周天恩 譚笑杏 蔣龍?jiān)?/p>

缺血性腦損傷通常是由突然的血液供應(yīng)阻斷所致，導(dǎo)致大腦組織的氧氣和葡萄糖供應(yīng)減少。炎癥反應(yīng)在缺血缺氧性腦損傷的病理生理中起關(guān)鍵作用，而抑制炎性反應(yīng)可以改善神經(jīng)功能結(jié)局［1］。小膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的主要免疫細(xì)胞，缺血后小膠質(zhì)細(xì)胞迅速活化，促成炎癥反應(yīng)［2］。本研究采用體外培養(yǎng)的BV2 小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞細(xì)胞系制作氧糖剝奪再灌注（OGD/R）模型模擬體內(nèi)腦卒中損傷，觀察不同時(shí)長(zhǎng)OGD/R 后小膠質(zhì)細(xì)胞的形態(tài)學(xué)改變，探討OGD/ R 對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥反應(yīng)的影響。

1 材料及方法

1.1 細(xì)胞、試劑、儀器（1）細(xì)胞BV2 永生化的鼠小膠質(zhì)細(xì)胞由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院（中國(guó)）細(xì)胞培養(yǎng)中心提供。（2）試劑DMEM/F12 培養(yǎng)基（美國(guó)Gibco 公司），胎牛血清（美國(guó)Gibco 公司），EBSS 平衡鹽溶液（中國(guó)solarbio 公司）；白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）ELISA 試劑盒（美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司），腫瘤壞死因子-α（TNF-α）ELISA 試劑盒（美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司），白細(xì)胞介素-6（IL-6）ELISA 試劑盒（美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司）。（3）酶標(biāo)儀（DiatekDR-200Bs）、IX73 倒置熒光顯微鏡（日本OLYMPUS 公司）。

1.2 方法（1）細(xì)胞培養(yǎng)復(fù)蘇凍存的BV2 小膠質(zhì)細(xì)胞，用含10%胎牛血清的DMEM/F12 重懸后將細(xì)胞接種至T25 細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，在37°C 的普通培養(yǎng)箱（37℃，19%O2，5%CO2）中培養(yǎng)。待細(xì)胞長(zhǎng)滿后，以1×106細(xì)胞/皿的細(xì)胞數(shù)接種至直徑60 mm 的培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)24 小時(shí)后分別進(jìn)行OGD 處理。我們研究中所用的所有細(xì)胞培養(yǎng)試劑已在以往的研究中被證明有效［3，4］。（2）實(shí)驗(yàn)分組及氧糖剝奪及再灌注模型（OGD/R）的建立將實(shí)驗(yàn)細(xì)胞隨機(jī)分為4組（n=6）：空白對(duì)照組、氧糖剝奪（OGD）2 h、OGD4h、OGD6h。預(yù)先調(diào)設(shè)三氣細(xì)胞培養(yǎng)箱至缺氧狀態(tài)（37℃，0.1%O2，5%CO2，94.9%N2），從普通培養(yǎng)箱中取出BV2 小膠質(zhì)細(xì)胞，將原培養(yǎng)基用EBSS 洗滌后更換為EBSS 培養(yǎng)以模擬小膠質(zhì)細(xì)胞缺血，并置于缺氧培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，以此建立小膠質(zhì)細(xì)胞OGD 模型，模擬小膠質(zhì)細(xì)胞缺血、缺氧損傷。細(xì)胞OGD 不同時(shí)間培養(yǎng)之后換回原培養(yǎng)基，換回原培養(yǎng)基，重新置于普通培養(yǎng)箱，復(fù)糖、復(fù)氧24h 后觀察及處理送檢。（3）小膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察于倒置熒光顯微鏡下觀察OGD 不同時(shí)間后小膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變。

1.3 炎性因子的測(cè)定Elisa法檢測(cè)OGD不同時(shí)間后小膠質(zhì)細(xì)胞上清液中炎性因子IL-1β、IL-6、TNFα的含量。取細(xì)胞培養(yǎng)上清，2000r/min離心20min，仔細(xì)收集上清。嚴(yán)格按照ELISA 試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，檢測(cè)細(xì)胞上清中IL-1β、IL-6、TNF-α的含量。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析所有數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS 13.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。所有計(jì)量資料以（±s）來(lái)表示，采用單因素方差分析的統(tǒng)計(jì)方法，先行方差齊性檢驗(yàn)，方差齊時(shí)采用LSD 檢驗(yàn)，方差不齊時(shí)采用Dunnett T3 檢驗(yàn)，P<0.05 認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 不同時(shí)長(zhǎng)OGD/R 后小膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變倒置熒光顯微鏡下觀察未進(jìn)行OGD/R 處理的小膠質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)良好，細(xì)胞呈細(xì)長(zhǎng)或橢圓，從胞體發(fā)出細(xì)長(zhǎng)而有分枝的突起，細(xì)胞形態(tài)正常。OGD/R 后小膠質(zhì)細(xì)胞損傷明顯，OGD 2h 后復(fù)糖復(fù)氧主要表現(xiàn)為部分細(xì)胞分枝剝離消失，細(xì)胞固縮，OGD 4h 后復(fù)糖復(fù)氧細(xì)胞突觸剝離消失較OGD 2h明顯且固縮更為嚴(yán)重，受損細(xì)胞數(shù)目也更多，OGD 6h 后復(fù)糖復(fù)氧與前兩組比較出現(xiàn)更為明顯且范圍更廣的突觸剝離及細(xì)胞固縮等結(jié)構(gòu)破壞，出現(xiàn)較多細(xì)胞死亡（見(jiàn)圖1）。

圖1 倒置熒光顯微鏡觀察小膠質(zhì)細(xì)胞不同時(shí)長(zhǎng)OGD 后形態(tài)學(xué)改變。對(duì)照組（A）小膠質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)良好，細(xì)胞呈細(xì)長(zhǎng)或橢圓，從胞體發(fā)出細(xì)長(zhǎng)而有分枝的突起，細(xì)胞形態(tài)正常。OGD 2h 組（B）部分細(xì)胞分枝剝離消失，細(xì)胞固縮。OGD 4h 組（C）細(xì)胞突觸剝離消失較OGD2h 明顯且固縮更為嚴(yán)重，受損細(xì)胞數(shù)目也更多。OGD 6h 組（D）出現(xiàn)更為明顯且范圍更廣的突觸剝離及細(xì)胞固縮等結(jié)構(gòu)破壞，出現(xiàn)較多細(xì)胞死亡。

2.2 ELISA 方法檢測(cè)不同時(shí)長(zhǎng)OGD/R 后小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥因子分泌見(jiàn)表1。

表1 各組細(xì)胞上清液炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α表達(dá)比較（±s，n=6）

表1 各組細(xì)胞上清液炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α表達(dá)比較（±s，n=6）

注：OGD 為氧糖剝奪；與對(duì)照組比較，*P<0.05，#P<0.01。

組別對(duì)照組OGD2h OGD4h OGD6h TNF-α（pg/ml）102.0±25.6 88.3±29.3 113.0±68.0 79.9±41.3樣本數(shù)（n）6 6 6 6 IL-1β（pg/ml）3.82±0.40 10.09±2.96*7.04±1.77*6.68±0.64*IL-6（pg/ml）153.3±11.6 193.9±15.4#221.7±27.3#173.8±32.5

3 討 論

免疫應(yīng)答和誘發(fā)的炎癥在缺血性腦損傷中起關(guān)鍵作用［5，6］。卒中急性期的白細(xì)胞介素-1（IL-1）可以激活小膠質(zhì)細(xì)胞并募集炎性細(xì)胞以傳播炎癥，這可能導(dǎo)致卒中后細(xì)胞損傷及死亡［7］。小膠質(zhì)細(xì)胞是大腦中的主要免疫細(xì)胞，在缺血性卒中后數(shù)小時(shí)內(nèi)被激活，并產(chǎn)生細(xì)胞因子和趨化因子［8］。有研究表明，小膠質(zhì)細(xì)胞與神經(jīng)元的相互作用是缺血性腦損傷的最重要因素之一［5］。因此，小膠質(zhì)細(xì)胞通常用于研究缺血性卒中方面的炎癥反應(yīng)。而對(duì)于缺血后小膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生促炎因子的干預(yù)或許能成為缺血性腦損傷保護(hù)神經(jīng)元的新方法。

體外小膠質(zhì)細(xì)胞氧糖剝奪再?gòu)?fù)糖、復(fù)氧是模擬體內(nèi)腦缺血再灌注損傷后炎癥反應(yīng)的模型之一。在這一模型中，氧糖剝奪的時(shí)間是關(guān)鍵，氧糖剝奪時(shí)間太長(zhǎng)，小膠質(zhì)細(xì)胞容易死亡；反之，氧糖剝奪時(shí)間太短，則可能無(wú)法有效地誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生炎癥反應(yīng)。因此，對(duì)于氧糖剝奪再灌注后小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥反應(yīng)的相關(guān)研究是很有必要的，其中氧糖剝奪的時(shí)間窗是關(guān)鍵的研究要點(diǎn)，是后續(xù)研究小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥反應(yīng)機(jī)制的基礎(chǔ)。

小膠質(zhì)細(xì)胞在不同的條件下會(huì)分化成不同的亞型，即M1 和M2 型M1 型主要表達(dá)IL-1β、IL-6以及iNOS 等致炎因子，從而誘發(fā)炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致組織損傷；而M2 型主要表達(dá)TGF-13、IL-10 等因子，其主要起免疫保護(hù)作用。在這項(xiàng)研究中，我們通過(guò)構(gòu)建體外氧糖剝奪再灌注模型（OGD/R），觀察到OGD/R 后小膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)學(xué)的改變是隨著OGD 時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸加重的，主要表現(xiàn)為細(xì)胞突觸剝離及固縮死亡。OGD 6 小時(shí)后小膠質(zhì)細(xì)胞出現(xiàn)明顯的損傷，甚至大量死亡，而OGD 2 小時(shí)細(xì)胞損傷輕微，說(shuō)明合適的OGD 時(shí)間是至關(guān)重要的。我們進(jìn)一步研究揭示了不同時(shí)長(zhǎng)OGD 后復(fù)糖復(fù)氧均可誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞的炎癥反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)在OGD 2h 后小膠質(zhì)細(xì)胞的炎癥反應(yīng)已被激活，此時(shí)炎癥因子IL-6，IL-1β 分泌明顯增加，OGD 6h 后因小膠質(zhì)細(xì)胞不能耐受長(zhǎng)時(shí)間的缺氧缺糖而大量死亡，故炎癥因子的分泌反而急劇減少。我們的研究表明，OGD 可誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞分化為M1 型，并分泌IL-1β？IL-6，導(dǎo)致炎癥反應(yīng)的發(fā)生。另外，我們發(fā)現(xiàn)小膠質(zhì)細(xì)胞經(jīng)過(guò)不同時(shí)長(zhǎng)OGD 后均未見(jiàn)TNF-α 表達(dá)升高，說(shuō)明小膠質(zhì)細(xì)胞激活后并不增加TNF-α 的分泌，TNF-α 并不在OGD 誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥反應(yīng)中起作用。該結(jié)果提供了可靠的證據(jù)，表明OGD 可以在體外較好地誘導(dǎo)出炎癥，同時(shí)結(jié)合小膠質(zhì)細(xì)胞的形態(tài)學(xué)改變，我們認(rèn)為OGD2 小時(shí)對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞的損傷較少，而且能有效地誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)，故推薦在體外OGD 模型研究中，OGD 的時(shí)長(zhǎng)采用2 小時(shí)為宜。

綜上所述，氧糖剝奪2-4 小時(shí)后再?gòu)?fù)糖復(fù)氧能較好地在體外誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥反應(yīng)，且細(xì)胞損傷較少。這對(duì)于我們后續(xù)選擇其他干預(yù)措施控制神經(jīng)炎癥及對(duì)缺血性腦損傷中神經(jīng)元保護(hù)的研究具有重要參考意義。