圖譜以及對照指紋圖譜（R）進行相似度評價。結果，11批生延胡索飲片的相似度為0.529～0.981，7批生延胡索配方顆粒的相似度為0.342～0.985，12批醋延胡索飲片的相似度為0.711～0.999，11批醋延胡索配方顆粒的相似度為0.437～0.998?？梢姡煌a地及批次的生/醋延胡索飲片及顆粒紋圖譜相似度有所差異，詳見表2～表5。綜合“2.3.4”項下共有峰指認情況發(fā)現(xiàn)，延胡索飲片經過醋制后成分譜有明顯變化;制成顆粒后，成分譜也有明顯增加的趨勢，可能與濃縮、干燥、制粒等產地加工工藝不同有關。

2.4 含量測定

2.4.1 線性關系考察 精密吸取“2.1”項下混合對照品溶液適量，加甲醇逐級稀釋，制成原阿片堿質量濃度分別為1.9、3.8、9.5、19.0、38.0 μg/mL，延胡索乙素質量濃度分別為2.0、4.0、10.0、20.0、40.0 μg/mL，延胡索甲素濃度分別為2.2、4.4、11.0、22.0、44.0 μg/mL，鹽酸小檗堿質量濃度分別為2.6、5.2、13.0、26.0、52.0 μg/mL，鹽酸巴馬汀質量濃度分別為2.3、4.6、11.5、23.0、46.0 μg/mL的系列混合對照品溶液，按“2.2”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。以質量濃度為橫坐標（x，μg/mL）、峰面積為縱坐標（y）進行回歸分析，結果見表6。

2.4.2 精密度試驗 精密吸取“2.1”項下混合對照品溶液，用甲醇稀釋后，按“2.2”項下色譜條件連續(xù)測定6次，記錄峰面積。結果，原阿片堿、延胡索乙素、延胡索甲素、鹽酸小檗堿、鹽酸巴馬汀峰面積的RSD分別為1.56%、1.28%、0.78%、1.49%、1.95%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.4.3 重復性試驗 精密稱取同一批生延胡索飲片粉末（編號：A3）約0.5 g，共6份，按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.2”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并按外標法計算原阿片堿、延胡索乙素、延胡索甲素、鹽酸小檗堿、鹽酸巴馬汀的含量。結果，原阿片堿、延胡索乙素、延胡索甲素、鹽酸小檗堿、鹽酸巴馬汀含量的RSD分別為1.00%、0.38%、1.72%、1.38%、0.96%（n=6），表明該方法重復性良好。

2.4.4 穩(wěn)定性試驗 精密稱取同一批生延胡索飲片粉末（編號：A3）約0.5 g，按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，分別在室溫下放置0、2、4、8、12、24 h時按“2.2”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果，原阿片堿、延胡索乙素、延胡索甲素、鹽酸小檗堿、鹽酸巴馬汀峰面積的RSD分別為1.44%、0.59%、1.62%、1.50%、1.13%（n=6），表明供試品溶液在室溫下放置24 h內穩(wěn)定性良好。

2.4.5 加樣回收率試驗 精密稱取已知含量的生延胡索飲片粉末（編號：A3）0.25 g，共9份，分別按已知量的50%、100%、150%加入原阿片堿、延胡索乙素、延胡索甲素、鹽酸小檗堿、鹽酸巴馬汀對照品，每個濃度3份，按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.2”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算加樣回收率。結果，原阿片堿、延胡索乙素、延胡索甲素、鹽酸小檗堿、鹽酸巴馬汀的平均加樣回收率分別為100.12%、100.70%、100.98%、100.75%、100.98%，RSD分別為1.70%、1.57%、1.90%、1.26%、1.05%（n=9），表明該方法準確度良好。

2.4.6 耐用性考察 取同一批生延胡索飲片粉末（編號：A3）約0.5 g，按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.2”項下色譜條件分別以Agilent TC-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Agilent HC-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Daisogel-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）進樣測定，記錄峰面積并按外標法計算含量。結果，原阿片堿、延胡索乙素、延胡索甲素、鹽酸小檗堿、鹽酸巴馬汀在3種色譜柱上測得含量的RSD分別為0.70%、0.41%、1.10%、0.86%、1.21%（n=3），表明本方法耐用性良好。

2.4.7 樣品含量測定 取11批生延胡索飲片、7批生延胡索配方顆粒、12批醋延胡索飲片和11批醋延胡索配方顆粒樣品適量，分別按“2.1.2”“2.1.3”項下方法制備供試品溶液，再按“2.2”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并按外標法計算含量。結果，11批生延胡索飲片、7批生延胡索配方顆粒、12批醋延胡索飲片、11批醋延胡索配方顆粒中5種生物堿成分的平均含量分別為0.24～0.46、0.37～0.82、0.24～0.58、0.07～0.75、0.24～0.76 mg/g，RSD分別為12.27%～52.68%、12.55%～49.12%、39.60%～60.56%、26.71%～147.48%，表明不同產地和批次飲片及配方顆粒含量差異較大，詳見表7～表10。

3 討論

本研究采用HPLC法對41批生/醋延胡索飲片及配方顆粒進行了指紋圖譜研究，同時對生/醋延胡索飲片及配方顆粒中原阿片堿、延胡索乙素、延胡索甲素、鹽酸小檗堿、鹽酸巴馬汀5種生物堿成分進行了含量測定。指紋圖譜分析結果顯示，延胡索飲片經醋制加工后主要化學成分個數(shù)有所變化，且將飲片制成配方顆粒后主要化學成分個數(shù)明顯增加，這說明延胡索飲片在濃縮、干燥、制粒過程中，化學成分受到了一定影響。相似度評價結果顯示，不同產地及批次的生/醋延胡索飲片及配方顆粒指紋圖譜的相似度有所差異。5種生物堿含量測定結果顯示，醋延胡索飲片中原阿片堿、鹽酸小檗堿、鹽酸巴馬汀含量高于生延胡索飲片，延胡索乙素、延胡索甲素含量低于生延胡索飲片，表明延胡索經醋制后其化學成分或其存在形式均發(fā)生了變化[20]，且醋制還可能增加了部分生物堿成分的溶出度[21]。在生延胡索配方顆粒中，原阿片堿、延胡索乙素、鹽酸小檗堿、鹽酸巴馬汀含量均高于生延胡索飲片，僅延胡索甲素含量低于生延胡索飲片，表明生延胡索飲片提取濃縮制成顆粒后大部分有效成分的含量有所增加。在醋延胡索配方顆粒中，5種生物堿含量普遍高于醋延胡索飲片，均表明提取濃縮制成顆粒后，藥效更佳。中藥配方顆粒劑具有免煎煮、服用便捷、起效迅速，且工藝先進、利于貯存等優(yōu)勢，更加順應現(xiàn)代社會對藥物的基本要求。

綜上所述，本研究成功建立了生/醋延胡索飲片及配方顆粒的指紋圖譜和原阿片堿、延胡索乙素、延胡索甲素、鹽酸小檗堿、鹽酸巴馬汀5種生物堿含量的測定方法。結果表明，生/醋延胡索飲片及配方顆粒指紋圖譜相似度不一，且其中上述5種生物堿含量差異較大。

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（收稿日期：2020-06-03 修回日期：2020-09-07）

（編輯：鄒麗娟）