黃菲?肖翠翠?王敏學(xué)?周少麗

【摘要】目的 探討細(xì)胞縫隙連接（GJ）信號(hào)傳遞對(duì)肝缺血再灌注損傷（HIRI）及細(xì)胞凋亡的影響。方法 C57BL/6小鼠建立HIRI模型，隨機(jī)分為假手術(shù)組（Sham組）、HIRI組、HIRI+2-氨基乙基聯(lián)苯基硼酸酯（2APB）組、HIRI+維甲酸（RA）組。HIRI+2APB組及HIRI+RA組在造模前腹腔注射2APB或RA。采用HE染色觀察肝組織病理損傷情況，生化檢測血清ALT和AST評(píng)估肝功能情況，蛋白免疫印跡法檢測凋亡相關(guān)蛋白Bim、Bax、Caspase-3的表達(dá)，TUNEL法檢測肝組織細(xì)胞凋亡情況。結(jié)果 與HIRI組相比，HIRI+RA組肝損傷及凋亡明顯增加，Bim介導(dǎo)的凋亡蛋白表達(dá)增強(qiáng)（P均< 0.05）;相反，HIRI+2APB組可顯著減輕肝損傷及細(xì)胞凋亡，并減少Bim介導(dǎo)的凋亡蛋白表達(dá)（P均< 0.05）。結(jié)論 GJ傳遞傷害性信號(hào)可能在HIRI進(jìn)展中發(fā)揮重要作用。

【關(guān)鍵詞】肝缺血再灌注損傷;凋亡;縫隙連接

Gap junction-mediated harmful signal transmission contributes to liver injury and cell apoptosis after hepatic ischemia-reperfusion Huang Fei， Xiao Cuicui，Wang Minxue， Zhou Shaoli. Department of Anesthesiology， the Third Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University， Guangzhou 510630， China

Corresponding author， Zhou Shaoli， E-mail： 6216833@ qq. com

【Abstract】Objective To evaluate the effect of gap junction （GJ）-mediated signal transmission on liver injury and cell apoptosis after hepatic ischemia reperfusion （HIRI）. Methods C57BL/6 mouse models of HIRI were established. All animals were randomly divided into the sham operation group （Sham group）， HIRI group， HIRI+2-aminoethyldiphenyl borate （2APB） group and HIRI+retinoic acid （RA） group， respectively. In the HIRI+2APB and HIRI+RA groups， the animals were intraperitoneally injected with 2APB or RA before the establishment of HIRI models. The pathological injury of liver tissues was observed by HE staining. The liver function was evaluated by biochemical detection of serum ALT and AST levels. The expression levels of apoptosis-related proteins， such as Bim， Bax and Caspase-3 in liver tissues was quantitatively measured by Western blot. The cell apoptosis of liver tissues was detected by TUNEL assay. Results Compared with the HIRI group，the liver injury induced by HIRI and the cell apoptosis were aggravated and the expression level of Bim-mediated apoptosis-related protein was remarkably up-regulated in the HIRI+RA group （all P < 0.05）. In the HIRI+2APB group， hepatic injury and cell apoptosis were significantly alleviated and the expression level of Bim-mediated apoptosis-related protein was remarkably down-regulated （all P < 0.05）. Conclusion The harmful signal transmitted by GJ may play an important role in the development of HIRI-induced liver injury.

【Key words】Hepatic ischemia reperfusion injury;Apoptosis;Gap junction

肝缺血再灌注損傷（HIRI）常見于肝移植、肝部分切除術(shù)、失血性休克等諸多過程中，可引起肝功能不全、肝衰竭甚至多器官功能衰竭。據(jù)報(bào)道，肝部分切除術(shù)后肝功能不全發(fā)生率約9.5%，是術(shù)后患者恢復(fù)延遲和死亡的主要原因[1]。HIRI機(jī)制復(fù)雜并具有多元化特點(diǎn)，目前尚未完全闡明。目前研究認(rèn)為凋亡是肝缺血再灌注后早期肝損傷的主要形式[2]。Bcl-2家族在凋亡的調(diào)控中起著關(guān)鍵作用， 促凋亡蛋白Bim是近年來發(fā)現(xiàn)的Bcl-2家族中BH3-only亞家族的一員，也叫前凋亡蛋白，它是凋亡執(zhí)行所必需的上游調(diào)節(jié)因子[3]。

細(xì)胞縫隙連接（GJ）是細(xì)胞間直接聯(lián)系通道，允許分子量小于1 KDa的物質(zhì)在相鄰細(xì)胞間雙向性流動(dòng)。GJ的信號(hào)傳遞在維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定和器官功能、調(diào)控細(xì)胞生長發(fā)育等過程中扮演重要角色[4]。GJ介導(dǎo)“旁細(xì)胞效應(yīng)”被很多科學(xué)家形象地將其稱為“死亡之吻”，并受到了科研界的廣泛關(guān)注，因?yàn)檫@使對(duì)繼發(fā)損傷程度的限制成為可能[5]。肝細(xì)胞間的GJ十分豐富，肝細(xì)胞主要表達(dá)Cx32和少量的Cx26，GJ發(fā)揮著重要的生理功能[6]。我們團(tuán)隊(duì)前期體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)BRL-3A肝細(xì)胞凋亡與Cx32組成的GJ通訊增強(qiáng)有關(guān)[7]。因此我們提出假設(shè)：Cx32組成的GJ傳遞傷害性信號(hào)可能加重HIRI。本研究旨在初步探討Cx32組成的GJ在HIRI中的作用，為以GJ為靶點(diǎn)早期干預(yù)肝損傷進(jìn)展提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

材料與方法

一、材 料

SPF級(jí)健康雄性C57BL/6小鼠28只（8 ～ 10周，20 ～ 25 g）購于廣東省動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心;2-氨基乙基聯(lián)苯基硼酸酯（2APB）及維甲酸（RA，Sigma，美國）;Bim、Bax、Caspase-3單克隆抗體（Invitrogen，美國）;HRP標(biāo)記的兔抗小鼠IgG抗體（Sigma，美國）;TUNEL檢測試劑盒（Roche，美國）。

二、方 法

1. 70%小鼠HIRI模型

本研究中所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均通過中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。根據(jù)我們既往經(jīng)驗(yàn)，按照我們既往發(fā)表文獻(xiàn)[8]的方法建立小鼠70%肝缺血再灌注模型。具體操作步驟如下：①術(shù)前常規(guī)禁食8 h，自由飲水;②氯胺酮（60 mg/kg）

復(fù)合甲苯噻嗪（100 mg/kg）復(fù)合液腹腔注射進(jìn)行麻醉;③手術(shù)取仰臥位，腹部備皮、消毒后腹部正中切口入腹;④進(jìn)入腹腔后仔細(xì)游離進(jìn)入肝左葉和肝中葉的血管;⑤使用無損傷的微血管夾阻斷供應(yīng)上述兩個(gè)肝葉（缺血肝葉）的動(dòng)脈和靜脈，并保留供應(yīng)肝臟尾狀葉、右葉、乳頭狀葉及方葉的血流防止腸靜脈充血;⑥缺血期間腹部傷口以濕潤紗布覆蓋，在進(jìn)行60 min缺血后（觀察缺血肝葉的顏色變化，顏色變灰白證明缺血成功），小心松開微血管夾，開始進(jìn)行再灌注（再灌注后缺血肝葉顏色變化粗略判斷再灌注成功）。仔細(xì)止血后，連續(xù)全層縫合腹壁切口關(guān)腹。實(shí)驗(yàn)過程中注意實(shí)驗(yàn)室的溫度控制在30℃左右，并盡量減少出血。

2.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組

實(shí)驗(yàn)選取SPF級(jí)健康雄性野生型C57BL/6小鼠28只，隨機(jī)分為假手術(shù)組（Sham組）、HIRI組、肝缺血再灌注+縫隙連接抑制劑（2APB）預(yù)處理組（HIRI+2APB組）、肝缺血再灌注+縫隙連接增強(qiáng)劑（RA）預(yù)處理組（HIRI+RA組）。假手術(shù)組在麻醉后只進(jìn)行腹腔開腹和血管的分離，不進(jìn)行肝臟的阻斷和灌注。HIRI+2APB組及HIRI+RA組在造模前腹腔注射2APB（20 mg/kg，0.5 ml）或RA（10 mg/kg，0.5 ml）。

3. 標(biāo)本的采集和處理

各組在肝臟再灌注后6 h采集標(biāo)本。再次麻醉小鼠，并從下腔靜脈取血0.5 ～ 1.0 ml，以1500轉(zhuǎn)/分

的速度離心后提取上清液，分裝注入已編號(hào)標(biāo)記好的EP管中，置入-20℃冰箱保存，用于后續(xù)的肝功能生化檢測。收集缺血肝葉，部分肝組織用4%多聚甲醛溶液固定24 h，常規(guī)石蠟包埋、切片，HE染色，用于肝組織病理學(xué)檢測;剩余肝組織放入凍存管后立即置入液氮中保存，并在實(shí)驗(yàn)完畢后迅速轉(zhuǎn)運(yùn)置入-80℃深低溫冰箱進(jìn)一步保存，用于后續(xù)的肝組織相關(guān)蛋白檢測。

4. 肝損傷病理學(xué)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

選取切片平整、組織細(xì)胞形態(tài)和結(jié)構(gòu)清晰的HE染色組織切片進(jìn)行光鏡下觀察和分析。參照Suzuki評(píng)分法對(duì)肝損傷程度進(jìn)行病理學(xué)評(píng)分，具體評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)如下：0分，無損傷， 肝實(shí)質(zhì)與間質(zhì)正常;1分，輕微病變，肝竇間隙輕微充血，很少空泡形成及單個(gè)肝細(xì)胞壞死;2分，肝竇間隙輕度充血，少數(shù)空泡形成，小于30%的肝細(xì)胞壞死;3 分，中度損傷，肝竇間隙中度度充血，中度空泡形成，約30% ～ 60%的肝細(xì)胞壞死;4分，嚴(yán)重?fù)p傷，肝竇間隙嚴(yán)重充血，重度空泡形成，超過60%的肝細(xì)胞壞死[9]。

5. 蛋白免疫印跡法檢測蛋白表達(dá)

取缺血肝葉肝組織冰浴中充分勻漿（加入裂解液），于4℃、12 000轉(zhuǎn)/分離心30 min，二辛可寧酸（BCA）法蛋白定量，每份樣品各取25 μg蛋白質(zhì)。配膠、電泳，轉(zhuǎn)膜后封閉2 h，加入β-actin（兔抗小鼠，1∶3000）、Cx32（兔抗小鼠，1∶1000）、Bim（兔抗小鼠，1∶1000）、Bcl-2（兔抗小鼠，1∶1000）、Caspase-3（兔抗小鼠，1∶1000）一抗，4℃搖床孵育過夜，磷酸鹽緩沖液（PBS）洗膜3次，每次10 min。加入辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的山羊抗兔IgG? （1∶5000）? 室溫?fù)u床孵育后PBS洗膜，暗室中曝光、顯影，采用Image J軟件檢測β-actin及目的蛋白條帶的灰度值，以目的蛋白條帶灰度值/β-actin蛋白條帶灰度值作為目的蛋白表達(dá)量。將3張以上條帶灰度值平均值作為本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

6. TUNEL法檢測肝組織細(xì)胞凋亡

厚度3 μm的組織切片37℃溫箱烘烤過夜→脫蠟及水化→3%的雙氧水甲醇溶液37℃恒溫箱孵育10 min（TBS洗3次，每次5 min）→蛋白酶K滲透，37℃恒溫箱孵育10 min（TBS洗3次，每次5 min）→滴加標(biāo)記緩沖液，37℃恒溫箱孵育2 h

（TBS 洗3次，每次5 min）→封閉液封閉，室溫孵育30 min→滴加TUNEL反應(yīng)液到組織上，37℃恒溫箱孵育30 min（TBS洗3次，每次5 min）→滴加POD轉(zhuǎn)化劑到組織上，37℃恒溫箱孵育30 min（TBS洗3次，每次5 min）→DAB顯色→蘇木素復(fù)染細(xì)胞核90 s，充分水洗、脫水、透明及中性樹脂封片→數(shù)據(jù)分析。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用Sigmaplot 10.0分析數(shù)據(jù)。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

一、肝損傷及評(píng)分

我們?cè)诠忡R下觀察肝組織HE染色切片，結(jié)果顯示，假手術(shù)Sham組肝組織形態(tài)和結(jié)構(gòu)基本正常，未見明顯肝竇充血和肝細(xì)胞壞死;肝缺血6 h后（HIRI組）肝組織病理損傷嚴(yán)重，可見肝竇明顯充血，肝細(xì)胞腫脹、空泡形成，炎性細(xì)胞浸潤，并出現(xiàn)片狀壞死，見圖1A。各組Suzuki評(píng)分在統(tǒng)計(jì)學(xué)上存在差異（F = 54.33，P < 0.05）。與HIRI組相比，HIRI+RA組小鼠肝組織病理學(xué)損傷進(jìn)一步加重，壞死區(qū)域面積擴(kuò)大，Suzuki評(píng)分升高（P < 0.05）。相反，與HIRI組相比，HIRI+2APB組小鼠肝組織病理學(xué)損傷明顯減輕，肝竇充血和肝細(xì)胞腫脹減少，壞死區(qū)域面積縮小，Suzuki評(píng)分有所降低（P < 0.05），表現(xiàn)出肝損傷的好轉(zhuǎn)，見圖1B。

二、肝功能情況

各組小鼠血清ALT和AST水平存在差異（F值分別為147.9和86.05，P 均< 0.05）。與Sham組相比，HIRI組小鼠血清ALT水平升高（P < 0.05），提示存在明顯的肝細(xì)胞損傷;與HIRI組相比，HIRI+RA組小鼠血清ALT水平進(jìn)一步升高（P < 0.05），提示肝細(xì)胞損傷進(jìn)一步加重;相反，HIRI+2APB組ALT水平下降（P < 0.05），表現(xiàn)出肝功能的保護(hù)作用，見圖1C。各組小鼠血清AST水平變化與ALT呈現(xiàn)相同的趨勢，見圖1D。

三、肝組織中凋亡相關(guān)蛋白Bim、Bax、Caspase-3表達(dá)

各組小鼠肝組織Bim、Bax和Caspase-3蛋白表達(dá)存在差異（F值分別為63.15、36.61和35.65，P 均< 0.05）。與Sham組相比，HIRI組小鼠肝組織Bim、Bax、Caspase-3蛋白表達(dá)上調(diào)（P 均< 0.05），與HIRI組相比，HIRI+RA組Bim、Bax和Caspase-3蛋白表達(dá)進(jìn)一步上調(diào)（P均< 0.05），相反，HIRI+2APB組上述蛋白表達(dá)有所下降（P均< 0.05），見圖2。

四、肝組織中細(xì)胞凋亡情況

與Sham組相比，HIRI組小鼠肝組織細(xì)胞凋亡明顯增加;與HIRI組相比，HIRI+RA組細(xì)胞凋亡進(jìn)一步增加;相反，HIRI+2APB組細(xì)胞凋亡明顯減少，見圖3。

討論

本研究所使用的模型為70%HIRI模型，這是目前非常成熟的非致命性肝臟熱缺血再灌注損傷模型，國內(nèi)外大量研究均以此模型來模擬肝臟缺血再灌注過程而進(jìn)行HIRI方面的研究[10]。我們團(tuán)隊(duì)前期研究觀察了C57BL/6小鼠肝缺血1 h后不同時(shí)間點(diǎn)肝損傷情況的動(dòng)態(tài)變化，發(fā)現(xiàn)再灌注6 h肝損傷最重[11]。據(jù)此，我們?cè)诒敬窝芯恐?，采用肝缺? h再灌注6 h作為模型。

肝組織細(xì)胞中的GJ十分豐富，其中Cx32是肝臟中表達(dá)最多的Cx蛋白，占肝組織Cx蛋白總量的90%以上[12]。本研究結(jié)果顯示，使用GJ增強(qiáng)劑可加重肝損傷及細(xì)胞凋亡，相反，使用GJ抑制劑可明顯減輕肝損傷和細(xì)胞凋亡，提示在HIRI過程中，GJ可能傳遞傷害性信號(hào)放大損傷和凋亡。那么，究竟是哪一種Cx蛋白組成的GJ發(fā)揮的作用呢？目前認(rèn)為，2APB是Cx32特異性的GJ抑制劑，只對(duì)Cx32組成的GJ功能有抑制作用，對(duì)其他Cx蛋白組成的GJ無影響，那么，我們的結(jié)果提示Cx32組成的GJ在此過程中可能發(fā)揮了重要作用[13]。

在細(xì)胞凋亡的進(jìn)程中， 有兩個(gè)家族的蛋白質(zhì)起到非常重要的作用：Caspase家族是凋亡的執(zhí)行者，而Bcl-2家族則為凋亡的決策者。Bcl-2家族又分為抗凋亡的Bcl-2亞家族及促凋亡的Bax和BH3-only亞家族。BH3-only亞家族被認(rèn)為是Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)的啟動(dòng)者[14]。在BH3-only亞家族成員中，Bim是目前已知最重要的促凋亡因子，因?yàn)樗粌H可激活多種Bcl-2家族的促凋亡蛋白，還可與該家族中幾乎所有抗凋亡蛋白結(jié)合抑制其作用[15]。有學(xué)者報(bào)道，Bim在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡中扮演不可或缺的哨兵角色，是上游死亡信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)和下游Bax/Bak依賴的線粒體凋亡程序的連接者[16]。在造血細(xì)胞、腎臟上皮細(xì)胞、黑素細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、干細(xì)胞以及自身免疫性胸腺細(xì)胞中的研究證明，Bim是凋亡最關(guān)鍵的始動(dòng)因子，在其凋亡過程中必不可少[17-18]。本研究結(jié)果顯示，通過GJ工具藥改變GJ功能可以明顯影響B(tài)im及下游凋亡蛋白Bax的表達(dá)，提示GJ參與Bim介導(dǎo)的凋亡，但GJ究竟傳遞何種信號(hào)，通過何種途徑促進(jìn)Bim表達(dá)，還需要進(jìn)一步的研究。

本實(shí)驗(yàn)證實(shí)了改變GJ功能可以明顯影響HIRI程度和細(xì)胞凋亡數(shù)量，并改變Bim介導(dǎo)的凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)，其機(jī)制可能與GJ傳遞傷害性信號(hào)有關(guān)，但此傷害性信號(hào)的性質(zhì)尚不清楚，值得深入研究，為以GJ為靶點(diǎn)，減輕HIRI提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

參 考 文 獻(xiàn)

[1] 彭娜，王彥峰，何維陽，李明霞，胡曉燕，葉啟發(fā).肝移植供肝缺血再灌注損傷的研究進(jìn)展.中華肝膽外科雜志，2016，22（5）：349-351.

[2] 王冰，林穎，劉慧玲，金海，汪根樹，吳斌，陳規(guī)劃.己酮可可堿對(duì)大鼠肝臟缺血再灌注損傷的影響.新醫(yī)學(xué)，2011，42（8）：601-604.

[3] Sionov RV， Vlahopoulos SA， Granot Z. Regulation of bim in health and disease. Oncotarget，2015，6（27）：23058-23134.

[4] Maes M， Crespo Yanguas S， Willebrords J， Cogliati B， Vinken M. Connexin and pannexin signaling in gastrointestinal and liver disease. Transl Res，2015，166（4）：332-343.

[5] Suzuki M. Significance of radiation-induced bystander effects in radiation therapy. Igaku Butsuri，2014，34（2）：70-78.

[6] Patel SJ， Milwid JM， King KR， Bohr S， Iracheta-Vellve A， Li M， Vitalo A， Parekkadan B， Jindal R， Yarmush ML. Gap junction inhibition prevents drug-induced liver toxicity and fulminant hepatic failure. Nat Biotechnol， 2012，30（2）：179-183.

[7] Wang R， Huang F， Chen Z， Li S. Downregulation of connexin 32 attenuates hypoxia/reoxygenation injury in liver cells. J Biochem Mol Toxicol，2015，29（4）：189-197.

[8] Ge M， Yao W， Wang Y， Yuan D， Chi X， Luo G， Hei Z. Propofol alleviates liver oxidative stress via activating Nrf2 pat-hway. J Surg Res，2015，196（2）：373-381.

[9] Zhang Y， Yuan D， Yao W， Zhu Q， Liu Y， Huang F， Feng J， Chen X， Huang Y， Chi X， Hei Z. Hyperglycemia aggravates hepatic ischemia reperfusion injury by inducing chronic oxidative stress and inflammation. Oxid Med Cell Longev，2016，2016：3919627.

[10] 黑子清.肝移植圍術(shù)期器官損傷機(jī)制及器官保護(hù)策略研究進(jìn)展.中山大學(xué)學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)版），2019，40（4）：488-492.

[11] Wu S， Yao W， Chen C， Chen H， Huang F， Liu Y， Cai J， Yuan D， Hei Z. Connexin 32 deficiency protects the liver against ischemia/reperfusion injury. Eur J Pharmacol，2020，876：173056.

[12] Masia R， Diagacomo E， Adams D， King KR， Piaker S， Reinecker HC， Yarmush ML， Argemi J， Bataller R， Dienstag JL， Chung RT， Patel SJ. Hepatic gap junctions amplify alcohol liver injury by propagating cGAS-mediated IRF3 activation. Proc Natl Acad Sci USA，2020，117（21）：11667-11673.

[13] Bai D， del Corsso C， Srinivas M， Spray DC. Block of specific gap junction channel subtypes by 2-aminoethoxydiphenyl borate （2-APB）. J Pharmacol Exp Ther，2006，319（3）：1452-1458.

[14] Huang K， O'Neill KL， Li J， Zhou W， Han N， Pang X， Wu W， Struble L， Borgstahl G， Liu Z， Zhang L， Luo X. BH3-only proteins target BCL-xL/MCL-1， not BAX/BAK， to initiate apoptosis. Cell Res，2019，29（11）：942-952.

[15] Frank DO， Dengjel J， Wilfling F， Kozjak-Pavlovic V， H?cker G， Weber A. The pro-apoptotic BH3-only protein Bim interacts with components of the translocase of the outer mitochondrial membrane （TOM）. PLoS One，2015，10（4）：e0123341.

[16] Huang DC， Strasser A. BH3-Only proteins-essential initiators of apoptotic cell death. Cell，2000，103（6）：839-842.

[17] Shukla S， Saxena S， Singh BK， Kakkar P. BH3-only protein BIM： an emerging target in chemotherapy. Eur J Cell Biol，2017，96（8）：728-738.

[18] Qian G， Yao W， Zhang S， Bajpai R， Hall WD， Shanmugam M， Lonial S， Sun SY. Co-inhibition of BET and proteasome enhances ER stress and Bim-dependent apoptosis with augmented cancer therapeutic efficacy. Cancer Lett，2018，435：44-54.

（收稿日期：2020-06-18）

（本文編輯：楊江瑜）