陳玨蓉,王 新,陳 尚,宋慶高,何 葦

0 引 言

非綜合征性唇腭裂是新生兒頜面部常見(jiàn)的出生缺陷，影響患兒容貌語(yǔ)音等諸多方面，我國(guó)新生兒患此病發(fā)生率達(dá)1.67‰左右[1]。腭的正常發(fā)育涉及多種信號(hào)網(wǎng)絡(luò)因子[2]，研究證實(shí)與腭發(fā)育相關(guān)的Shh信號(hào)在其他組織細(xì)胞中依賴(lài)初級(jí)纖毛發(fā)揮作用[3]，其他關(guān)鍵信號(hào)因子，如Wnt信號(hào)傳導(dǎo)也與初級(jí)纖毛相關(guān)[4]。已有研究證明初級(jí)纖毛存在于小鼠的胚胎腭突間充質(zhì)細(xì)胞上[5]，然而初級(jí)纖毛在小鼠胚胎腭突上皮細(xì)胞如何分布尚不清楚。本文旨在觀察初級(jí)纖毛在小鼠胚胎腭突上皮細(xì)胞的分布變化情況，為研究胚胎腭突上皮細(xì)胞中依賴(lài)初級(jí)纖毛傳遞的相關(guān)信號(hào)提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與材料SPF級(jí)C57BL/6J小鼠，由陸軍軍醫(yī)大學(xué)(原第三軍醫(yī)大學(xué))實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)：SLXR (渝) 20070005。適應(yīng)性飼養(yǎng)1～2周，每日給予光照和黑暗時(shí)間各為12 h，控制相對(duì)濕度30%～60%，控制溫度18～25 ℃，動(dòng)物飼料、飲用水和墊料均已消毒；實(shí)驗(yàn)作用掃描電子顯微鏡，為日本HITACHI品牌，S-3400型；透射電子顯微鏡，為日本HITACHI品牌，H-7650型；激光共聚焦顯微鏡，為德國(guó)Leica品牌，TCSSP2型；抗小鼠αα-tubulin單克隆抗體(32-2700，Thermo 美國(guó))，抗小鼠γ-tubulin單克隆抗體(PA-5-34815，Thermo 美國(guó))，Alexa 555山羊抗鼠IgG(H+L，A-21424，Thermo 美國(guó))，Alexa 488 山羊抗兔IgG(H+L，A-11034，Thermo 美國(guó))，抗熒光淬滅封片液(含DAPI，S36964，Thermo 美國(guó))。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣本采集以雄雌數(shù)為1∶2比例合籠實(shí)驗(yàn)小鼠，于第2天上午8:00檢查雌鼠的陰道內(nèi)有無(wú)精栓，稱(chēng)重標(biāo)記有精栓的雌鼠，標(biāo)記：妊娠0天(embryo day 0,ED0)，并單獨(dú)飼養(yǎng)；于ED10再次稱(chēng)重該鼠，重量增加≥2 g且腹部明顯隆起的小鼠確定為已孕繼續(xù)飼養(yǎng)，然后收集ED12.5、ED13.5、ED14.5和ED15.5的孕期小鼠為實(shí)驗(yàn)對(duì)象。

1.2.2掃描電鏡標(biāo)本制作各取2只ED12.5、ED13.5、ED14.5、ED15.5時(shí)的實(shí)驗(yàn)小鼠，均行安死術(shù)，取胚胎頭部腭以上部位組織先后置于預(yù)冷3%戊二醛和新鮮配置的1%鋨酸中各固定2 h后，然后將組織進(jìn)行梯度乙醇以及叔丁醇脫水，對(duì)樣品先行冷凍處理，再抽真空，之后行干燥處理，同時(shí)粘臺(tái)，最后樣本行導(dǎo)電處理后掃描電鏡觀察拍照。

1.2.3透射電鏡標(biāo)本制作與觀察各取2只ED12.5、ED13.5、ED14.5、ED15.5時(shí)的實(shí)驗(yàn)小鼠，均行安死術(shù)，取胚胎頭部腭以上部位，組織先后置于預(yù)冷3%戊二醛和新鮮配置的1%鋨酸中分別固定2h和1.5h。用梯度乙醇行脫水處理，用SPURR樹(shù)脂完成浸透包埋處理，修塊后以平行皮膚方向切取50 nm厚超薄切片，鋪片并干燥，甲苯胺藍(lán)染色，觀察定位后加膜后的200目銅網(wǎng)撈片，然后用二氧化鈾-醋酸鉛-檸檬酸鹽染色超薄切片30 min，最后透射電鏡觀察拍照。

1.2.4激光共聚焦顯微鏡標(biāo)本制作各取2只ED12.5、ED13.5、ED14.5、ED15.5時(shí)的實(shí)驗(yàn)小鼠，均行安死術(shù)，取胚胎頭部并快速將該組織放入4%多聚甲醛固定液中固定>2 h后，然后脫水石蠟包埋。待連續(xù)切片結(jié)束，實(shí)施免疫熒光(IF)染色操作：一抗孵育(抗小鼠αα-tubulin與抗小鼠γ-tubulin單抗)(1∶200)；二抗孵育(羊抗鼠IgG，紅色熒光；山羊抗兔IgG(Alexa 488)，熒光顯綠色)(1∶500)；DAPI顯色：用DAPI染液行3 min處理，待封片完成，借助激光共聚焦顯微鏡，完成觀察與拍照。

2 結(jié) 果

2.1 掃描電鏡觀察結(jié)果掃描電鏡下各時(shí)間點(diǎn)小鼠胚胎腭突組織表面均較完整，無(wú)明顯缺損，細(xì)胞間連接致密清晰，腭突上皮細(xì)胞形似半球，大小基本一致。ED12.5和ED13.5小鼠的前腭突和兩側(cè)側(cè)腭突輪廓清晰未融合，ED14.5小鼠側(cè)腭突在腭中線(xiàn)處由前向后部分融合，ED15.5兩端腭突大致融合。在ED12.5、ED 13.5與ED 14.5，能夠觀察到，上皮細(xì)胞表面數(shù)量較多、長(zhǎng)度<1 μm的偽足樣結(jié)構(gòu)，ED12.5、13.5、14.5小鼠腭突部分上皮細(xì)胞表面可見(jiàn)長(zhǎng)約2～8 μm的指狀突起，即為初級(jí)纖毛，纖毛膜細(xì)胞膜連續(xù)，ED12.5纖毛數(shù)量較ED13.5偏少， 觀察發(fā)現(xiàn)ED15.5腭突表面無(wú)纖毛。見(jiàn)圖1。

a、b、c、d：分別為ED12.5、ED13.5、ED14.5、ED15.5

2.2透射電鏡觀察結(jié)果通過(guò)透射電鏡，能夠觀察到不同時(shí)間段小鼠腭突上皮細(xì)胞均具備連續(xù)完整的胞膜，以及均勻的細(xì)胞質(zhì)，且于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)能夠清晰觀察到諸如線(xiàn)粒體等未發(fā)生腫脹的其他細(xì)胞器骨架，細(xì)胞核無(wú)膨脹，核膜完整，核仁呈圓形且質(zhì)地均勻。ED12.5初級(jí)纖毛基部清晰可見(jiàn)，位于小鼠腭突上皮細(xì)胞內(nèi)部，ED13.5小鼠腭突上皮細(xì)胞可見(jiàn)初級(jí)纖毛的基部、纖毛膜和微管，纖毛長(zhǎng)度約為1～3 μm，直徑在0.25～0.5 μm上下，纖毛基部深染，纖毛膜連接著細(xì)胞膜，纖毛最下端微管向其最上端延伸，ED14.5小鼠腭突上皮細(xì)胞上清晰可見(jiàn)纖毛結(jié)構(gòu)，達(dá)3～4 μm左右的長(zhǎng)度，呈0.25～0.5 μm左右直徑，ED15.5腭突上皮細(xì)胞表面則無(wú)初級(jí)纖毛。見(jiàn)圖2。

2.3激光共聚焦顯微鏡觀察結(jié)果激光共聚焦顯微鏡下可見(jiàn)紅色熒光為細(xì)胞α微管蛋白，綠色熒光為細(xì)胞γ微管蛋白。在ED12.5、ED 13.5與ED 14.5這3個(gè)時(shí)間段上，大部分初級(jí)纖毛處在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物腭突腭中嵴上皮細(xì)胞，在熒光反應(yīng)上，纖毛最下端與體部各顯示為綠色、紅色 ，見(jiàn)圖3，在ED15.5時(shí)間段，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物腭突上皮細(xì)胞表面沒(méi)有發(fā)現(xiàn)顯示上述熒光反應(yīng)的初級(jí)纖毛的存在。

a、b、c、d：分別為ED12.5、ED13.5、ED14.5、ED15.5

a、b、c、d：分別為ED12.5、ED13.5、ED14.5、ED15.5

3 討 論

哺乳動(dòng)物體內(nèi)多數(shù)細(xì)胞都有纖毛分布這一發(fā)現(xiàn)可追溯至100多年前，然而長(zhǎng)期以來(lái)，均把纖毛視作一類(lèi)退化結(jié)構(gòu)，近些年研究發(fā)現(xiàn)初級(jí)纖毛是細(xì)胞功能的主要調(diào)節(jié)中樞，初級(jí)纖毛對(duì)于傳遞細(xì)胞外的機(jī)械和化學(xué)信號(hào)到細(xì)胞內(nèi)至關(guān)重要，而且能夠調(diào)控細(xì)胞分化和增殖，以及細(xì)胞極性[6]。

初級(jí)纖毛屬于一類(lèi)細(xì)胞器，其構(gòu)成的基本單位為微管，它從細(xì)胞表面突出，起蜂窩天線(xiàn)的作用[7]。初級(jí)纖毛沒(méi)有中央微管，即9+0結(jié)構(gòu)，屬于非運(yùn)動(dòng)性纖毛，眾多研究結(jié)果均顯示，在顯著影響機(jī)體發(fā)育的大量信號(hào)通路傳遞方面，初級(jí)纖毛扮演者一定角色，包括Shh、Wnt、TGF、PDGFRα、Notch和RTK等信號(hào)通路，以及發(fā)揮通過(guò)細(xì)胞外基質(zhì)受體的信號(hào)傳遞、嘌呤能受體和離子通道等功能[3-4，8]。若纖毛功能或結(jié)構(gòu)失常，會(huì)阻止部分發(fā)育關(guān)鍵信號(hào)途徑順利傳導(dǎo)，由此導(dǎo)致包括呼吸障礙，肥胖，失明、腎功能異常，骨骼畸形、智力遲鈍等等缺陷[9]，甚至引起一系列嚴(yán)重的遺傳綜合癥。

研究證實(shí)哺乳動(dòng)物Hedgehog(Hh)信號(hào)通過(guò)初級(jí)纖毛發(fā)揮作用，幾乎所有的Hh信號(hào)的核心轉(zhuǎn)導(dǎo)組件都聚集在初級(jí)纖毛上[8]，與Wnt信號(hào)傳導(dǎo)也有一定關(guān)系[4]，異常的Wnt信號(hào)傳導(dǎo)可影響細(xì)胞的增殖與分化[10-11]。Sonic hedgehog(Shh)為Hh的其中一亞類(lèi)，研究顯示Shh在腭發(fā)育關(guān)鍵時(shí)期發(fā)揮重要作用[12]，特定時(shí)期小鼠胚胎腭突上皮細(xì)胞有Shh的廣泛表達(dá)[13]。那么小鼠腭發(fā)育期間Shh信號(hào)發(fā)揮作用是否依賴(lài)于初級(jí)纖毛還不得而知，要解決這個(gè)問(wèn)題首先要弄清小鼠腭突上皮細(xì)胞初級(jí)纖毛的分布情況，才能進(jìn)行進(jìn)一步深入的研究。

掃描電鏡顯示，ED12.5、ED 13.5、ED 14.5實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的腭突上皮細(xì)胞在腭突表面呈突起狀，其形似半球，清晰呈現(xiàn)出緊密的胞間聯(lián)系，此現(xiàn)象相符于其它研究人員借助掃描電鏡所得結(jié)果，可見(jiàn)取材以及之后的樣本制作行為，未傷及小鼠腭突[14]。借助透射電鏡，能夠發(fā)現(xiàn)小鼠腭突細(xì)胞具備完好、正常的胞膜，且顯示出均勻的胞質(zhì)，細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器(包括線(xiàn)粒體等)骨架清晰，且未見(jiàn)腫脹，細(xì)胞核與核膜皆正常，核膜嚴(yán)密貼合核，核仁似圓狀，具均勻質(zhì)地，可見(jiàn)，透射電鏡標(biāo)本制備行為，未導(dǎo)致胞內(nèi)細(xì)胞器受損，進(jìn)而推斷此次觀察到的諸如初級(jí)纖毛等其它細(xì)胞器與客觀狀況相符[15]。掃描電鏡和透射電鏡觀察到的纖毛長(zhǎng)度不一致，可能是由于標(biāo)本制作觀察過(guò)程中并不是每個(gè)觀察鏡像或切片都展示了完整的初級(jí)纖毛，或者初級(jí)纖毛正處于合成/解聚的過(guò)程，而不能展示其全長(zhǎng)[16]。

借助掃描電子顯微鏡，能夠觀察到有纖毛狀結(jié)構(gòu)分布于一些上皮細(xì)胞表面，此類(lèi)結(jié)構(gòu)長(zhǎng)達(dá)2～8 μm左右，本研究進(jìn)一步利用透射電鏡進(jìn)行觀察，通過(guò)透射電鏡發(fā)現(xiàn)了初級(jí)纖毛內(nèi)部典型的9+0型微管結(jié)構(gòu)，同時(shí)可清晰觀察到纖毛基部的軸絲和纖毛膜等結(jié)構(gòu)，在初級(jí)纖毛直徑與長(zhǎng)度等方面，本次觀察所得基本相符于全球其它研究人員的此類(lèi)觀察結(jié)果[17-18]，說(shuō)明本研究觀察到的纖毛樣結(jié)構(gòu)即為初級(jí)纖毛。

比較幾個(gè)時(shí)間點(diǎn)的小鼠胚胎腭突上皮細(xì)胞，與ED12.5胎鼠相比，在腭突表面初級(jí)纖毛量方面，ED13.5小鼠偏多，在此方面，ED14.5小鼠則相較ED13.5小鼠偏少，然而在長(zhǎng)度方面，則前者較長(zhǎng)，ED15.5小鼠腭突上皮細(xì)胞表面無(wú)纖毛結(jié)構(gòu)，同時(shí)絲狀偽足量大幅下降。基于ED12.5～14.5小鼠腭突生長(zhǎng)發(fā)育特征表現(xiàn)以及此部位上皮細(xì)胞內(nèi)各類(lèi)信號(hào)表達(dá)時(shí)間[19]，再結(jié)合外部環(huán)境可導(dǎo)致初級(jí)纖毛長(zhǎng)度改變的表現(xiàn)[20]，故推測(cè)隨著腭部發(fā)育中各種關(guān)鍵信號(hào)的表達(dá)和消失，初級(jí)纖毛隨之見(jiàn)規(guī)律性改變，同時(shí)其還同腭發(fā)育相關(guān)主要信號(hào)途徑有著顯著關(guān)聯(lián)性。

由此次研究，可明確ED12.5、ED13.5、ED14.5的小鼠腭突上皮細(xì)胞表面有初級(jí)纖毛分布，同時(shí)發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物所處發(fā)育期不同，此類(lèi)初級(jí)纖毛在數(shù)量與形態(tài)方面也隨之改變，為探究腭發(fā)育過(guò)程中諸如Shh此類(lèi)核心信號(hào)的傳遞，及對(duì)在胚胎腭部各發(fā)育期對(duì)應(yīng)的腭突表面超微結(jié)構(gòu)變化的分析，開(kāi)辟出新路徑。