王嘉鑫,閆志軍,石安華,劉宥苡,呂 煜,陳 蕓,代佑果
胃癌的發(fā)生發(fā)展是一個多階段的復雜過程,涉及到腫瘤細胞與宿主細胞的黏附性、細胞外基質(zhì)的酶解及腫瘤血管生成等過程[1-3]。在此過程中多種機制參與了腫瘤的發(fā)展,其中淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是胃癌癌細胞侵襲的首要步驟[4]。胃癌患者轉(zhuǎn)移的主要途徑是淋巴系統(tǒng),淋巴結(jié)受累的程度是影響患者生存率的主要因素[5-6]。
腫瘤淋巴管浸潤是一個復雜的、多因素參與的過程。原發(fā)腫瘤病灶中,腫瘤細胞侵襲淋巴管是第一步。淋巴管浸潤和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是胃癌進展中最重要的步驟[7]。NO作為一種信號分子,在炎癥和癌變過程中起著重要作用[8-9]。近年來,研究表明NO在腫瘤的淋巴管形成及結(jié)轉(zhuǎn)移中起著重要作用[10]。生理狀態(tài)下,NO由淋巴管內(nèi)皮細胞合成,調(diào)節(jié)著淋巴的滲透和流動。腫瘤環(huán)境中,腫瘤細胞產(chǎn)生的過量NO可增加淋巴管通透性,調(diào)節(jié)淋巴管舒張,從而促進通過淋巴管浸潤所致的癌細胞蔓延。此外,NO可通過增加VEGF-C/VEGF-D和VEGF-R2 /VEGF-R3的表達,從而促進淋巴管形成[11-12]。而誘導型一氧化氮合成酶(inducible nitric oxide synthase, iNOS)作為病理狀態(tài)下體內(nèi)合成NO的主要催化劑,近年來發(fā)現(xiàn)其與胃癌的淋巴管形成有密切關(guān)系[1]。D2-40是O-連接、唾液酸糖蛋白podoplamin表面的固定性抗表位,可表達于淋巴管內(nèi)皮細胞。然而,iNOS表達與胃癌淋巴管形成及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系研究較少。本研究旨在探討胃腺癌組織中iNOS表達,及與淋巴管形成的相關(guān)性。
1.1 研究對象收集2017年7月至2018年12月昆明醫(yī)科大學第三附屬醫(yī)院(云南省腫瘤醫(yī)院)腹部外科78例胃癌根治術(shù)患者的癌組織及癌旁組織標本。納入標準:術(shù)前未行新輔助化放療;所有患者外科手術(shù)切緣為陰性;無肝、肺等遠處器官轉(zhuǎn)移;無其它先前的或伴隨原發(fā)癌癥。排除標準:嚴重心血管疾病、呼吸道疾病或糖尿病、上消化道梗阻、穿孔和出血、嚴重感染需要治療的患者。78例胃腺癌患者中,男46例,女32例,平均年齡(53.2 ± 7.4)歲,參照國際抗癌聯(lián)盟第八版AJCC胃癌臨床TNM分期標準:T1期12例、T2期14例、T3期27例、T4期25例;N0期 13例、N1期 17例、N2期 20例、N3期 28例。本研究經(jīng)昆明醫(yī)科大學第三附屬醫(yī)院倫理委員會批準(批準號:ky201724),所有患者均簽署知情同意書。
1.2 主要試劑iNOS、D2-40鼠抗人一抗購自美國Abcam公司,免疫組化SP試劑盒購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司。
1.3 方法癌組織及癌旁組織均用10%中性緩沖甲醛固定48 h,石蠟包埋,依據(jù)標準病理規(guī)范,對組織切片(4 μm)進行脫蠟,抗原提取在pH=6的檸檬酸鹽緩沖液中進行,微波時間為5 min。應(yīng)用免疫組織化學SP法進行iNOS和D2-40蛋白染色,按照試劑盒說明書進行操作。2個指標的蠟塊處理、切片、抗原修復及染色過程均相同,二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色后,蘇木精復染細胞核,氨水反藍后,于75%、85%、95%、100%無水乙醇中浸泡切片10 min,脫水,將切片放入二甲苯中浸泡10 min,取出切片封片。每張切片鏡下選取5個高倍鏡視野進行統(tǒng)計。iNOS為細胞質(zhì)、細胞核周圍微管染色,D2-40為細胞膜和胞漿染色。免疫組化結(jié)果判斷標準[1],抗體免疫組化染色強度的評估通過著色反應(yīng)分為 4 分:1為弱;2為中度;3為強;4為超強度。免疫染色量的評分為,0:無陽性免疫染色;1:≤25%;2:25%~49%;3:50%~75%;4: ≥75%細胞呈免疫陽性。通過將定性和定量的評分相加,得到總分,然后分成:(-)為無表達免疫組化染色(0分);(+)為低表達免疫組化染色(1-2 分);(2+)為中表達免疫組化染色(3-4分);(3+)為高表達免疫組化染色(>5分)。陽性率計算公式為:
陽性率=(+)+(2+)+(3+)/總數(shù)
2.1 iNOS在胃腺癌組織及癌旁組織中的表達癌組織中iNOS陽性表達率為64.10%(50/78),其中低表達免疫組化可見腫瘤組織細胞質(zhì)、細胞核周圍抗體著色弱,且染色量≤25%;中表達免疫組化可見腫瘤組織細胞質(zhì)、細胞核周圍抗體著色中度,且染色量25%~49%;高表達免疫組化可見腫瘤組織細胞質(zhì)、細胞核周圍抗體著色強或超強,且染色量≥50%,見圖1。胃腺癌組織的iNOS蛋白陽性表達率(50/78,64.10%)高于癌旁組織(40/78,51.3%),差異有統(tǒng)計學意義(P=0.014)。
2.2 D2-40在胃腺癌組織及癌旁組織中的表達癌組織中D2-40陽性表達率為73.08%(57/78),其中低表達免疫組化可見腫瘤組織細胞膜和胞漿抗體著色弱,且染色量≤25%;中表達免疫組化可見腫瘤組織細胞膜和胞漿抗體著色中度,且染色量25%~49%;高表達免疫組化可見腫瘤組織細胞膜和胞漿抗體著色強或超強,且染色量≥50%,見圖2。D2-40蛋白在胃腺癌組織的陽性表達率(57/78,73.08%)高于癌旁組織的陽性表達率(47/78,60.3%),差異有統(tǒng)計學意義(P=0.003)。
圖示癌組織中iNOS蛋白陽性表達高于癌旁組織
圖示癌組織中D2-40蛋白陽性表達率高于癌旁組織
2.3iNOS與D2-40表達的相關(guān)性胃腺癌組織中iNOS和 D2-40 的表達呈顯著正相關(guān)(rs=0.532,P=0.001)。
2.4iNOS表達與胃腺癌臨床病理特征的關(guān)系胃腺癌組織中iNOS的表達水平與腫瘤分化程度有關(guān),低分化腺癌陽性表達率較高中分化明顯升高(P=0.041)。此外,iNOS陽性表達率隨著臨床T分期和N分期越晚越高(P< 0.05)。見表1。
表 1 iNOS表達與胃腺癌臨床病理特征的關(guān)系(n)
近年來,研究表明NO在腫瘤淋巴管形成及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中起著重要作用。而iNOS作為病理狀態(tài)下體內(nèi)合成NO的主要催化劑,近年來發(fā)現(xiàn)其與胃癌的淋巴管形成有密切關(guān)系[1]。NOS按其存在的部位及作用機制可分為結(jié)構(gòu)性NOS和誘導型NOS。其誘導產(chǎn)生的NO在維持胃黏膜的完整性方面具有功能多樣性和兩面性[13]。在正常生理條件下,由結(jié)構(gòu)性NOS催化產(chǎn)生的低濃度NO可調(diào)節(jié)胃黏膜血供、胃酸和碳酸鹽的分泌,對胃黏膜起保護作用;而在病理狀態(tài)下,內(nèi)毒素、IFN-γ、IL-1、TNF-α及腫瘤生長因子-β等可刺激iNOS大量產(chǎn)生,iNOS催化產(chǎn)生的高濃度NO可導致氮氧自由基形成并使胺硝化成亞硝胺,誘發(fā)DNA突變,從而引發(fā)炎癥及腫瘤[14-16]。
iNOS作為病理狀態(tài)下產(chǎn)生高濃度NO的主要因子,在腫瘤細胞惡性增殖和轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮著重要作用。炎癥狀態(tài)下,iNOS主要表達于巨噬細胞和中性粒細胞。而在腫瘤組織,腫瘤細胞亦是iNOS的主要來源。Karaday等[1]研究顯示胃癌患者為中度至高度iNOS表達。本研究表明,iNOS在胃腺癌組織陽性表達率為64.10%,明顯比癌旁組織高(P<0.05),與文獻報道[17]一致。黎玉容等[18]認為,在胃癌組織中iNOS的表達水平和腫瘤的分級有關(guān)。本研究也表明,iNOS在胃腺癌組織的表達與組織分化程度相關(guān),低分化腺癌較高中分化腺癌陽性表達率高。
腫瘤細胞iNOS表達與炎癥密度、分化缺失、淋巴管形成及淋巴管擴散有明顯的聯(lián)系。iNOS表達增加可誘導腫瘤相關(guān)炎癥反應(yīng)和淋巴管形成[1]。本研究通過淋巴管特異性標記物D2-40與iNOS表達關(guān)系的免疫組化檢測發(fā)現(xiàn),兩者呈明顯的正相關(guān)關(guān)系,提示iNOS在胃腺癌淋巴管形成、浸潤和轉(zhuǎn)移中扮演著重要作用。并且,iNOS表達與T分期、N分期密切相關(guān),分期越晚,表達率越高。
綜上所述,本研究結(jié)果表明,iNOS在胃腺癌組織呈高表達,iNOS表達與腫瘤組織分化程度、T分期和N分期相關(guān),與胃腺癌組織淋巴管形成存在密切關(guān)系。iNOS作為病理狀態(tài)下產(chǎn)生高濃度NO的主要催化酶,在胃癌淋巴管形成中發(fā)揮著重要作用,具有潛在靶向治療的價值,值得進一步研究。