孫誠?程霽云?黃馬燕

【摘要】目的 探索骨髓間充質(zhì)干細胞外泌體對神經(jīng)軸突再生的影響規(guī)律。方法 提取SD大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞并通過細胞形態(tài)及流式細胞學(xué)進行鑒定，利用超速離心法提取細胞上清液中的外泌體并通過透射電鏡、粒徑及蛋白免疫印跡法進行鑒定。培養(yǎng)腎上腺嗜鉻細胞瘤（PC12）細胞及提取SD大鼠原代神經(jīng)干細胞。將PC12細胞分為空白對照組、30 μg外泌體組及60 μg外泌體組。通過熒光標記大鼠外泌體觀察靶細胞吞噬情況。采用免疫熒光染色檢測PC12細胞及神經(jīng)干細胞軸突生長情況，通過蛋白免疫印跡法檢測細胞神經(jīng)絲蛋白（NF-200）和生長相關(guān)蛋白（GAP-43）的表達水平。結(jié)果 細胞形態(tài)及流式細胞學(xué)證實成功提取出大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞，透射電鏡、粒徑及蛋白免疫印跡法檢查證實成功提取出骨髓間充質(zhì)干細胞外泌體，外泌體可以被神經(jīng)細胞攝取促進PC12細胞及神經(jīng)干細胞軸突生長及軸突蛋白表達，并且這一促進作用隨著外泌體量的增加而增強，3組PC12細胞及神經(jīng)干細胞軸突長度及軸突蛋白表達比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P均 < 0.001）。結(jié)論 骨髓間充質(zhì)干細胞外泌體可通過促進神經(jīng)軸突再生進而發(fā)揮神經(jīng)損傷修復(fù)作用。

【關(guān)鍵詞】脊髓損傷;骨髓間充質(zhì)干細胞;外泌體;軸突再生

Exosomes treat nerve injury diseases by promoting nerve axon regeneration Sun Cheng， Cheng Jiyun， Huang Mayan. The Second Peoples Hospital of Mengcheng County， Haozhou 233500， China

Corresponding author， Huang Mayan， E-mail： huangmy@ sysucc. org. cn

【Abstract】Objective To explore the effect of bone marrow mesenchymal stem cell exosomes on the regeneration of nerve axon. Methods Sprague Dawley （SD） rat bone marrow mesenchymal stem cells were extracted and identified by cell morphology and flow cytometry. Exosomes in the cell supernatant were extracted by ultracentrifugation and identified by transmission electron microscopy， particle size and Western blot. PC12 cells and neural stem cells extracted from SD rats were cultured. PC12 cells were divided into the blank control， 30 μg exosome and 60 μg exosome groups. The phagocytosis of target cells was observed by fluorescently-labelled rat exosomes. The axon growth of PC12 cells and neural stem cells was observed by immunofluorescent staining. The expression levels of NF-200 and GAP43 proteins were detected by Western blot. Results Cell morphology and flow cytometry confirmed the successful extraction of rat bone mesenchymal stem cells. Transmission electron microscopy， particle size and Western blot validated the successful extraction of bone marrow mesenchymal stem cell exosomes， which could be taken up by nerve cells to promote the axon growth of PC12 cells and neural stem cells and up-regulate the expression level of axon protein. The promoting effect was strengthened as the increasing amount of exosomes. The axon length and the expression level of axon protein in the PC12 cells and neural stem cells significantly differed among three groups （all P < 0.001）. Conclusion Bone marrow mesenchymal stem cell exosomes play a role in repairing nerve injury by promoting the regeneration of nerve axon.

【Key words】Spinal cord injury;Bone marrow mesenchymal stem cell;Exosome;Axon regeneration

脊髓損傷將導(dǎo)致神經(jīng)損傷平面以下肢體的運動及感覺功能部分或完全喪失，給患者及社會帶來巨大的經(jīng)濟負擔[1]。臨床常用治療手段包括損傷后的減壓手術(shù)治療及腎上腺皮質(zhì)激素（激素）沖擊治療等，均主要降低局部及全身炎癥反應(yīng)程度、解除脊髓損傷局部壓迫，未能從根本上逆轉(zhuǎn)、修復(fù)損傷神經(jīng)，因此其治療效果有一定的局限性[2]。目前有研究表明脊髓損傷后軸突的再生對損傷平面以下的功能恢復(fù)具有至關(guān)重要的作用，但由于中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元再生能力弱，加之損傷后局部出現(xiàn)抑制性微環(huán)境，這使得脊髓損傷后神經(jīng)再生能力非常微弱[3]。有研究者發(fā)現(xiàn)間充質(zhì)干細胞（包括骨髓間充質(zhì)干細胞、臍帶間充質(zhì)干細胞、脂肪間充質(zhì)干細胞）作為一種多能祖細胞，既可以向類神經(jīng)元細胞分化，又可以通過旁分泌作用促進損傷神經(jīng)再生，是目前細胞治療及組織工程治療的主要種子細胞，目前已被用于多種疾病的臨床試驗[4]。隨著干細胞治療的研究不斷進展，目前研究者們認為移植間充質(zhì)干細胞分泌的胞外囊泡對于脊髓損傷修復(fù)的作用可能更為重要。外泌體是胞外囊泡的一種，直徑約40 ～ 150 nm，具有磷脂雙層膜結(jié)構(gòu)，并攜帶蛋白質(zhì)、核酸和脂類等大量調(diào)節(jié)細胞生理功能的信號，可由多種細胞分泌，可調(diào)節(jié)受體細胞的生物學(xué)活性[5]。目前已有研究者對間充質(zhì)干細胞治療脊髓損傷做了初步探索，并發(fā)現(xiàn)其可于體內(nèi)外促進損傷神經(jīng)修復(fù)，從而促進脊髓損傷后動物的運動功能恢復(fù)，然而對于外泌體促進神經(jīng)損傷修復(fù)的機制仍未明確，因此，本研究組通過研究骨髓間充質(zhì)干細胞外泌體對神經(jīng)軸突再生的作用，揭示了外泌體修復(fù)神經(jīng)損傷的機制，為后期外泌體臨床實驗提供理論基礎(chǔ)。

材料與方法

本研究符合動物實驗的倫理要求，并經(jīng)中山大學(xué)實驗動物倫理委員會審查批準。

一、大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞的分離與鑒定

使用骨髓腔沖洗法提取4周齡的SD大鼠股骨及脛骨骨髓間充質(zhì)干細胞，股骨中分離出大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞。將細胞培養(yǎng)于含有10%胎牛血清的低糖DMEM培養(yǎng)基中。每2日更換1次培養(yǎng)基，除去所有非黏附細胞以純化骨髓間充質(zhì)干細胞。通過光鏡觀察及流式細胞學(xué)技術(shù)檢測骨髓間充質(zhì)干細胞表面抗體（包括陽性抗體CD73、CD105，陰性抗體CD45、CD34、CD3）來驗證骨髓間充質(zhì)干細胞提取成功與否。

二、骨髓間充質(zhì)干細胞來源的外泌體的分離和鑒定

當骨髓間充質(zhì)干細胞生長密度達到80%

時，將傳統(tǒng)的培養(yǎng)基替換為無外泌體培養(yǎng)基，并繼續(xù)培養(yǎng)48 h。然后收集培養(yǎng)基，將培養(yǎng)基分

別以300×g離心10 min，2000×g離心20 min和

10 000×g離心30 min以消除死細胞和細胞碎片。然后將上清液以100 000×g離心90 min，棄去上清液，并用少量磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌重懸沉淀獲得外泌體懸液。根據(jù)制造商的說明，使用qNano?系統(tǒng)對外泌體的粒徑大小進行測試。使用表面標志分子（ALIX及HRS）鑒定骨髓間充質(zhì)干細胞外泌體。使用蛋白免疫印跡法測定，使用透射電子顯微鏡分析外泌體的形態(tài)及超微結(jié)構(gòu)。

三、腎上腺嗜鉻細胞瘤（PC12）細胞培養(yǎng)及分組

使用含有10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)大鼠PC12細胞。當研究外泌體促進PC12細胞軸突延長時，將培養(yǎng)基更換為含有1%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基誘導(dǎo)PC12細胞軸突延長。將PC12細胞分為空白對照組、30 μg外泌體組（加入30 μg外泌體處理）及60 μg外泌體組（加入60 μg外泌體處理）。

四、PC12細胞攝取外泌體實驗

外泌體用綠色熒光染料（PKH67）標記。 PC12細胞在激光共聚焦皿中培養(yǎng)12 h后，加入熒光標記的外泌體（10 μg/ml），在37℃下孵育12 h。然后將細胞用PBS洗滌3次，并用4%多聚甲醛固定10 min。用PBS洗滌3次后，將細胞核用DAPI染色，并使用熒光顯微鏡檢測PC12細胞中的綠色信號。

五、大鼠神經(jīng)干細胞提取及分組

取孕14 d的小鼠胚胎，將其端腦分離并切成小塊，然后將切碎的腦組織與0.25%胰蛋白酶在37℃下孵育1 h。使用含有10%胎牛血清的DMEM/F12（Gibco）培養(yǎng)基中和剩余胰酶。將分離出的神經(jīng)干細胞在含有2%B27和N2（Invitrogen），20 ng/ml表皮生長因子（EGF; PeproTech）和堿性成纖維細胞生長因子（bFGF; PeproTech）、1 mmol/L

GlutaMAX（Gibco）和抗生素（青霉素100 U/ml，

鏈霉素100 U/ml）的DMEM/F12（Gibco）培養(yǎng)基中培養(yǎng)，在37℃含5%二氧化碳的潮濕環(huán)境中培養(yǎng)。每3日更換1次培養(yǎng)基。將神經(jīng)干細胞分為空白對照組、30 μg外泌體組及60 μg外泌體組。

六、免疫熒光檢測

使用4%多聚甲醛將待檢測細胞在4℃下固定20 min，用5%山羊血清和0.2%Triton X-100制備的破膜液室溫下封閉破膜1 h后，用PBS清洗3次，加入相應(yīng)一抗4℃過夜，第2日加入相應(yīng)熒光二抗染色1 h。最后，用DAPI染色細胞核10 min。使用共聚焦顯微鏡觀察細胞內(nèi)相應(yīng)蛋白。

七、蛋白免疫印跡法檢測

使用含有RIPA裂解液在冰上裂解相應(yīng)細胞

1 h，12 000×g離心30 min后從上清液中收集組織裂解物。使用BCA蛋白質(zhì)測定試劑盒測定蛋白濃度后，將SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液（5X）加入樣品中，將樣品置于100℃加熱10 min以致蛋白變性。將等量（40 μg）蛋白懸液加入聚丙烯酰胺凝膠上樣。通過凝膠電泳分離蛋白質(zhì)并轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，用5%脫脂牛奶加入到PVDF膜中封閉1 h。將一抗加入PVDF膜中于4℃下孵育過夜，然后與辣根過氧化物酶綴合的二抗（ZSGB Bio，中國）溫育2 h。使用增強化學(xué)發(fā)光（ECL）試劑盒分析熒光，并使用Image J軟件計算每個條帶的光密度。

八、統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 21.0處理數(shù)據(jù)。實驗數(shù)據(jù)符合正態(tài)性及方差齊性，通過單因素方差分析和Bonferroni進行多組比較。P < 0.05或< 0.05/3為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。使用GraphPad構(gòu)圖，所有數(shù)據(jù)用表示。

結(jié)果

一、骨髓間充質(zhì)干細胞形態(tài)及鑒定

在體外，間充質(zhì)干細胞表現(xiàn)出典型的梭形，呈放射狀排列（圖1A）。流式細胞儀檢測結(jié)果表明，CD73和CD105抗體的陽性率分別為97.6%和77.8%，CD45、CD34和CD3的陽性率分別為0.167%、0.225%及0.139%，與間充質(zhì)干細胞的標志物表達一致，表明分離提取的細胞為骨髓間充質(zhì)干細胞（圖1B ～ F）。

二、外泌體鑒定

對提取物進行電子透射電鏡分析，可以看出提取物呈現(xiàn)出典型的中間有凹陷的茶托狀囊泡結(jié)構(gòu)，這完全符合外泌體的外形形態(tài)（圖2A）。粒徑分析表明，提取物的粒徑為90 ～ 100 nm，這與外泌體的粒徑一致（圖2B）。最后通過蛋白免疫印跡法驗證提取物，結(jié)果表明，提取物相對于骨髓間充質(zhì)干細胞高表達ALIX及HRS表面標志物（圖2C），提取物與外泌體特征一致，以上均證明提取物為大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞外泌體。

三、PC12細胞的外泌體吞噬作用

將源自骨髓間充質(zhì)干細胞的外泌體添加到PC12細胞培養(yǎng)基中，觀察其吞噬作用。如圖所示（圖3），圖中幾乎全部PC12細胞核均被PKH67染色的外泌體包圍，表明外泌體可以被PC12細胞成功吞入細胞質(zhì)并發(fā)揮后續(xù)作用。

四、外泌體促進PC12細胞軸突延長及軸突蛋白表達

PC12細胞分別培養(yǎng)為空白對照組、30 μg外泌體組和60 μg外泌體組。如圖所示（圖4），2個外泌體組軸突相關(guān)蛋白（NF-200及GAP43）熒光強度均明顯高于空白對照組，同時隨著外泌體量的增加，60 μg外泌體組的NF-200及GAP43熒光強度明顯高于30 μg外泌體組。定量分析PC12軸突長度顯示，3組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F = 99.180，P < 0.001），其中60 μg外泌體組的PC12細胞軸突長度長于空白對照組及30 μg外泌體組（P均< 0.001）。蛋白免疫印跡法檢測結(jié)果表明，3組PC12細胞NF蛋白表達量差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F = 35.69，P < 0.001），60 μg外泌體組PC12細胞NF蛋白表達量高于空白對照組及30 μg外泌體組（P均< 0.001）;3組GAP43蛋白的表達量差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F = 68.600，P < 0.001），60 μg外泌體組高于30 μg外泌體組及空白對照組（P均< 0.001），上述表明外泌體可以促進PC12細胞軸突延長及軸突蛋白表達，并且這一現(xiàn)象隨著外泌體量的增加而更明顯（圖5）。

五、外泌體促進神經(jīng)干細胞軸突延長及軸突蛋白表達

同樣將神經(jīng)干細胞分別培養(yǎng)為空白對照組、30 μg外泌體組和60 μg外泌體組。通過免疫熒光檢測可以看出，空白對照組神經(jīng)干細胞球周圍神經(jīng)軸突較2組外泌體組短，同時軸突密度也低于2組外泌體組，而在60 μg外泌體組，干細胞球周圍伸出的軸突形成密集的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)（圖6A）。定量分析神經(jīng)干細胞軸突長度，60 μg外泌體組神經(jīng)干細胞軸突長度長于空白對照組及30 μg外泌體組（P均< 0.001），對于神經(jīng)干細胞，外泌體同樣可以促進其軸突延長，同時隨著外泌體量的增加，其促進軸突延長效果越明顯（圖6B）。

討論

脊髓損傷是脊柱創(chuàng)傷的最嚴重并發(fā)癥，不僅對患者造成身心傷害，而且給家庭和社會帶來沉重負擔。脊髓損傷后，受傷區(qū)域發(fā)生一系列動態(tài)和復(fù)雜的病理生理變化，引起微循環(huán)紊亂，包括局部缺血、出血，血脊屏障受破壞，以及發(fā)生水腫和微血流動力學(xué)異常。所有這些因素均可能通過阻止功能性神經(jīng)突觸的重建而影響功能恢復(fù)[6]。同時作為中樞系統(tǒng)，脊髓固有的軸突再生能力較差，而且中樞神經(jīng)系統(tǒng)的抑制因子是軸突生長和功能恢復(fù)的障礙。目前已經(jīng)有大量的研究表明，將骨髓間充質(zhì)干細胞注射到受傷部位可有效控制脊髓損傷并促進受傷神經(jīng)的軸突生長[7]。軸突生長是神經(jīng)細胞高度調(diào)節(jié)的過程，在脊髓損傷修復(fù)中起重要作用。調(diào)節(jié)軸突的生長并使軸突穿過受傷區(qū)域延伸到損傷區(qū)遠端可重新建立上下神經(jīng)元的信號傳導(dǎo)功能，從而恢復(fù)神經(jīng)系統(tǒng)對遠端器官的支配功能[8]。

隨著對干細胞治療作用的深入研究，細胞替代治療已越來越受重視[9]。為了進一步深入了解骨髓間充質(zhì)干細胞促進神經(jīng)損傷修復(fù)的作用，我們集中研究骨髓間充質(zhì)干細胞的旁分泌作用以探討其分子機制。外泌體是具有特定大小、脂質(zhì)雙層結(jié)構(gòu)和密度的細胞外囊泡，能參與許多重要的細胞功能，包括調(diào)控免疫反應(yīng)，促進組織再生等[10-11]。

外泌體最為重要的功能是可調(diào)節(jié)細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，影響靶細胞增殖、分化、代謝和凋亡[1-2]。除此以外，外泌體治療還解決了直接采用干細胞移植帶來的倫理問題以及免疫排斥反應(yīng)等問題。在本研究中，我們分離出骨髓間充質(zhì)干細胞外泌體，并使用粒徑分析、檢測特定的外泌體表面標記以及透射電鏡圖像證實提取物為外泌體。

前期研究表明外泌體能抑制脊髓損傷區(qū)域的細胞凋亡及炎癥反應(yīng)，促進損傷后的功能恢復(fù)，主要通過抑制細胞炎癥因子TNF-α及IL-1β的表達，及升高抗炎蛋白IL-10和抗凋亡蛋白Bcl-2的表達水平[3]。于大鼠尾靜脈注射骨髓間充質(zhì)干細胞外泌體后，其神經(jīng)損傷區(qū)域可見明顯的血管網(wǎng)絡(luò)形成，提示外泌體有助于神經(jīng)血管重塑和功能的恢復(fù)[12-13]。我們將外泌體與神經(jīng)元細胞系PC12細胞及原代提取的神經(jīng)干細胞共培養(yǎng)，來驗證我們提出的外泌體可以促進神經(jīng)軸突再生的設(shè)想。通過外泌體吞噬實驗可以看出PC12細胞系可以有效吞噬外泌體，并且可以明顯促進PC12細胞軸突蛋白表達及軸突延長，而且其促進軸突延長的作用隨著外泌體量的增加而增強。同時，外泌體同樣可以作用于原代提取神經(jīng)干細胞，促進其神經(jīng)軸突的生長，在外泌體組中，無論是軸突的長度及軸突的密度都明顯優(yōu)于空白對照組，且這一促進現(xiàn)象同樣隨著外泌體量的增加而更為明顯。