康婭，楊曉雨，王夢昌

西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院血液內(nèi)科1、醫(yī)療信息管理辦公室2，陜西 西安 710061

慢性粒細(xì)胞白血病(chronic myeloid leukemia，C ML)是血液系統(tǒng)惡性腫瘤[1]，目前尚不能根治。大部分CML 經(jīng)歷慢性期、加速期至急變期，最終進(jìn)入疾病終末狀態(tài)?，F(xiàn)有的研究表明白血病干細(xì)胞是白血病發(fā)生的根源。尋找到靶向清除白血病干細(xì)胞的有效方法可治愈白血病[2]。微小RNA (miRNA)在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達(dá)為白血病干細(xì)胞的研究提供了新的方向。本課題組初期運(yùn)用微小RNA基因芯片，檢測2例服用二代酪氨酸激酶抑制劑尼洛替尼的CML (慢性期、加速期各1 例)患者治療前后外周血miRNA 表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)miR-144 治療前后存在明顯異常表達(dá)，治療后上調(diào)。這提示miR-144 可能與CML 治療藥物或發(fā)病機(jī)制有關(guān)。絲裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase，MAPK)信號(hào)通路參與到CML發(fā)病的信號(hào)通路中，其中MAPK1 可調(diào)節(jié)細(xì)胞的各個(gè)階段[3]，與腫瘤的生長擴(kuò)散密切相關(guān)。查詢Targetscan7.1數(shù)據(jù)庫系統(tǒng)，miR-144家族中的miR-144-3p是一個(gè)典型的癌癥抑制因子，參與多種癌癥細(xì)胞的增殖調(diào)控[4]。miR-144-3p 可與1 043 個(gè)mRNA 的3'非翻譯區(qū)結(jié)合，包括與白血病發(fā)病有關(guān)的MAPK等基因，推測在慢性粒細(xì)胞白血病急變期miR-144-3p與MAPK基因之間可能存在某種聯(lián)系。具體機(jī)制不清。本研究利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR (RT-qPCR方法)，對慢性粒細(xì)胞白血病急變期患者和正常健康者的外周血單個(gè)核細(xì)胞進(jìn)行miRNA-144-3p和MAPK1 mRNA定量檢測，比較兩組受檢者是否存在差異表達(dá)，以期能為慢性粒細(xì)胞白血病干細(xì)胞研究提供新的思路?，F(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下：

1 資料與方法

1.1 一般資料 實(shí)驗(yàn)所需要的C ML急變期外周血均來自于2018 年11 月至2019 年3 月就診于西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院血液內(nèi)科的患者(病例組)，共10 例，男性3 例，女性7 例，中位年齡41.00 [30.50～51.25]歲；慢性粒細(xì)胞白血病急粒變5 例，慢性粒細(xì)胞白血病急淋變5 例。CML 急變期診斷符合《中國慢性髓性白血病診斷與治療指南(2016 年版)》[1]。正常對照組外周血樣本均來自西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院血液內(nèi)科工作人員，共11 例。所有標(biāo)本獲取及處理流程按照西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)所制定的倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)，并獲得倫理批件，實(shí)驗(yàn)獲得受試對象或其家庭成員的同意，并簽署相關(guān)同意書。

1.2 實(shí)驗(yàn)主要試劑及來源 Trizol (美國，Ambion公司)；HiScript逆轉(zhuǎn)錄酶、5×HiScript緩沖液、50×ROX Reference Dye 2、SYBR 綠色標(biāo)記材料(美國，VAZYME公司)；核糖核酸酶抑制劑(北京，全式金生物技術(shù)有限公司)；dNTP、Taq Plus DNA Polymerase、DL2000 DNA Marker(北京，天根生化科技有限公司)；Random Primer(N6)(日本，TaKaRa)；聚合酶鏈反應(yīng)引物的制備來自武漢擎科公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)所用主要儀器及生產(chǎn)公司 RT-PCR(美國，ABI)；PCR管(美國，EXTRAGENE/illumina)；微量分光光度計(jì)(杭州奧盛儀器有限公司)；微波爐(韓國，LG)；Aquapro 超級(jí)純水儀(美國，Aquapro)；pH 計(jì)(德國，Metter-Toledo GmbH公司)；PCR儀(東勝創(chuàng)新生物科技有限公司)；水平電泳儀(北京君意東方電泳設(shè)備有限公司)；紫外分析儀(北京君意東方電泳設(shè)備有限公司)；無RNase袋裝吸頭(美國，EXTRAGENE)。

1.4 實(shí)時(shí)定量PCR 引物序列 實(shí)時(shí)定量PCR引物序列見表1。 miRNA 反義鏈通用引物：CCAGTGCAGGGTCCGAGGTATT。

表1 引物序列

1.5 Trizol法提取RNA 抽取實(shí)驗(yàn)對象外周血液2 mL，按照Trizol試劑盒說明書提取RNA。利用微量分光光度計(jì)測定吸光光度值，計(jì)算樣品RNA 的濃度。將總RNA放于-80℃冰箱內(nèi)保存以備用。

1.6 逆轉(zhuǎn)錄成cDNA 根據(jù)試劑盒的說明書對RNA 進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。反應(yīng)體系配制見表2。實(shí)驗(yàn)所用的移液器吸頭和離心管，均必須提早采用0.1% DEPC溶劑浸沒過夜，再用高壓殺菌、烘干后方可應(yīng)用于本實(shí)驗(yàn)。

1.7 RT-qPCR 檢測 將實(shí)時(shí)定量PCR 所需試劑置于冰上融解，上下輕柔顛倒使之混勻，短暫離心后將試劑放置冰上待用。根據(jù)說明書，冰上配制實(shí)時(shí)定量PCR 反應(yīng)液，反應(yīng)體系見表3。

表2 逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系

表3 PCR反應(yīng)體系

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS20.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料不符合正態(tài)分布，采用M[P25～P75]表示，兩兩組間比較采用獨(dú)立樣本秩和檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組受檢者的臨床資料比較 兩組受檢者的年齡和白細(xì)胞計(jì)數(shù)比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，但病例組患者的血紅蛋白含量和血小板計(jì)數(shù)明顯低于對照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見表4。

2.2 兩組受檢者的miR-144-3p、MAPK1mRNA表達(dá)水平比較 病例組患者的miR-144-3p mRNA和MAPK1 mRNA 的表達(dá)水平明顯低于對照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見表5。 miR-144-3p mRNA PCR曲線見圖1，miR-144-3p的溶解曲線見圖2。

表4 兩組受檢者的臨床資料比較(M[P25～P75])

表5 兩組受檢者的miR-144-3p 、MAPK1 mRNA 表達(dá)水平比較(M[P25～P75])

圖2 miR-144-3p的溶解曲線

3 討論

慢性粒細(xì)胞白血病好發(fā)于中年人，是常見的血液系統(tǒng)惡性腫瘤。盡管酪氨酸激酶抑制劑(tyrosine kinase inhibitors (TKIs)在控制CML 慢性期取得了顯著的成功[5]，但由于TKIs 不能殺死白血病干細(xì)胞而導(dǎo)致CML 復(fù)發(fā)、耐藥[6]。對大部分患者來說，CML 目前仍不能根治，進(jìn)入急變期后預(yù)后更差，急需要研究發(fā)現(xiàn)新的針對白血病干細(xì)胞有關(guān)的發(fā)病機(jī)制及治療手段。

miRNA 是一種非編碼小RNA，具有癌基因或抑癌基因功能[7-9]。研究發(fā)現(xiàn)人體骨髓白血病干細(xì)胞中存在miRNA 的表達(dá)[10]，miRNA 對白血病干細(xì)胞有著重要的調(diào)控作用。已有研究證實(shí)，通過靶向BCR-ABL基因，miR-96在慢性粒細(xì)胞白血病疾病轉(zhuǎn)化過程中充當(dāng)腫瘤抑制因子的作用[11]?？梢娢⑿NA 與慢性粒細(xì)胞白血疾病進(jìn)展機(jī)制密切相關(guān)，而目前CML疾病進(jìn)展機(jī)制不清。

MAPK 信號(hào)通路參與到CML 發(fā)病的信號(hào)通路中[12]。MAPK 亞族中的MAPK1 可調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化、凋亡和血管形成[13]，從而促進(jìn)腫瘤生長與擴(kuò)散。已有文獻(xiàn)報(bào)道了各種參與調(diào)控CML相關(guān)的MAPK信號(hào)通路蛋白級(jí)聯(lián)的miRNAs的潛在作用[14]。miRNA在信號(hào)通路中有靶向多個(gè)基因的能力，這使得其作用及研究復(fù)雜化。課題組前期鑒定出的miR-144 與生物體蛋白磷酸化密切相關(guān)，能穩(wěn)定存在于人體體液中。文獻(xiàn)提示：在直腸癌中，miR-144 存在低表達(dá)，并參與了絲裂原活化蛋白激酶途徑，最終抑制直腸癌細(xì)胞凋亡，促進(jìn)腫瘤增殖[15]。有學(xué)者通過實(shí)時(shí)定量PCR方法證實(shí)miR-144在CML急變期細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)[16]，它參與了MAPK 信號(hào)通路，在費(fèi)城染色體陽性的K562 細(xì)胞中抑制MAPK 信號(hào)通路，促進(jìn)K562 細(xì)胞的凋亡[17]。推測miR-144可能成為未來的治療靶標(biāo)。

本研究通過Targetscan7.1 數(shù)據(jù)庫系統(tǒng)查找miR-144，發(fā)現(xiàn)其家族包括2 個(gè)成員，即miR-144-3p、miR-144-5p。其中研究較多的是miR-144-3p，它與腦膠質(zhì)瘤[18]、結(jié)腸癌[19]等細(xì)胞增殖、凋亡、疾病預(yù)后密切相關(guān)。在非小細(xì)胞肺癌中利用微陣列及RT-PCR技術(shù)證明miR-144-3p 下調(diào)，它可能是潛在的疾病標(biāo)志物[20]，與患者預(yù)后有關(guān)。研究還提示，在多發(fā)性骨髓瘤中，miR-144-3p 通過靶向c-Met 抑制細(xì)胞增殖，促進(jìn)凋亡[21]；在前列腺癌中，miR-144-3p 通過靶向CEP55抑制細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)凋亡[22]。miR-144-3p在多種腫瘤細(xì)胞中起著重要作用。Targetscan 7.1 數(shù)據(jù)庫提示miR-144-3p 可與MAPK1 基因的3'非翻譯區(qū)結(jié)合，在結(jié)腸癌細(xì)胞中已經(jīng)證實(shí)miR-144-3p 可以靶向抑制MAPK1，從而抑制細(xì)胞增殖擴(kuò)散，并誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡[19]。推測miR-144-3p與MAPK1基因在慢性粒細(xì)胞白血病急變期也可能有潛在聯(lián)系，具體調(diào)控機(jī)制不清。

查詢miRBase 數(shù)據(jù)庫系統(tǒng)，miR-144-3p 位于17號(hào)染色體上，與現(xiàn)有的CML 主要的發(fā)病機(jī)制t(9;22)(q34;q11)易位所不同。探索miR-144-3p 與MAPK1在慢性粒細(xì)胞白血病中的表達(dá)及調(diào)控機(jī)制有利于尋找CML未知的發(fā)病機(jī)制及新的靶向治療手段。

本研究結(jié)果顯示，病例組患者血常規(guī)中血紅蛋白含量、血小板計(jì)數(shù)明顯低于健康對照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。提示在醫(yī)療過程中關(guān)注血紅蛋白含量及血小板計(jì)數(shù)的改變可以協(xié)助判斷慢性粒細(xì)胞白血病患者是否進(jìn)入急變期，以便及時(shí)調(diào)整治療方案。

本研究結(jié)果還顯示，病例組患者的miR-144-3p mRNA 和MAPK1 mRNA 的表達(dá)水平明顯低于對照組, 差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。提示miR-144-3p、MAPK1 基因參與了慢性粒細(xì)胞白血病急變期，而急變期單個(gè)核細(xì)胞中存在大量的白血病干細(xì)胞，推測miR-144-3p、MAPK1與白血病干細(xì)胞有關(guān)，可為慢性粒細(xì)胞白血病干細(xì)胞研究提供新的思路。本研究因?yàn)槿梭w標(biāo)本，研究數(shù)量少，目前尚缺少miRNA 與MAPK1 靶向作用沒有驗(yàn)證，以及miR-144-3p 對慢性粒細(xì)胞白血病急變期單個(gè)核細(xì)胞增殖、凋亡、周期影響的實(shí)驗(yàn)，因此有待課題組下一步實(shí)驗(yàn)完成來得出更客觀準(zhǔn)確的結(jié)論。