韓璧瑤，穆 睿，朱 磊，于泓川，畢 博，劉 鵑，陳 博，榮 亮，王 玥，史小蕾，帥 逸，臧圣奇，金 磊

0 引 言

因疾病或外傷導(dǎo)致的牙體與頜面部骨缺損嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量，如何構(gòu)建牙體及骨組織再生治療體系，是再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域關(guān)注的熱點(diǎn)問(wèn)題。近年來(lái)，基因轉(zhuǎn)染的迅猛發(fā)展為組織工程與再生醫(yī)學(xué)提供了新的研究思路，基因轉(zhuǎn)染的關(guān)鍵在于細(xì)胞載體、目的基因以及傳遞目的基因載體的選擇。

人牙髓干細(xì)胞(human dental pulp stem cells，hDPSCs)因具有多向分化潛能、自我更新能力、低免疫原性及不會(huì)增加患者痛苦等優(yōu)點(diǎn)，不僅成為了牙體及骨組織再生領(lǐng)域的熱點(diǎn)種子細(xì)胞，同時(shí)還成為基因轉(zhuǎn)染優(yōu)良的細(xì)胞載體[1-3]。生長(zhǎng)因子是調(diào)控種子細(xì)胞分化的關(guān)鍵因素之一[4]，胰島素樣生長(zhǎng)因子-1(insulin-like growth factor-1，IGF-1)是牙體及骨組織修復(fù)的關(guān)鍵生長(zhǎng)因子[5]，可通過(guò)不同的信號(hào)通路調(diào)控hDPSCs等間充質(zhì)干細(xì)胞的成牙及成骨向分化[1,6]。然而目前大多數(shù)研究均采用外源性添加IGF-1蛋白直接誘導(dǎo)hDPSCs分化，該方法存在IGF-1蛋白生物半衰期短、反復(fù)及大劑量給藥易產(chǎn)生不良反應(yīng)、易被血液系統(tǒng)清除等問(wèn)題，因此其應(yīng)用受到了制約[7]?；蜣D(zhuǎn)染可靶向干預(yù)目的基因表達(dá)，且操作簡(jiǎn)便，克服了外源性蛋白誘導(dǎo)的諸多缺點(diǎn)，被視為具有前景的再生醫(yī)學(xué)研究手段。目前利用基因轉(zhuǎn)染靶向干預(yù)IGF-1表達(dá)，優(yōu)化hDPSCs體外礦化性能的相關(guān)研究報(bào)道較少。本研究提出利用基因轉(zhuǎn)染建立靶向調(diào)控IGF-1表達(dá)的hDPSCs模型，并探討其對(duì)hDPSCs體外礦化性能的影響，為牙體及骨組織再生的研究發(fā)展及臨床應(yīng)用提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑IGF-1過(guò)表達(dá)慢病毒載體(漢恒，中國(guó))，IGF-1低表達(dá)慢病毒載體(吉瑪，中國(guó))，IGF-1 Elisa試劑盒(四正柏，中國(guó))，IGF-1抗體和GAPDH抗體(Affinity，美國(guó))，牙本質(zhì)涎磷蛋白(dentin sialophospho protein, DSPP)抗體(博奧森，中國(guó))，骨鈣素抗體(Proteintech，中國(guó))，CCK-8試劑盒(諾唯贊，中國(guó))，ALP檢測(cè)試劑盒(碧云天，中國(guó))，茜素紅染液和CPC(Sigma，美國(guó))。

1.2方法

1.2.1 細(xì)胞分離培養(yǎng)及表型鑒定取新鮮第三磨牙分離牙髓，利用組織塊-酶消化法結(jié)合有限稀釋法分離、純化和擴(kuò)大培養(yǎng)hDPSCs。收集細(xì)胞后加入1 mL含3%FBS的PBS重懸，按1×105個(gè)細(xì)胞/管分裝至1.5 mL EP管中，加入熒光抗體，室溫避光孵育1 h，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.2.2克隆形成能力及多向分化能力檢測(cè)按200個(gè)細(xì)胞/孔接種于6孔板中，培養(yǎng)14 d后,加入1 mL 4%多聚甲醛固定30 min，洗滌后加入1 mL 0.1%甲苯胺藍(lán)避光染色20 min，細(xì)胞數(shù)量≥50個(gè)稱為一個(gè)集落形成單位。

按3×105個(gè)細(xì)胞/孔接種于6孔板中，融合度大約80%時(shí)，換用礦化誘導(dǎo)液或成脂誘導(dǎo)液，誘導(dǎo)21 d后，加入1 mL 4%多聚甲醛室溫固定30 min，PBS洗滌，礦化誘導(dǎo)加入2 mL茜素紅染液，成脂誘導(dǎo)加入2 mL油紅O染液，避光孵育10 min，鏡下觀察。

1.2.3細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染以2×105個(gè)細(xì)胞/孔接種至6孔板中，當(dāng)細(xì)胞匯合度約40%-50%時(shí)，分別加入過(guò)表達(dá)IGF-1慢病毒、低表達(dá)IGF-1慢病毒及對(duì)應(yīng)空載體。其中IGF-1過(guò)表達(dá)設(shè)置以下3組：hDPSCs-1組(hDPSCs未轉(zhuǎn)染)、Con-over組(hDPSCs轉(zhuǎn)染空載體)、IGF-1-over組(hDPSCs轉(zhuǎn)染過(guò)表達(dá)IGF-1慢病毒)。而IGF-1低表達(dá)設(shè)置以下3組：hDPSCs-2組(hDPSCs未轉(zhuǎn)染)、Con-inhibition組(hDPSCs轉(zhuǎn)染空載體)、IGF-1-inhibition組(hDPSCs轉(zhuǎn)染低表達(dá)IGF-1慢病毒)。

1.2.4qRT-PCR轉(zhuǎn)染7 d后，提取細(xì)胞內(nèi)RNA，按照產(chǎn)品說(shuō)明書去除DNA，逆轉(zhuǎn)錄，并挑選引物進(jìn)行qRT-PCR程序，引物序列為，IGF-1上游引物序列：5'-GCTCTTCAGTTCGTGTGTGG-3'；下游引物序列：5'-CGCAATACATGTCCAGCCTC-3'；DSPP上游引物序列：5'-TTTGGGCAGTAGCATGGGC-3'；下游引物序列：5'- CCATCTTGGGTATTCTCTTGCCT-3'；骨鈣素上游引物序列：5'-CCCAGGCGCTACCTGTATCAA-3'；下游引物序列：5'-GGTCAGCCAACTCGTCACAGTC-3'；GAPDH上游引物序列：5'-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3'；下游引物序列：5'-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3'。qRT-PCR程序反應(yīng)條件為預(yù)變性：95 ℃ 10 min；變性：95 ℃ 20 s；退火：60 ℃ 30 s延伸；72 ℃ 30 s，用2-ΔΔCt法計(jì)算mRNA相對(duì)表達(dá)量。

1.2.5Western blot轉(zhuǎn)染7 d后，提取細(xì)胞總蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度，配置SDS-PAGE凝膠，電泳，轉(zhuǎn)移蛋白至PVDF膜，5%的脫脂牛奶封閉1 h，4 ℃條件下一抗孵育過(guò)夜(8 h以上)，PBS洗滌，室溫條件下二抗孵育1 h，PBS洗滌，將PVDF膜浸入ECL發(fā)光液，顯影曝光。

1.2.6Elisa法第3、5、7天向上清液中加入100 μL 1 mol/L HCl，室溫孵育后加入100 μL 1 mol/L NaOH，再加入50 μL生物素化抗體工作液，室溫震蕩2 h，PBS洗滌，加入酶結(jié)合物工作液辣根過(guò)氧化酶，37 ℃孵育30 min，洗滌，加入顯色劑3,3',5,5'-四甲基聯(lián)苯胺，37 ℃孵育10 min，測(cè)定A450nm。

1.2.7CCK-8法第1、3、5、7、9天吸去細(xì)胞培養(yǎng)液，按體積比1∶10加入CCK-8和含10%FBS的α-MEM培養(yǎng)基，混勻，37 ℃孵育1 h，測(cè)定A450nm。

1.2.8ALP活性檢測(cè)第5、9天提取細(xì)胞總蛋白，空白對(duì)照孔加入緩沖液和底物，標(biāo)準(zhǔn)品孔加入標(biāo)準(zhǔn)品和緩沖液，樣品孔加入樣品和底物，37 ℃孵育30 min，測(cè)定A405nm。

1.2.9茜素紅染色及基質(zhì)鈣含量評(píng)估轉(zhuǎn)染第21天后，4%多聚甲醛固定30 min，PBS洗滌，茜素紅染液作用20 min，加入10 mmol/L CPC溶液，于搖床輕晃15 min，測(cè)定A562nm。

2 結(jié) 果

2.1 hDPSCs培養(yǎng)及鑒定hDPSCs細(xì)胞呈成纖維細(xì)胞樣，貼壁生長(zhǎng)；克隆集落染色可見藍(lán)染的克隆散在分布；成骨及成牙誘導(dǎo)分化茜素紅染色可見密集的紅染礦化結(jié)節(jié)；成脂誘導(dǎo)分化油紅O染色可見大量紅染的脂滴顆粒，見圖1。流式細(xì)胞儀顯示尖聳單峰，表明所培養(yǎng)細(xì)胞具有良好的同質(zhì)性，且陽(yáng)性表達(dá)CD29、CD90、CD105、CD146及STRO-1，陰性表達(dá)CD34和CD45，見圖2。均符合hDPSCs的生物學(xué)特征，證明已成功分離培養(yǎng)hDPSCs。

2.2IGF-1基因水平驗(yàn)證與hDPSCs-1組、Con-over組IGF-1基因表達(dá)量(0.96±0.04、0.82±0.59)比較，IGF-1-over組(14.07±0.25)顯著升高(P<0.01)。與hDPSCs-2組、Con-inhibition組IGF-1基因表達(dá)量(0.96±0.04、1.02±0.05)比較，IGF-1-inhibition組(0.06±0.01)顯著降低(P<0.01)。

2.3IGF-1蛋白水平驗(yàn)證hDPSCs-1組與Con-over組IGF-1表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，IGF-1-over組的IGF-1蛋白表達(dá)顯著高于hDPSCs-1組、Con-over組(P<0.01)。hDPSCs-2組與Con-inhibition組IGF-1表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，IGF-1-inhibition組的IGF-1蛋白表達(dá)顯著低于hDPSCs-2組、Con-inhibition組(P<0.01)，見圖3、圖4。

a：細(xì)胞形態(tài)； b：克隆集落染色 ； c：茜素紅染色； d：脂滴染色

圖 2 流式細(xì)胞儀鑒定細(xì)胞表面標(biāo)記

1:hDPSCs-1組;2:Con-over組;3:IGF-1-over組;4：hDPSCs-2組；5:Con-inhibition組;6：IGF-1-inhibition組

1:hDPSCs-1組;2:Con-over組;3:IGF-1-over組;4：hDPSCs-2組；5:Con-inhibition組;6：IGF-1-inhibition組

2.4IGF-1分泌水平驗(yàn)證轉(zhuǎn)染第3、5、7天后，IGF-1-over組IGF-1分泌量較hDPSCs-1組、Con-over組明顯升高(P<0.01)。轉(zhuǎn)染第3、5、7天后，IGF-1-inhibition組IGF-1分泌量較hDPSCs-2組、Con-inhibition組明顯下降(P<0.01)，見表1。

表 1 不同組別各時(shí)間點(diǎn)IGF-1分泌蛋白表達(dá)的比較

2.5hDPSCs增殖能力檢測(cè)hDPSCs-1組、Con-over組與IGF-1-over組增殖速度基本一致，各時(shí)間點(diǎn)組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。hDPSCs-2組、Con-inhibition組與IGF-1-inhibition組間各時(shí)間點(diǎn)增殖速度差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見圖5。

2.6ALP活性檢測(cè)第5天，hDPSCs-1組、Con-over組與IGF-1-over組ALP活性差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；第9天，與hDPSCs-1組、Con-over組ALP活性比較，IGF-1-over組顯著升高(P<0.05)。第5天，IGF-1-inhibition組ALP活性較hDPSCs-2組明顯升高(P<0.05)，見表2。

2.7礦化結(jié)節(jié)形成及基質(zhì)鈣含量檢測(cè)與hDPSCs-1組、Con-over組比較，IGF-1-over組可產(chǎn)生更多礦化結(jié)節(jié)，染色程度更深，基質(zhì)鈣含量更高(P<0.01)。hDPSCs-2組、Con-inhibition組與IGF-1-inhibition組茜素紅染色及基質(zhì)鈣含量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見圖6、圖7。

圖 5 細(xì)胞增殖能力變化

表 2 不同組別各時(shí)間點(diǎn)的ALP活性變化

a:hDPSCs-1組;b:Con-over組;c:IGF-1-over組;d：hDPSCs-2組；e:Con-inhibition組;f：IGF-1-inhibition組

1:hDPSCs-1組;2:Con-over組;3:IGF-1-over組;4：hDPSCs-2組；5:Con-inhibition組;6：IGF-1-inhibition組

2.8qRT-PCR和Western blot分別檢測(cè)DSPP和骨鈣素的mRNA和蛋白表達(dá)IGF-1-over組DSPP基因、蛋白的表達(dá)較hDPSCs-1組、Con-over組顯著升高(P<0.01)，骨鈣素表達(dá)亦升高(P<0.05)。IGF-1-inhibition組DSPP基因、蛋白的表達(dá)較hDPSCs-2組、Con-inhibition組顯著降低(P<0.01)，骨鈣素蛋白表達(dá)亦降低(P<0.05)，見表3，圖8、表4。

表 3 不同組別hDPSCs礦化相關(guān)基因表達(dá)的比較

1:hDPSCs-1組;2:Con-over組;3:IGF-1-over組;4：hDPSCs-2組；5:Con-inhibition組;6：IGF-1-inhibition組

表 4 不同組別hDPSCs礦化相關(guān)蛋白相對(duì)表達(dá)量的比較

3 討 論

本研究旨在利用基因轉(zhuǎn)染優(yōu)化hDPSCs體外成牙及成骨分化潛能，為牙體及骨組織再生提供新的調(diào)控策略?；蜣D(zhuǎn)染技術(shù)首要考慮的問(wèn)題是選擇安全高效的傳遞目的基因的載體。目前，基因傳遞載體主要包括兩類，一類是非病毒載體，轉(zhuǎn)染效率較低；另一類是病毒載體，其中γ-逆轉(zhuǎn)錄病毒有誘導(dǎo)細(xì)胞免疫反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)，并且無(wú)法短時(shí)間內(nèi)制備高滴度病毒；腺病毒僅可介導(dǎo)目的基因瞬時(shí)表達(dá)；腺相關(guān)病毒則存在攜帶基因片段過(guò)小和復(fù)制缺陷的問(wèn)題，這些問(wèn)題均限制了上述載體的廣泛應(yīng)用；而慢病毒不僅可介導(dǎo)基因持續(xù)表達(dá)，還可轉(zhuǎn)染靜止細(xì)胞與分裂細(xì)胞，其安全性高，便于操控，近年來(lái)廣泛應(yīng)用于各類疾病的研究中[8-9]?；诼《镜膬?yōu)越性，本研究選擇其作為IGF-1基因轉(zhuǎn)染的載體。

Lin等[10]用介導(dǎo)IGF-1的慢病毒轉(zhuǎn)染骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow stem cells，BMSCs)，可顯著上調(diào)培養(yǎng)基中IGF-1含量。Zhang等[11]利用低表達(dá)環(huán)氧合酶-1、聚蛋白多糖酶同時(shí)過(guò)表達(dá)hIGF-1的慢病毒轉(zhuǎn)染BMSCs，發(fā)現(xiàn)空白對(duì)照組與空載體組組間環(huán)氧合酶-1、聚蛋白多糖酶及IGF-1表達(dá)無(wú)顯著差異，而慢病毒轉(zhuǎn)染組環(huán)氧合酶-1、聚蛋白多糖酶表達(dá)降低，IGF-1表達(dá)升高，促進(jìn)食蟹猴磨損的膝關(guān)節(jié)軟骨的修復(fù)；BMSCs具有多向分化潛能，是牙體及骨組織再生中常用的種子細(xì)胞，但創(chuàng)傷大、細(xì)胞獲取過(guò)程痛苦[12]；hDPSCs具備低免疫原性及不會(huì)增加患者痛苦等優(yōu)勢(shì)，因此本研究選擇hDPSCs作為基因轉(zhuǎn)染的細(xì)胞載體，然而過(guò)表達(dá)和低表達(dá)IGF-1慢病毒載體能否成功整合至hDPSCs基因組中，并干預(yù)其表達(dá)、合成IGF-1基因和蛋白能力目前尚不清楚。本研究利用qRT-PCR、Western blot評(píng)估IGF-1的基因、細(xì)胞內(nèi)蛋白表達(dá)水平，同時(shí)由于hDPSCs通過(guò)分泌IGF-1激活I(lǐng)GF-1R下游信號(hào)通路，調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)和功能，因此同時(shí)采用Elisa檢測(cè)IGF-1蛋白分泌水平的變化[13-14]，以明確IGF-1慢病毒轉(zhuǎn)染hDPSCs的效果。本研究結(jié)果表明過(guò)表達(dá)IGF-1慢病毒轉(zhuǎn)染hDPSCs可上調(diào)hDPSCs中IGF-1表達(dá)，低表達(dá)IGF-1慢病毒轉(zhuǎn)染hDPSCs可下調(diào)hDPSCs中IGF-1表達(dá)，克服了外源性蛋白刺激半衰期短及易被血液系統(tǒng)清除等缺點(diǎn)。

本研究結(jié)果表明，過(guò)表達(dá)IGF-1慢病毒轉(zhuǎn)染hDPSCs后不影響其增殖能力。相較于hDPSCs-1組與Con-over組，IGF-over組ALP活性、鈣化結(jié)節(jié)茜素紅著色程度、基質(zhì)鈣含量以及DSPP和骨鈣素的基因、蛋白表達(dá)均顯著升高，提示過(guò)表達(dá)IGF-1慢病毒轉(zhuǎn)染可增強(qiáng)hDPSCs的成牙及成骨分化能力。Xing等[15]將轉(zhuǎn)染IGF-1的BMSCs移植至糖尿病鼠骨折處，發(fā)現(xiàn)形成的骨痂中IGF-1含量顯著上調(diào)，且血清中IGF-1含量至第7周仍保持高濃度，顯著促進(jìn)骨折部位愈合。Frisch等[16]也發(fā)現(xiàn)相較于使用IGF-1蛋白，體外轉(zhuǎn)導(dǎo)IGF-1基因可使人間充質(zhì)干細(xì)胞持續(xù)高效合成IGF-1，改善其成軟骨效果。本研究結(jié)果與上述研究結(jié)果類似。

本研究結(jié)果表明，低表達(dá)IGF-1慢病毒轉(zhuǎn)染hDPSCs后不影響其增殖能力。隨著IGF-1基因及蛋白的下調(diào)，相較于hDPSCs-2組與Con-inhibition組，IGF-inhibition組DSPP和骨鈣素的表達(dá)均顯著降低，說(shuō)明低表達(dá)IGF-1慢病毒可負(fù)向調(diào)控hDPSCs成牙及成骨能力。對(duì)于ALP活性、茜素紅染色和基質(zhì)鈣含量未見顯著差異的現(xiàn)象，可能由于誘導(dǎo)hDPSCs成牙及成骨分化的生物活性分子眾多，包括轉(zhuǎn)錄因子、受體分子以及組織特異性蛋白等，各因子相互作用及對(duì)hDPSCs產(chǎn)生的調(diào)控作用代償了DSPP、骨鈣素對(duì)hDPSCs分化的影響，從而導(dǎo)致低表達(dá)IGF-1慢病毒轉(zhuǎn)染對(duì)hDPSCs成骨表型的影響未能體現(xiàn)出來(lái)。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)慢病毒轉(zhuǎn)染可有效干預(yù)hDPSCs中IGF-1的表達(dá)，克服了外源性IGF-1蛋白直接誘導(dǎo)存在的蛋白生物半衰期短等問(wèn)題；過(guò)表達(dá)IGF-1慢病毒轉(zhuǎn)染可增強(qiáng)hDPSCs的成牙及成骨向分化能力，低表達(dá)IGF-1慢病毒轉(zhuǎn)染可抑制hDPSCs的成牙及成骨向分化能力，為牙體及骨組織缺損提供了新的研究思路。