鄒子俊 王琴 李方義 周明根 李偉超 鄭煜凱 何志捷*

在膿毒癥發(fā)生發(fā)展過程中，肺損傷常最早出 現(xiàn)。膿毒癥急性肺損傷（ALI）的共同特征是肺上皮-血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷、炎癥細(xì)胞浸潤、肺水腫［1］。研究顯示，肺血管內(nèi)皮細(xì)胞（VEC）屏障完整性是維持正常肺微循環(huán)滲透性的重要基礎(chǔ)，而中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等炎癥細(xì)胞的參與是膿毒癥ALI 中VEC 屏障損傷的重要機(jī)制［2］。然而，在粒細(xì)胞缺乏患者中，膿毒癥同樣可以導(dǎo)致ALI 的發(fā)生。研究粒細(xì)胞缺乏時膿毒癥ALI 中導(dǎo)致VEC 損傷的機(jī)制，能為這類患者膿毒癥ALI 治療提供理論基礎(chǔ)。P2X7 受體（P2X7R）是嘌呤能受體P2X 家族中非常獨特的一個亞類，ATP 刺激打開P2X7 離子通道受體，通過多種信號通路，參與炎癥反應(yīng)或細(xì)胞凋亡［3］。本研究探討血管內(nèi)皮細(xì)胞P2X7 在膿毒癥ALI 中VEC 炎性損傷的作用，現(xiàn)報告如下。

1 材料和方法

1.1 人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC）體外培養(yǎng)和鑒定將HUVEC（ATCC 公司）加入至37℃DMEM 培養(yǎng)基6 ml 中，離心8 min、1500 rpm，棄上清液，加HUVECs 培養(yǎng)液，接種于明膠溶液包被的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。取P2 代細(xì)胞，用0.25%EDTA-胰蛋白酶（GIBCO 公司）消化后，接種于蓋玻片，4%多聚甲醛固定，加3% H2O2，37℃孵育15 min，去除過氧化物酶活性，PBS 沖洗后山羊血清封閉15 min。加1∶50 的兔抗人Ⅷ因子抗體為一抗，陰性對照則不加一抗。4℃過夜，PBS 洗滌，加二抗（含生物素），37℃孵育20 min，PBS 沖洗，DAB 染色，鏡下觀察到胞質(zhì)呈棕色，為陽性染色，清水沖洗。傳代至第三代用于實驗研究。

1.2 細(xì)胞分組、處理及檢測隨機(jī)分為膿毒癥組（HUVECs+1 μg/ml LPS）、對照組（HUVECs+等量NS）、拮抗劑組（HUVECs+等量50 μmol/L A438079（P2X7 阻斷劑，Abcam 公司）），處理后分別于6h、12h、24h 時間點收集細(xì)胞。（1）RT-PCR 法檢測各組P2X7 mRNA 表達(dá)：提取總RNA 后，P2X7 引物序列 為：（P2X7 F：CTGGAACGATGTCTTGCAGTAT；P2X7 R：CCCACTTGACGGTGCCATAAT。）擴(kuò)增片段長度為495 bp。甘油醛三磷酸脫氫酶（GAPDH）為內(nèi)參照，引物序列為：（GAPDH F：CGTGCC?GCCTGGAGAAACCTG； GAPDH R： AGAGT?GGGAGTTGCTGTTGAAGTCG；）擴(kuò)增片段長度為983bp。用凝膠影象分析軟件測定每個條帶的光密度值，并計算樣品P2X7 與GAPDH 條帶的光密度比值。（2）采用北京達(dá)科為生物技術(shù)有限公司提供的ELISA 試劑盒，檢測各組TNF-α、IL-1β、IL-6 水平。（3）采用bioss 公司生產(chǎn)的VEGF-1 抗體試劑盒，應(yīng)用免疫組化法檢測各組VEGF-1 蛋白表達(dá)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS16.0 統(tǒng)計軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，以P<0.05 為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 HUVEC 的觀察及鑒定HUVEC 細(xì)胞呈緊密融合生長，排列類似“鋪路石”。細(xì)胞呈多角形，邊界清楚，胞漿豐富；可見細(xì)胞核仁1-2 個，在鏡下呈圓形，核內(nèi)染色質(zhì)較稀疏。傳代培養(yǎng)時，30 min左右開始貼壁生長，細(xì)胞相互連接。免疫細(xì)胞化學(xué)染色顯示，HUVECs 均著色，胞質(zhì)呈棕黃色強(qiáng)陽性染色，陰性對照無著色（圖1）。

圖1 HUVECs 免疫細(xì)胞化學(xué)染色觀察（×400，光學(xué)顯微鏡）

2.2 P2X7 mRNA 的表達(dá)變化與對照組相比，膿毒癥組6 h 表達(dá)明顯增加，12 h 達(dá)高峰（P<0.05）。與膿毒癥組相比，拮抗劑組各時點表達(dá)均有下降（P<0.05）。（見圖2）

圖2 實驗各組肺組織P2X7 mRNA 的表達(dá)水平

2.3 TNF-α、IL-1β、IL-6 水平變化在各時點上TNF-α、IL-6、IL-1β 表達(dá)膿毒癥組均高于對照組（P<0.05）；而拮抗劑組均低于膿毒癥組（P<0.05）。膿毒癥組和拮抗劑組IL-6 表達(dá)逐漸增高，12h 達(dá)高峰；TNF-α 及IL-1β 表達(dá)在6h 達(dá)到高峰，之后逐漸降低，峰值拮抗組均低于膿毒癥組（P<0.05）。見圖3-5。

圖3 實驗各組TNF-α 水平

圖4 實驗各組IL-1β 水平

圖5 實驗各組IL-6 水平

2.4 VECF-1 水平變化VEGF-1 在HUVEC 細(xì)胞膜被染成棕黃色顆粒，正常HUVECs 表達(dá)交低，以胞膜為主，胞核無表達(dá)；與對照組比較，膿毒癥組胞膜的陽性顆粒顏色明顯變深，陽性細(xì)胞數(shù)明顯增高。與膿毒癥組比較，拮抗劑組胞膜陽性顆粒顏色明顯變淺。見圖6。

3 討 論

VEC 在維持肺內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定中起重要作用，肺VEC 損傷不僅是肺水腫產(chǎn)生的重要機(jī)制，也是炎癥反應(yīng)發(fā)生及放大的重要病理生理基礎(chǔ)。在中性粒細(xì)胞缺乏患者中，肺VEC 損傷被目前認(rèn)為是膿毒癥ALI 的始動環(huán)節(jié)［4］。Ozen M 等［5］的研究顯示炎癥反應(yīng)中肺VEC P2X7 表達(dá)明顯增加。本研究發(fā)現(xiàn)：在LPS 誘導(dǎo)的急性炎癥反應(yīng)下，VEC P2X7表達(dá)明顯增加，TNF-α、IL-1β、IL-6 釋放增加；阻斷P2X7 顯示阻斷VEC P2X7 可減少肺VEC 炎癥因子釋放。肺VEC 損傷主要由第一次打擊后聚集在肺組織內(nèi)的炎癥細(xì)胞在激活狀態(tài)下產(chǎn)生大量炎癥介質(zhì)所致。然而，在中性粒細(xì)胞缺乏患者中，肺VEC 損傷卻佷可能是膿毒癥ALI 的始動環(huán)節(jié)［4］。本研究顯示，在缺乏粒細(xì)胞等炎癥細(xì)胞參與狀態(tài)下，LPS 可誘導(dǎo)VEC 產(chǎn)生炎癥反應(yīng)，釋放炎癥因子，阻斷VEC P2X7 明顯減少炎癥因子釋放。即在膿毒癥ALI 早期，即使在缺乏炎癥細(xì)胞介導(dǎo)之前，VEC 也可以以效應(yīng)細(xì)胞致P2X7 表達(dá)增多，介導(dǎo)多種炎癥因子的釋放，同時又是這些炎癥因子作用的靶細(xì)胞，導(dǎo)致VEC 損傷。由此我們推斷肺VEC P2X7 的表達(dá)增加可能是中性粒細(xì)胞缺乏患者發(fā)生ALI 的重要機(jī)制之一。另外，本研究還發(fā)現(xiàn)，在無炎癥細(xì)胞參與下，VEC P2X7 與VEGF-1 表達(dá)存在一定關(guān)系。VEGF 不僅在血管形成中起重要作用，同時也參與血管滲透性的改變［6］。臨床上VEGF-1 大量輸入人體可直接導(dǎo)致肺VEC 滲透性明顯增加，最終導(dǎo)致ALI 的發(fā)生，這也被認(rèn)為是粒細(xì)胞缺乏患者發(fā)生輸血相關(guān)ALI 的重要機(jī)制［7］。在粒細(xì)胞缺乏患者中，炎癥細(xì)胞包括跨血管內(nèi)皮遷移能力在內(nèi)的功能減退，需要肺VEC 通透性進(jìn)一步增加，才能使這些功能減退的炎癥細(xì)胞通過跨細(xì)胞或細(xì)胞旁路途徑通過肺VEC 屏障，這也可能是粒細(xì)胞缺乏患者發(fā)生ALI 的關(guān)鍵機(jī)制之一。

因此，在缺乏粒細(xì)胞等炎癥細(xì)胞參與狀態(tài)下，肺VEC P2X7 通過TNF-α、IL-1β、IL-6 多種炎癥因子和血管滲透因子VEGF-1 產(chǎn)生增多，介導(dǎo)肺VEC屏障的損傷，促進(jìn)ALI 的發(fā)生，這可能中性粒細(xì)胞缺乏患者發(fā)生急性肺損傷的重要機(jī)制之一。但本研究只是體外實驗水平顯示LPS 誘導(dǎo)肺VEC P2X7的過表達(dá)可能是在中性粒細(xì)胞缺乏患者ALI 中起重要作用，存在一定局限性，確切結(jié)論有待進(jìn)一步體外實驗研究證實。