王辰飛 姚雪婷 邵同聚 劉波

【摘 要】目的：探討類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎及骨關(guān)節(jié)炎中的共同關(guān)鍵基因及其功能意義。方法：通過GEO數(shù)據(jù)庫分析類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎及骨關(guān)節(jié)炎的差異基因，并使用DAVID數(shù)據(jù)庫對差異基因進(jìn)行通路富集分析和功能注釋，通過STRING數(shù)據(jù)庫構(gòu)建差異基因的蛋白-蛋白相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)，并下載結(jié)果進(jìn)一步分析。結(jié)果：GEO數(shù)據(jù)庫分析表達(dá)譜數(shù)據(jù)集GSE55235和GSE55457共得到112個差異基因，DAVID數(shù)據(jù)庫富集分析表明，這些差異基因主要富集在免疫應(yīng)答、整合在質(zhì)膜、DNA序列特異性結(jié)合以及IgA生成的腸道免疫網(wǎng)絡(luò)。STRING數(shù)據(jù)庫分析顯示，共有72個基因存在于PPI網(wǎng)絡(luò)中，而JUN、MYC、VEGFA、ATF3、CD19、EGR1、CXCL10、TLR7、TLR8和NR4A1為網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵基因。結(jié)論：JUN、MYC、VEGFA、ATF3、CD19、EGR1、CXCL10、TLR7、TLR8和NR4A1在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎及骨關(guān)節(jié)炎中表達(dá)失調(diào)，有望成為類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎及骨關(guān)節(jié)炎的生物標(biāo)志物及治療靶點。

【關(guān)鍵詞】 關(guān)節(jié)炎，類風(fēng)濕;骨關(guān)節(jié)炎;GEO數(shù)據(jù)庫;DAVID數(shù)據(jù)庫;STRING數(shù)據(jù)庫

【ABSTRACT】Objective：To investigate the common key genes in rheumatoid arthritis and osteoarthritis and their functional significance.Methods：The GEO database was used to analyze the differential genes of rheumatoid arthritis and osteoarthritis，and DAVID database was used to make pathway enrichment analysis and function annotation of the differential genes.The protein-protein interaction network of the differential genes was constructed by the STRING database，and the results were downloaded for further analysis.Results：A total of 112 deferentially expressed genes were obtained from the expression profile data sets GSE55235 and GSE55457 from GEO database analysis.The enrichment analysis of DAVID database showed that these differential genes were mainly concentrated in immune response，integrated in plasma membrane，and were in the DNA sequence specific binding and intestinal immune network generated by IgA.The STRING database analysis showed that there were 72 genes in the protein-protein interaction network，and JUN，MYC，VEGFA，ATF3，CD19，EGR1，CXCL10，TLR7，TLR8 and NR4A1 were the key genes in the network.Conclusion：The expressions of JUN，MYC，VEGFA，ATF3，CD19，EGR1，CXCL10，TLR7，TLR8 and NR4A1 were dysregulated in rheumatoid arthritis and osteoarthritis，which may become their biomarkers and therapeutic targets.

【Keywords】 arthritis，rheumatoid;osteoarthritis;GEO database;DAVID database;STRING database

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種以關(guān)節(jié)病變?yōu)橹鞯穆宰陨砻庖咝约膊?，主要特征為持續(xù)性滑膜炎、全身性炎癥和自身抗體（特別是類風(fēng)濕因子和瓜氨酸化肽）的產(chǎn)生。RA的病因約50%與遺傳因素有關(guān)，病情控制不理想會導(dǎo)致關(guān)節(jié)損傷、殘疾、生活質(zhì)量下降、心血管疾病和其他并發(fā)癥[1-2]。目前RA仍缺乏高效的治療方法，因此探索RA的生物標(biāo)志物及治療靶點將更為迫切。

骨關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis，OA）是目前最常見的慢性疾病之一，患病率和發(fā)病率逐年上升。OA發(fā)病原因可能與遺傳、生物學(xué)和生物力學(xué)等因素有關(guān)，也是影響人類生活質(zhì)量的一大困擾[3-4]。OA的治療方法主要包括藥物、物理和手術(shù)治療等，但效果仍較差。因此，研究與骨關(guān)節(jié)發(fā)病及進(jìn)展相關(guān)的生物標(biāo)志物，將為其治療方向提供新思路。

先前研究顯示，RA和OA可能存在著共同的發(fā)病機(jī)制且受共同的因子調(diào)節(jié)[5-6]，另外，某些藥物（如他汀類）對它們的治療也存在共同益處[7]。因此，本研究擬通過基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫（GEO數(shù)據(jù)庫）提取RA及OA基因芯片數(shù)據(jù)進(jìn)行差異基因表達(dá)譜分析，找出與這兩種疾病相關(guān)的共同差異基因，并對篩選得到的差異基因進(jìn)行功能注釋，為研究RA及OA的共同發(fā)病機(jī)制及治療靶點提供一定的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 GEO數(shù)據(jù)庫 GEO數(shù)據(jù)庫由美國國立生物技術(shù)信息中心（NCBI）創(chuàng)建并維護(hù)，該數(shù)據(jù)庫收錄了多種疾病的多組學(xué)原始數(shù)據(jù)可供用戶下載及研究。本研究通過GEO數(shù)據(jù)庫搜索獲取RA及OA患者基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)集GSE55235和GSE55457。GSE55235和GSE55457均包含了30例患者的基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)集，其中10例為正常滑膜對照組織，10例為RA滑膜組織，10例為OA滑膜組織。采用R語言軟件（https：//www.r-project.org/）進(jìn)行基因芯片質(zhì)量分析和篩選差異基因。差異基因篩選采用R語言中的limma包對得到的基因表達(dá)譜矩陣文件進(jìn)行差異基因篩選，以滿足log2FC > 1或log2FC < -1，P < 0.05為候選差異基因。

1.2 DAVID數(shù)據(jù)庫 DAVID數(shù)據(jù)庫（https：//david.ncifcrf.gov/）是一個生物信息數(shù)據(jù)庫，其整合了多種生物學(xué)數(shù)據(jù)和分析工具，為大量的基因或蛋白列表提供系統(tǒng)的生物功能注釋信息，幫助用戶從中提取生物學(xué)信息。本研究通過DAVID數(shù)據(jù)庫對篩選得到的差異基因進(jìn)行基因本體（GO）、京都基因與基因組百科全書（KEGG）富集分析和功能注釋，下載結(jié)果數(shù)據(jù)進(jìn)行進(jìn)一步整理分析。

1.3 STRING數(shù)據(jù)庫 STRING數(shù)據(jù)庫（https：//string-db.org/）是一個在線搜索已知的蛋白-蛋白相互作用（PPI）關(guān)系的數(shù)據(jù)庫，提供了超過2000個物種的9萬多種蛋白的互作信息。本研究通過該數(shù)據(jù)庫對篩選得到的差異基因進(jìn)行構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)[8]。

1.4 Cytoscape軟件 使用Cytoscape軟件對差異基因的PPI網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行模塊分析和篩選關(guān)鍵基因。

2 結(jié) 果

2.1 RA與OA差異基因的篩選 使用R語言對基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)集GSE55235[9]和GSE55457[9]進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理后再進(jìn)一步分析差異基因。其中GSE55235和GSE55457數(shù)據(jù)集的平臺文件均為GPL96（[HG-U133A]Affymetrix Human Genome U133A Array）。分析GSE55235數(shù)據(jù)集共篩選出846個差異基因，其中上調(diào)基因462個，下調(diào)基因384個，見圖1（1）。分析GSE55457數(shù)據(jù)集共篩選出282個差異基因，其中上調(diào)基因133個，下調(diào)基因149個，見圖1（2）。最后對這兩個數(shù)據(jù)集篩選出的差異基因取交集，共得到112個差異基因，見圖1（3）。

2.2 差異基因的富集分析及功能注釋 使用DAVID數(shù)據(jù)庫對篩選出來的112個差異基因進(jìn)行GO和KEGG富集分析，結(jié)果顯示，這些差異基因在生物學(xué)過程（BP）中主要集中在免疫應(yīng)答，細(xì)胞組分（CC）中主要集中在整合在質(zhì)膜，分子功能（MF）中主要集中在DNA序列特異性結(jié)合，KEGG通路分析主要集中在IgA生成的腸道免疫網(wǎng)絡(luò)，見圖2。

2.3 差異基因PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及模塊分析 為了進(jìn)一步明確這些差異基因之間的相互作用關(guān)系，使用STRING數(shù)據(jù)庫在線工具對這些差異基因進(jìn)行PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及模塊分析。Cytoscape軟件分析結(jié)果顯示，PPI網(wǎng)絡(luò)共有72個節(jié)點和266條邊，見圖3（1）。PPI網(wǎng)絡(luò)可以分為4個模塊，筆者選擇最重要的模塊進(jìn)行生物學(xué)過程分析，見圖3（2）。結(jié)果表明，模塊中的基因主要富集在正向調(diào)節(jié)高分子生物合成過程，見圖3（3）。

2.4 篩選關(guān)鍵基因 使用Cytoscape軟件分析差異基因的PPI網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵基因，根據(jù)度數(shù)算法選擇前10個關(guān)鍵基因（JUN、MYC、VEGFA、ATF3、CD19、EGR1、CXCL10、TLR7、TLR8和NR4A1），見圖4、表1，對這10個關(guān)鍵基因進(jìn)行生物學(xué)過程功能注釋，結(jié)果表明，這些基因主要集中在正向調(diào)節(jié)高分子生物合成過程。

3 討 論

目前，RA和OA仍是影響人們生活質(zhì)量的兩大慢性疾病，它們尚缺乏高效的治療方法。RA治療仍主要為改善病情抗風(fēng)濕藥、免疫抑制劑等，而OA也主要以藥物治療及手術(shù)治療為主。本研究通過利用生物信息學(xué)技術(shù)分析GSE55235和GSE55457數(shù)據(jù)集辨別RA和OA中的共同差異表達(dá)基因，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，112個基因在這兩種疾病中存在共同差異表達(dá)（log2FC > 1，P < 0.05）;進(jìn)一步對這些差異基因進(jìn)行功能注釋和KEGG通路富集分析，結(jié)果表明，這些差異基因主要集中在免疫應(yīng)答（生物學(xué)過程）、整合在質(zhì)膜（細(xì)胞組分）、DNA序列特異性結(jié)合（分子功能）和IgA生成的腸道免疫網(wǎng)絡(luò)（KEGG通路分析）。這些結(jié)果表明，差異基因可能通過這些功能及通路影響RA及OA的進(jìn)展。研究表明，免疫應(yīng)答在RA中具有重要作用，間充質(zhì)干細(xì)胞可以通過調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答調(diào)控RA的進(jìn)展[10]，另外，多巴胺也可以通過調(diào)控免疫應(yīng)答抑制RA的進(jìn)展[11]。免疫應(yīng)答也在OA的發(fā)生進(jìn)展中具有重要作用[12]，HARRELL等[13]報道間充質(zhì)干細(xì)胞可以通過抑制一些免疫細(xì)胞的免疫應(yīng)答來延緩和控制OA病情的進(jìn)展。IgA生成的腸道免疫網(wǎng)絡(luò)信號通路也是一條重要的通路，它在多種疾病中發(fā)揮著重要的作用。在肝癌中，IgA生成的腸道免疫網(wǎng)絡(luò)信號通路的激活可以促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖和遷移[14]。在RA及OA中，IgA生成的腸道免疫網(wǎng)絡(luò)信號通路可能是RA及OA病情進(jìn)展的共同信號通路[15-17]。

PPI網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果表明，在112個差異基因中，有72個差異基因的蛋白質(zhì)具有相互作用關(guān)系，進(jìn)一步對PPI網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行分析顯示，該網(wǎng)絡(luò)可分為4個功能模塊，筆者對最重要的功能模塊進(jìn)行了生物學(xué)過程功能分析，結(jié)果顯示，模塊中的差異基因主要富集在正向調(diào)節(jié)高分子生物合成過程。分析網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵基因結(jié)果顯示，JUN、MYC、VEGFA、ATF3、CD19、EGR1、CXCL10、TLR7、TLR8和NR4A1為PPI網(wǎng)絡(luò)中前10個關(guān)鍵基因。對這10個關(guān)鍵基因進(jìn)行生物學(xué)過程功能注釋顯示，它們主要集中在正向調(diào)節(jié)高分子生物合成過程。先前的研究亦表明這10個關(guān)鍵基因均為RA與OA的共同差異基因，并參與RA與OA的病程進(jìn)展[18-19]。如VEGFA，研究顯示其核苷酸的多態(tài)性是人患RA的一個危險因素[20-21]，并且受一些miRNA調(diào)節(jié)來促進(jìn)RA的進(jìn)展[22]。同樣，在OA病程進(jìn)展中VEGFA也發(fā)揮著重要作用，其受一些miRNA（miR-15a-5p）調(diào)節(jié)，miR-15a-5p的高表達(dá)可抑制VEGFA的表達(dá)并延緩OA的進(jìn)展，而其抑制表達(dá)可導(dǎo)致VEGFA的表達(dá)升高并促進(jìn)OA的進(jìn)展[23]。

CXCL10也是調(diào)節(jié)RA及OA病程進(jìn)展的關(guān)鍵基因。在OA中C5aR1和TLR2可以通過激活p38-MAPK信號通路并增加CXCL10的表達(dá)來促進(jìn)OA的進(jìn)展[24]。而在RA中，TXNDC5的高表達(dá)可抑制CXCL10的表達(dá)并抑制RA進(jìn)展，沉默TXNDC5可導(dǎo)致CXCL10表達(dá)顯著上調(diào)并促進(jìn)RA進(jìn)展[25]。

這些結(jié)果進(jìn)一步揭示了RA和OA疾病發(fā)展的共同分子機(jī)制，將為研究治療RA和OA的靶點提供一個初步理論依據(jù)。然而，本研究仍有一些不足之處，仍需要結(jié)合大樣本并進(jìn)行相關(guān)的體內(nèi)外及分子機(jī)制實驗進(jìn)一步驗證，才能完全明確這些差異基因在RA及OA中的具體作用機(jī)制。

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收稿日期：2019-12-19;修回日期? ：2020-05-04