吳 磊，黎 煉，羅志剛，張 濤

0 引 言

膀胱癌屬于泌尿系統(tǒng)常見的惡性腫瘤，根據(jù)浸潤程度不同膀胱癌分為肌層浸潤性膀胱癌和淺表性膀胱癌。近年來其發(fā)病率和病死率不斷增高[1]，具有早期確診率低、惡化程度高、易復發(fā)和遠處轉(zhuǎn)移、預后差等特點，且大多數(shù)初診患者為淺表性膀胱癌[2-3]。盡管醫(yī)療水平不斷提高，但對于轉(zhuǎn)移的浸潤性膀胱癌患者，其5年生存率低于10%[4]。膀胱癌的發(fā)生、進展以及復發(fā)的機制尚未完全明確，如何有效阻止淺表性膀胱癌進展到浸潤性膀胱癌，對于膀胱癌患者的預后意義十分重大。因此，尋找能夠有效抑制膀胱癌細胞轉(zhuǎn)移的治療方法，對于控制膀胱癌的進展至關(guān)重要。

青藤堿是從中藥青風藤中提取出來的一種生物堿活性成分，具有抗炎、抗腫瘤、免疫抑制、抗風濕等多種藥理活性[5]。近年來，在抗腫瘤方面，青藤堿在抗胃癌、乳腺癌、肺癌和肝癌等效果顯著[6]。研究表明，青藤堿能通過誘導NCI-H460細胞凋亡來抑制非小細胞肺癌細胞系NCI-H460細胞的增殖；青藤堿還可通過阻斷上皮細胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transformation，EMT)過程來抑制肺癌細胞A549的侵襲[7]。然而，青藤堿對人膀胱癌細胞株T24增殖以及EMT的作用目前報道較少。因此，本研究通過觀察青藤堿對膀胱癌細胞株T24增殖、凋亡以及EMT的影響，以期為膀胱癌的臨床治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料人膀胱癌細胞株T24購自中科院細胞庫，鹽酸青藤堿購自湖南正清藥業(yè)有限公司，MTT試劑購自武漢百浩天生物科技有限公司，Annexin-V/PI細胞凋亡檢測試劑盒、Transwell小室購自北京明陽科華生物科技有限公司，N-cadherin、E-cadherin、Bak、β-actin、Bcl-2、Snial以及Slug抗體購自美國Santa Cruz公司，RPMI 1640、胎牛血清等細胞培養(yǎng)試劑購自上海生物工程股份有限公司，LY294002購自Sigma-Adrich。

1.2 細胞培養(yǎng)與處理將人膀胱癌細胞株T24培養(yǎng)于含10%胎牛血清、1%的青霉素-鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基中，環(huán)境為37 ℃、5% CO2。當細胞密度達到80%左右時，更換新的RPMI 1640培養(yǎng)基。隨后用0.5、1.0、2.0 mmol/L的青藤堿處理人膀胱癌細胞株T24細胞24 h。

1.3 細胞增殖實驗待人膀胱癌細胞株T24細胞生長至80%左右時，以3×104個/孔加入至6孔板中，置于培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h，環(huán)境為37 ℃、5% CO2。在細胞孔中分別加入含0.5、1.0、2.0 mmol/L的青藤堿的無血清培養(yǎng)基2 mL。24 h后將MTT試劑15 μL分別加入各孔中繼續(xù)培養(yǎng)4 h，加入DMSO 150 μL ，振蕩10 min，使用酶標儀490 nm處檢測各孔的吸光度值，并計算細胞活性。每組均設3個復孔。

1.4 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡收集經(jīng)過青藤堿處理后的人膀胱癌細胞株T24，用含1%牛血清白蛋白的PBS緩沖液沖洗固定細胞后離心10 min、1000轉(zhuǎn)/min，離心半徑8 cm，離心10 min，100 μL Binding緩沖液重懸細胞，混勻后加入10 μL的PI和10 μL Annexin V-FITC溶液，37 ℃避光反應15 min后加入碘化丙啶50 μg/mL進行染色，取樣品上流式細胞儀檢測。

1.5 Transwell實驗稀釋基質(zhì)凝膠，取40 μL加入至Transwell小室中，涂抹均勻后孵育24 h后，將膀胱癌細胞株T24加入至上層Transwell小室中，下層加入含10%胎牛血清的培養(yǎng)基。24 h后將膀胱癌細胞株T24固定于無水乙醇中，加入蘇木精-伊紅染色15 min，在倒置顯微鏡下計數(shù)進入濾膜下表面的細胞。

1.6 細胞劃痕實驗將人膀胱癌細胞株T24(8×104個/孔)接種于6孔培養(yǎng)板上培養(yǎng)24 h。當觀察到人膀胱癌細胞株T24細胞生長到95%左右時，使用200 μL無菌移液器槍頭劃傷每個孔，吸去懸浮細胞，清洗干凈后加入2.0 mmol/L的青藤堿，置于37 ℃環(huán)境下孵育24 h后拍照。利用ImageJ軟件分析劃痕的邊距。

1.7 Western blot分析收集經(jīng)青藤堿處理后人膀胱癌細胞株T24，加入細胞裂解液，4 ℃反應30 min后離心，6000 r/min，離心半徑8 cm，離心30 min后收集上清。通過BCA法檢測蛋白濃度后，取10 μL蛋白進行SDS-PAGE凝膠電泳后轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，相繼加入相應的一抗、二抗，其中先加入一抗后4 ℃孵育過夜，再加入二抗時在室溫下孵育2 h，最后加入ECL發(fā)光液，進行顯影處理。

2 結(jié) 果

2.1 青藤堿對膀胱癌細胞株T24增殖的影響MTT檢測結(jié)果顯示，0.5、1.0 、2.0 mmol/L的青藤堿處理24 h后，膀胱癌細胞株T24的細胞活性隨著青藤堿的濃度升高而逐漸降低[(100.00±2.52)%、(86.5±5.2)%、(64.5±4.5)%、(53.5±7.2)%]，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。提示青藤堿能夠抑制膀胱癌細胞株T24增殖。

2.2 青藤堿對膀胱癌細胞株T24凋亡的影響Western blot結(jié)果顯示，青藤堿處理膀胱癌細胞株T24后 Bcl-2表達逐漸降低，Bak表達逐漸增高。見圖1。0.5、1.0 、2.0 mmol/L的青藤堿處理48 h后，膀胱癌細胞株T24的凋亡率顯著增高。見圖2。

2.3 青藤堿抑制膀胱癌細胞株T24侵襲與遷移劃痕實驗結(jié)果顯示，隨著青藤堿濃度增加，膀胱癌細胞株T24的遷移水平呈逐漸下降的趨勢，2.0 mmol/L青藤堿最為顯著，見圖3。Transwell實驗結(jié)果表明，隨著青藤堿濃度增加，膀胱癌細胞株T24的侵襲率呈逐漸下降的趨勢，2.0 mmol/L青藤堿最為顯著。表明青藤堿能夠顯著抑制膀胱癌細胞株T24的侵襲與遷移能力，見圖4。

2.4 青藤堿抑制PI3K/Akt通路對EMT分子表達的影響隨著青藤堿濃度增加，Akt磷酸化水平逐漸降低，見圖5。2.0 mmol/L青藤堿處理后，膀胱癌細胞株T24中均出現(xiàn)EMT相關(guān)分子E-cadherin表達上調(diào)，N-cadherin、Slug和Snial表達下調(diào)，提示細胞EMT受抑制。進一步采用PI3K/Akt抑制劑(LY294002)處理細胞結(jié)果顯示，相較于青藤堿單獨處理的細胞，20 μmol/L PI3K/Akt抑制劑LY294002處理的膀胱癌細胞株T24中E-cadherin表達水平顯著升高，而N-cadherin、Slug和Snial的表達水平顯著降低。見圖6。

圖 1 不同濃度青藤堿對Bak和Bcl-2表達的影響

圖 2 不同濃度青藤堿對T24細胞凋亡的影響

a:0 mmol/L; b:0.5 mmol/L; c:1.0 mmol/L; d:2.0 mmol/L

a:0 mmol/L; b:0.5 mmol/L; c:1.0 mmol/L; d:2.0 mmol/L

圖 5 青藤堿對Akt磷酸化的影響

圖 6 青藤堿對EMT分子表達的影響

3 討 論

癌癥患者預后與腫瘤復發(fā)、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[8]。癌細胞增殖到脫離原位癌，癌細胞可進入淋巴和血液系統(tǒng)，轉(zhuǎn)移至遠處組織[9]。盡管當前醫(yī)療水平不斷提高，浸潤性膀胱癌的治療效果已取得了一定的療效，但對于轉(zhuǎn)移的患者，其5年生存率低于10%[4]。因此，有效控制膀胱癌細胞發(fā)生轉(zhuǎn)移也是目前臨床膀胱癌治療的關(guān)鍵。

有研究表明，青藤堿能通過細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶、磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B信號通路的調(diào)控作用，誘導人肺癌NCI-H226、NCI-H460和NCI-H522細胞凋亡[10]。還有文獻報道，將青藤堿作用于人肝癌細胞后，青藤堿可上調(diào)caspase 3、caspase 9、CAV1和下調(diào)SOX2的表達[11]。而青藤堿作用于肝癌細胞后，肝癌細胞內(nèi)Bcl-2表達下降，F(xiàn)as的表達升高，最終效應是人肝癌HeG2細胞的凋亡增加，而Bcl-2是凋亡抑制基因，F(xiàn)as是凋亡促進基因[12]。為了明確青藤堿對膀胱癌細胞增殖凋亡的影響，本研究檢測了膀胱癌細胞株T24的細胞活性以及凋亡水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同濃度的青藤堿均能夠顯著抑制膀胱癌細胞株T24細胞增殖，并可通過抑制Bcl-2表達，促進Bak表達增高誘導細胞凋亡。而考慮到青藤堿在抗腫瘤方面的重要作用，本研究結(jié)果與上述研究結(jié)果相符。

腫瘤轉(zhuǎn)移涉及細胞的多種生物學功能，尤其是侵襲與遷移，與疾病的惡性程度存在密切聯(lián)系。腫瘤細胞的侵襲與遷移是指腫瘤細胞從原組織向鄰近的宿主組織擴散、轉(zhuǎn)移，往往是反映腫瘤惡性程度的關(guān)鍵[13-14]。研究表明，青藤堿可以抑制人乳腺癌細胞系MDA-MB-231細胞的侵襲和遷移，且該效應呈現(xiàn)與青藤堿劑量相關(guān)的特點[15]。本研究采用2.0 mmol/L的青藤堿處理膀胱癌細胞株T24細胞24 h后，通過Transwell以及劃痕實驗檢測細胞的侵襲與遷移情況，結(jié)果顯示其侵襲與遷移水平受到明顯抑制。進一步證實青藤堿可以抑制膀胱癌細胞的侵襲與遷移過程。

腫瘤細胞轉(zhuǎn)移擴散至其他組織器官除了涉及細胞的侵襲與遷移過程外，通常還與細胞的EMT過程密切相關(guān)[16]。腫瘤細胞發(fā)生EMT主要對機體預后產(chǎn)生不良影響主要表現(xiàn)在增強腫瘤細胞侵襲和抗凋亡效應等兩個方面[17]。目前監(jiān)測腫瘤細胞EMT過程主要通過檢測細胞黏附分子(如E-cadherin)、EMT相關(guān)轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子(Slug、Snial)的表達來實現(xiàn)，其中E-cadherin的表達會減少，而Slug、Snial表達將增加[18]。為了明確青藤堿對膀胱癌細胞株T24PI3K/Akt通路的影響，本研究通過Western blot檢測了青藤堿處理前后Akt磷酸化水平的變化。本研究通過2.0 mmol/L的青藤堿處理膀胱癌細胞株T24細胞后，發(fā)現(xiàn)膀胱癌細胞株T24細胞內(nèi)E-cadherin表達上調(diào)，而N-cadherin、Slug和Snial表達下調(diào)，提示細胞EMT受抑制。

PI3K/Akt是一類重要的酪氨酸蛋白激酶，能夠參與多種細胞生理活動的調(diào)控[19]。為了進一步明確MAPKs與細胞EMT的關(guān)系，本研究采用PI3K/Akt抑制劑處理細胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)膀胱癌細胞株T24細胞中E-cadherin表達水平進一步升高，而N-cadherin、Slug和Snial的表達水平則顯著降低。充分說明青藤堿抑制膀胱癌細胞株T24EMT過程與PI3K/Akt通路抑制有關(guān)。

綜上所述，本研究初步證實青藤堿能夠顯著抑制膀胱癌細胞株T24細胞的增殖、侵襲以及遷移能力，并誘導細胞發(fā)生凋亡。此外，其還能夠通過抑制PI3K/Akt信號通路抑制膀胱癌細胞株T24細胞發(fā)生EMT。這為進一步明確膀胱癌的轉(zhuǎn)移機制，從而開發(fā)有效的治療藥物提供了實驗依據(jù)。