梅曉峰 王志文 馬煒秀 張凱淇 侯淋飛 曹穎

【摘 要】目的：觀察麝香烏龍丸對(duì)高濃度1-磷酸鞘胺醇（S1P）誘導(dǎo)下人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC）的細(xì)胞連接及RhoA/RhoA激酶（ROCK）信號(hào)通路的影響，探討麝香烏龍丸治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的作用機(jī)制。方法：將HUVEC分為4組：對(duì)照組，高濃度S1P組，高濃度S1P + 麝香烏龍丸組，高濃度S1P + S1PR2拮抗劑JTE013組。采用免疫熒光檢測(cè)HUVEC中細(xì)胞連接相關(guān)蛋白R(shí)OCK、ZO-1的變化，Western blot檢測(cè)RhoA、ROCK、磷酸化RhoA激酶（p-ROCK）、ZO-1蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果：高濃度S1P干預(yù)后，HUVEC中RhoA、p-ROCK、ROCK蛋白表達(dá)均上調(diào)，ZO-1表達(dá)下調(diào)，與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

（P < 0.05）。麝香烏龍丸能夠下調(diào)RhoA、ROCK、p-ROCK蛋白的表達(dá)，上調(diào)ZO-1表達(dá)，與高濃度S1P組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。結(jié)論：麝香烏龍丸能夠通過RhoA/ROCK通路調(diào)控HUVEC細(xì)胞連接相關(guān)蛋白R(shí)OCK、p-ROCK及ZO-1的表達(dá)，穩(wěn)定HUVEC的血管屏障，這可能是麝香烏龍丸治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的機(jī)制之一。

【關(guān)鍵詞】 關(guān)節(jié)炎，類風(fēng)濕;麝香烏龍丸;人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞;S1P細(xì)胞連接蛋白;RhoA/ROCK信號(hào)通路

【ABSTRACT】Objective：To observe the effect of Shexiang Wulong Wan（麝香烏龍丸，SXWLW）on the cell junction and RhoA/ROCK signal pathway of human umbilical vein endothelial cells（HUVEC）induced by high concentration of sphingosine 1-phosphosphingol（S1P），and to explore the mechanism of SXWLW in the treatment of rheumatoid arthritis.Methods：HUVEC was divided into four groups：the control group，the high-concentration S1P group（the HS1P group），the high concentration S1P + SXWLW group（the HS1P + SXWLW?group），and the high concentration S1P + S1PR2 antagonist JTE013 group（the HS1P + JET013 group）.Immunofluorescence was used to detect the changes of cell junction related proteins ROCK and ZO-1 in HUVEC.The expression levels of RhoA，ROCK，phosphorylated RhoA kinase（p-ROCK）and ZO-1 were detected by Western blot.Results：Under the intervention of high concentration of S1P，the expressions of RhoA，p-ROCK and ROCK in HUVEC were up-regulated and ZO-1 was down regulated，the difference was statistically significant compared with the control group（P < 0.05）.

SXWLW could down regulate the expression of RhoA，ROCK，p-ROCK protein，and up?regulate the expression of ZO-1，and the difference was statistically significant com-pared with the HS1P group（P < 0.05）.Conclusion：SXWLW can regulate the expressions of ROCK，p-ROCK and ZO-1 and stabilize the vascular barrier of HUVEC through RhoA/ROCK pathway，which may be one of the mechanisms of SXWLW in treating rheumatoid arthritis.

【Keywords】 arthritis，rheumatoid;Shexiang Wulong Wan（麝香烏龍丸）;HUVEC;S1P cell junction related?proteins;RhoA/ROCK signaling pathway

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種以慢性、侵襲性關(guān)節(jié)炎為主要臨床表現(xiàn)的自身免疫性疾病。主要病理改變?yōu)榛そM織中多種炎性細(xì)胞及炎性因子浸潤(rùn)，滑膜新生血管生成，軟骨損害以及骨破壞，最終導(dǎo)致關(guān)節(jié)畸形甚至殘疾。RA血管翳中新生血管結(jié)構(gòu)不成熟，內(nèi)皮細(xì)胞類似高內(nèi)皮靜脈，排列不整齊，血管通透性增加，導(dǎo)致血液中炎性細(xì)胞穿出血管進(jìn)入滑膜組織，從而加重了滑膜炎癥，不斷侵蝕軟骨及骨組織[1-3]。由此可見，高通透性新生血管網(wǎng)的存在是導(dǎo)致滑膜持續(xù)炎癥及軟骨損害的重要原因。如果能夠改善新生血管的屏障功能，將可能減少滑膜組織的炎癥狀態(tài)。穩(wěn)定的細(xì)胞連接是保證血管結(jié)構(gòu)完整的必要條件。血管內(nèi)皮鈣黏蛋白（VE-cadherin）及閉鎖小帶蛋白1（ZO-1）分別是粘附連接和緊密連接中的關(guān)鍵蛋白，其表達(dá)及定位與1-磷酸鞘胺醇（S1P）的細(xì)胞外濃度密切相關(guān)[4]。

S1P是RA血管生成的一個(gè)強(qiáng)有力的誘導(dǎo)因子[5]。

S1P作為細(xì)胞內(nèi)的第二信使以及細(xì)胞外刺激與特定的G蛋白偶聯(lián)受體S1P受體（S1PR）結(jié)合發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)。RA患者滑液中的S1P水平明顯高于非炎性骨關(guān)節(jié)炎患者[6]。高濃度S1P與血管內(nèi)皮細(xì)胞表面的S1PR2結(jié)合，誘導(dǎo)VE-cadherin處于分散狀態(tài)，減弱細(xì)胞連接，具體細(xì)節(jié)尚不清楚[7];

高濃度S1P還可激活RhoA，通過下游效應(yīng)分子ROCK促進(jìn)應(yīng)力纖維形成，加強(qiáng)細(xì)胞收縮[8];同時(shí)還能通過RhoA途徑使ZO-1蛋白解體，破壞緊密連接[9]。本課題組前期研究表明，麝香烏龍丸能顯著抑制滑膜組織血管生成，有效抑制滑膜炎癥，減少關(guān)節(jié)軟骨基質(zhì)的降解[10]。麝香烏龍丸是否能夠通過加強(qiáng)新生血管細(xì)胞連接改善血管屏障功能，起到治療RA的作用呢？通過研究麝香烏龍丸對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC）S1P-RhoA/ROCK信號(hào)通路及下游細(xì)胞連接相關(guān)蛋白ZO-1、ROCK的影響，探討麝香烏龍丸治療RA的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與試劑 HUVEC（上海中喬新舟生物科技有限公司，貨號(hào)ZQ 0113）;麝香烏龍丸（由人工麝香、制川烏、地龍、全蝎、黑豆組成，華北理工大學(xué)附屬醫(yī)院提供，批號(hào)冀藥制字Z20051581）;SDS-PAGE凝膠制備試劑盒（北京索萊寶科技有限公司，P1200-1）;JTE013抑制劑（Cayman，383150-41）;ZO-1抗體（美國(guó)GeneTex公司，GTX108592），RhoA抗體（arigo公司，ARG66306）;兔抗β肌動(dòng)蛋白、兔抗磷-ROCK1（北京博奧森生物技術(shù)有限公司，bs-0061R、bs-4630R）;辣根酶標(biāo)記山羊抗兔IgG（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，ZB-2301）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 麝香烏龍丸水提物制作 將麝香烏龍丸放入超微粉碎機(jī)粉碎，取粉10 g加10 mL純水，常溫浸泡過夜，然后超聲80 Hz，37 ℃，30 min，離心機(jī)以20 000 r·min-1離心20 min，離心半徑21 cm，取上清液，冷凍干燥成粉，取50 mg凍干粉，加入純水至5 mL，制成濃度為10 mg·mL-1的母液，0.22 μm濾器過濾后使用。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)及分組 HUVEC培養(yǎng)在含有1640 +?10% FBS培養(yǎng)基中，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱（37℃、5%CO2）進(jìn)行孵育，待細(xì)胞生長(zhǎng)接近融合，生長(zhǎng)面積達(dá)85%～95%時(shí)可消化并傳代。該實(shí)驗(yàn)使用4～7代細(xì)胞。細(xì)胞分4組：①對(duì)照組：含10% FBS的1640培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h;②高濃度S1P組（S1P組）：含10% FBS的1640培養(yǎng)基，24 h后倒掉原培養(yǎng)基，PBS洗3遍，加入含10 μmol·L-1 S1P培養(yǎng)基，刺激30 min;③高濃度S1P組 + 麝香烏龍丸（S1P + SXWLW組）：濃度為320 μg·mL-1麝香烏龍丸提取物 + 10% FBS的1640培養(yǎng)基，24 h后倒掉原培養(yǎng)基，PBS洗3遍，加入含10 μmol·L-1 S1P培養(yǎng)基，刺激30 min;④S1P + S1PR2拮抗劑JTE013組（S1P + JTE013組）：加入含1 μmol·L-1?S1PR2拮抗劑JTE013 + 10% FBS的1640培養(yǎng)基，24 h后倒掉原培養(yǎng)基，PBS洗3遍，加入含10 μmol·L-1 S1P培養(yǎng)基，刺激30 min。

1.2.3 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活性 將HUVEC以每孔5000個(gè)接種于96孔板中，含10% FBS的1640培養(yǎng)基預(yù)培養(yǎng)24 h;倒掉培養(yǎng)基，加入100 μL濃度分別為20，40，80，160，320 μg·mL-1的麝香烏龍丸提取液，培養(yǎng)24 h。每孔加入10 μL CCK溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，測(cè)定在450 nm處的吸光度值。

1.2.4 免疫熒光染色 將HUVEC接種于培養(yǎng)皿的中心玻璃小孔中，待細(xì)胞融合至70%～80%，按實(shí)驗(yàn)分組設(shè)計(jì)處理細(xì)胞，然后放入4%多聚甲醛，固定細(xì)胞30 min，水化15 min，用山羊血清封閉30 min，PBS清洗3遍，每次2～3 min，擦干。分別加入一抗ZO-1（1∶100）、p-ROCK（1∶200），每孔20 μL，4 ℃過夜。PBS洗3次，加入FTC標(biāo)記的山羊抗兔二抗（1∶500），每孔20 μL，37 ℃避光孵育1 h。PBS洗3次，DAPI染核，熒光顯微鏡觀察，激發(fā)光波長(zhǎng)488處采集圖像。

1.2.5 蛋白免疫印跡（Western blot）檢測(cè) 按上述分組處理細(xì)胞后，RIPA裂解，離心取上清，BCA法進(jìn)行蛋白定量。常規(guī)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，加入相應(yīng)一抗ZO-1、ROCK、p-ROCK及RhoA濃度均為1∶1000，4 ℃過夜。二抗辣根酶標(biāo)記山羊抗兔IgG（1∶1000），室溫孵育1 h。ECL顯色，Image J軟件分析，計(jì)算蛋白條帶灰度值，目的蛋白表達(dá)水平用目的蛋白與內(nèi)參蛋白的灰度比值表示。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以表示，組間比較選擇單因素方差分析。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 CCK-8檢測(cè)麝香烏龍丸提取物對(duì)HUVEC細(xì)胞增殖的影響 20 μg·mL-1麝香烏龍丸提取液促進(jìn)HUVEC細(xì)胞增殖，80 μg·mL-1及其以上濃度抑制細(xì)胞增殖，當(dāng)藥物濃度為320 μg·mL-1時(shí)，抑制率為30.85%，選擇該濃度作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)藥物濃度。見表1。

2.2 免疫熒光法檢測(cè)ZO-1蛋白表達(dá) 對(duì)照組中，ZO-1蛋白主要集中表達(dá)在細(xì)胞膜上。S1P組細(xì)胞膜ZO-1蛋白表達(dá)減少，部分分散于胞漿中。S1P + SXWLW組及S1P + JTE013組細(xì)胞膜ZO-1蛋白表達(dá)較S1P組增多，但少于對(duì)照組。見圖1。

2.3 免疫熒光法檢測(cè)p-ROCK蛋白表達(dá) 對(duì)照組中，p-ROCK蛋白表達(dá)較少，主要分布在胞漿以及胞核周圍;S1P組p-ROCK蛋白的表達(dá)上調(diào)，集中分布在胞漿以及胞核;S1P + SXWLW組及S1P +? JTE013組中p-ROCK蛋白表達(dá)減少。見圖2。

2.4 Western Blot檢測(cè)ROCK、p-ROCK、RhoA、ZO-1蛋白表達(dá) 與對(duì)照組比較，S1P組細(xì)胞ZO-1蛋白表達(dá)降低（P < 0.05），RhoA、ROCK、p-ROCK蛋白表達(dá)升高（P < 0.05）。與S1P組比較，S1P + SXWLW組和S1P + JTE013組ZO-1蛋白表達(dá)增加（P < 0.05），RhoA、ROCK、p-ROCK蛋白表達(dá)下降（P < 0.05）。見表2、圖3。

3 討 論

RA滑膜組織中血管翳形成的基礎(chǔ)是滑膜中新生血管，影響新生血管的因素有血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）、缺氧誘導(dǎo)因子1（HIF-1）、血管生成素、趨化因子及其受體、促炎性細(xì)胞因子、基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）與黏附分子等[11]。目前滑膜血管翳的血管新生是RA研究中的熱點(diǎn)。新生血管翳為滑膜提供養(yǎng)分，通過抑制血管新生可以有效阻止RA進(jìn)展。同時(shí)，新生血管結(jié)構(gòu)不成熟，屏障功能減弱是造成炎性細(xì)胞的原因之一;細(xì)胞連接不緊密，可以促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移，是新血管生成的基礎(chǔ)。因此，穩(wěn)定的細(xì)胞連接對(duì)減少炎性細(xì)胞浸潤(rùn)及血管新生都很重要[12-13]。細(xì)胞連接主要包括粘附連接和緊密連接2種，內(nèi)皮細(xì)胞間接觸由2種類型的連接復(fù)合物介導(dǎo)：粘附連接（AJs）和緊密連接（TJs）。VE-cadherin及ZO-1分別是粘附連接和緊密連接中的關(guān)鍵蛋白，在血管穩(wěn)定性和血管完整性方面發(fā)揮著重要作用。他們的表達(dá)及定位與S1P的細(xì)胞外濃度密切相關(guān)[14]。

S1P是一種存在于血漿中的多效信號(hào)脂質(zhì)分子，S1P在調(diào)節(jié)包括細(xì)胞增殖、遷移、炎癥介質(zhì)合成、血管生成和血管成熟在內(nèi)的多種生理和病理過程中起到關(guān)鍵作用。重要的是，細(xì)胞外S1P可與5種不同的G蛋白偶聯(lián)受體（GPCRs）結(jié)合，稱為S1PR1-5，其中3種受體（S1PR1、S1PR2和S1PR3）在內(nèi)皮細(xì)胞（ECs）中表達(dá)。正常關(guān)節(jié)腔滑膜液中S1P生理濃度為10～600 nmol·L-1，這一濃度范圍的S1P主要激活受體S1PR1，可維持血管穩(wěn)定和增強(qiáng)屏障功能[15]，而S1PR2和S1PR3均與內(nèi)皮細(xì)胞破壞有關(guān)[16]。受體亞型表達(dá)的平衡以及血漿S1P濃度水平?jīng)Q定了血管的完整性。RA患者滑液中的S1P處于高水平狀態(tài)，滑膜液中S1P濃度可達(dá)（17.51±4.23）μmol·L-1[17]。高濃度S1P與血管內(nèi)皮細(xì)胞表面的S1PR2結(jié)合，通過激活RhoA和下游激酶ROCK，引起p-ROCK分布的改變，并減少內(nèi)皮細(xì)胞表面ZO-1蛋白表達(dá)，從而破壞緊密連接，降低內(nèi)皮細(xì)胞的屏障功能[18]。以上證據(jù)表明高濃度S1P將損害血管屏障功能，這一過程與S1PR2活化，激活RhoA/ROCK信號(hào)通路密切相關(guān)?？梢姡琑A滑膜液中高濃度的S1P是導(dǎo)致滑膜血管翳新生以及新生微血管結(jié)構(gòu)異常的重要原因。減少高濃度S1P對(duì)滑膜血管屏障的破壞，也許能夠減少炎細(xì)胞浸潤(rùn)，血管新生，從而改善滑膜炎癥。

RA屬中醫(yī)學(xué)“痹證”“歷節(jié)病”范疇，經(jīng)絡(luò)痹阻為其基本病機(jī)，故RA亦屬于中醫(yī)學(xué)的“絡(luò)病”范疇，治療應(yīng)以祛邪通絡(luò)為主。麝香烏龍丸源自許叔微《普濟(jì)本事方》的麝香圓，經(jīng)藥物和劑量調(diào)整研制而成。方中麝香為君藥，通諸竅，開經(jīng)絡(luò)，透肌骨;制川烏為臣藥，祛風(fēng)除濕，溫經(jīng)止痛，現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明烏頭堿具有顯著的抗炎鎮(zhèn)痛作用，治療RA具有顯著療效[19];地龍善通經(jīng)絡(luò)，全蝎息風(fēng)解痙止痛，兩者相伍搜剔絡(luò)道，攻剔深入經(jīng)絡(luò)、筋骨、肌肉之邪，共為佐藥，并引川烏直達(dá)病所;黑豆補(bǔ)益肝腎，并解諸藥之毒為使藥。諸藥配伍，在溫陽通絡(luò)的同時(shí)，兼有祛風(fēng)除濕，化瘀止痛，補(bǔ)腎強(qiáng)骨之功。該藥在臨床使用20余年，治療RA取得了良好療效[20-21]。

現(xiàn)代中醫(yī)基礎(chǔ)理論研究認(rèn)為，絡(luò)病與血管生成相關(guān)病變關(guān)系密切[5]，并在很多疾病的研究中得到證實(shí)。RA被認(rèn)為是一種“血管生成性疾病”，抗血管新生治療是RA的研究熱點(diǎn)[6]。本研究結(jié)果表明膜液中高濃度S1P導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞連接破壞，與高濃度S1P活化S1PR2，激活RhoA/ROCK信號(hào)通路，損害微血管內(nèi)皮細(xì)胞之間的細(xì)胞連接密切相關(guān);麝香烏龍丸可以通過干預(yù)S1PR2-RhoA/ROCK信號(hào)通路，維持微血管屏障。這也許是麝香烏龍丸抑制血管新生，減輕滑膜炎癥治療RA的機(jī)制之一。

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收稿日期：2020-01-28;修回日期：2020-04-14