范金波，安佳鑫，麻 奧，呂長鑫

（1.渤海大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，遼寧錦州 121013；2.生鮮農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工及安全控制技術(shù)國家地方聯(lián)合工程研究中心，遼寧錦州 121013）

0 引言

咖啡酸屬于典型的酚酸類物質(zhì)，是羥基肉桂酸的一種，在中草藥植物杜仲、金銀花、仙草和升麻等中常見，在咖啡豆、葡萄酒、卷心菜、橄欖油等中廣泛存在[1-2]?？Х人?，化學(xué)名為 3-（3，4- 二羥基苯基）-丙烯酸，易溶于乙醇，微溶于水。研究報道咖啡酸具有較強的抗氧化、抗炎、抗腫瘤等活性[3-5]。上述研究主要集中在生物活性方面，但是其在人體內(nèi)的傳輸機制及其與相關(guān)蛋白的相互作用的研究較少。熒光光譜法已經(jīng)廣泛用于小分子與蛋白質(zhì)相互作用的相關(guān)研究，范金波采用熒光光譜法研究了咖啡酸與胰脂肪酶的相互作用，結(jié)果表明咖啡酸的加入產(chǎn)生了熒光猝滅，咖啡酸有效地抑制了胰脂肪酶活性[6]。人血清白蛋白是血液中的主要成分，牛血清白蛋白與人血清白蛋白具有高度的同源性，因此試驗研究常用BSA代替來研究血清白蛋白與藥物的相互作用。BSA是一種單體蛋白由三個結(jié)構(gòu)域（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ）組成，每個結(jié)構(gòu)域又包含兩個亞結(jié)構(gòu)域（A，B），BSA中兩個疏水腔分別在ⅡA和ⅢA，形成兩個結(jié)合位點 Sudlow's sitesⅠ和 sudlow's sites Ⅱ[7]。當(dāng)藥物進入人體后，通過血漿中蛋白的存儲和運輸才能到達受體部位發(fā)揮其藥理作用，因此，研究藥物與蛋白的相互作用，有助于了解藥物在人體內(nèi)的傳輸和分布情況，對于闡明藥物的作用機制有非常重要的意義。本文以咖啡酸為研究對象，通過熒光光譜法和分子對接技術(shù)研究了它們的相互作用機制，為咖啡酸的進一步開發(fā)和應(yīng)用提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

牛血清白蛋白（BSA，99.9%，北京百靈威科技有限公司）；2，4，6-三吡啶基三嗪（TPTZ，99%，阿拉丁試劑有限公司）；2，2-聯(lián)苯基-1-苦基肼基（DPPH，99.5%，北京百靈威科技有限公司）；TRIS（北京索萊寶科技有限公司）；咖啡酸 （99.9%，北京百靈威科技有限公司）；硫酸鎂、氯化鐵、硫酸銅、硫酸錳、氯化鈣、濃鹽酸等均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

F-7000熒光分光光度計（日本日立高新技術(shù)公司）；KQ-500DE數(shù)控超聲清洗儀（昆山市超聲儀器有限公司）；KJ-5A多頭磁力攪拌器（金壇市科析儀器有限公司）；HH-6數(shù)顯電子恒溫水浴鍋（常州國華電器有限公司）；ML104/02電子天平（梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司）；FE20試驗室PH計（梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司）；UV-2700紫外-可見光分光光度計（日本SHIMADZU公司）；BCD-529WBSN型冰箱（青島海爾股份有限公司）；DL-CJ-2N型超凈工作臺（東聯(lián)哈爾（北京）儀器制造有限公司）；Milli-Q Reference型超純水機（德國默克密理博有限公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 咖啡酸與牛血清白蛋白的熒光光譜研究

在兩個1 cm的比色皿中各加3 mL Tris-HCL緩沖液（pH 7.4）然后加入 30 μL 1.2×10-4mol/L的BSA溶液，分別在25 ℃和37 ℃（水浴鍋加熱）條件下放置5 min。熒光光度計激發(fā)和發(fā)射狹縫均設(shè)定為5 nm，固定激發(fā)波長280 nm，在290～450 nm范圍內(nèi)掃描其發(fā)射波長，得到熒光光譜。然后向比色皿中依次加入7.2×10-4mol/L的咖啡酸溶液混合均勻（使得溶液中咖啡酸的濃度依次為 0×10-6、1.2×10-6、2.4×10-6、3.6×10-6、4.8×10-6、6.0×10-6、7.2×10-6、8.4×10-6、9.6×10-6mol/L），每次混勻后都分別在25 ℃和37 ℃條件下放置5 min，掃描出熒光光譜。整合后得到25 ℃和37 ℃下的咖啡酸與BSA的熒光猝滅光譜圖。

1.3.2 咖啡酸與牛血清白蛋白的同步熒光

在同步熒光光譜試驗中，在37 ℃的條件下按照1.3.1的試驗方法（溶液的量與濃度均相同），激發(fā)和發(fā)射波長的差值分別為Δλ=15 nm和Δλ=60 nm，掃描其同步熒光光譜。整合后得到37 ℃下的咖啡酸與BSA的同步熒光光譜圖。

1.3.3 共存金屬離子的影響

取用Tris-HCl溶液配制出的100 mL濃度為4.0×10-4mol/L 的 Mg2+、Fe3+、Cu2+、Mn2+、Ca2+溶液。在37 ℃條件下按照上述試驗方法掃描出牛血清白蛋白的熒光光譜，加入0.3 mL配制好的Mg2+溶液混勻放置5 min，上文相同試驗方法依次加入20 μL 2.0×10-4mol/L的咖啡酸溶液得出熒光光譜圖。然后用相同的試驗方法做出Fe3+、Cu2+、Mn2+、Ca2+的熒光光譜圖。

1.3.4 抗氧化活性的測定

1.3.4.1 DPPH法

DPPH在有機溶劑乙醇中是一種穩(wěn)定的自由基，其孤對電子在517 nm附近有最大吸收值。當(dāng)有自由基清除劑存在時，由于與其單電子配對而使其吸收逐漸消失，通過測定吸收減弱的程度，可評價自由基清除劑的活性[8]?？捎梅止夤舛扔嬤M行快速的定量分析。用電子天平稱取0.003 9 g DPPH溶于無水乙醇并定容至100 mL作為DPPH工作液。同時用去離子水配制0.05 mg/mL咖啡酸溶液，以及BSA與咖啡酸質(zhì)量比分別為 5：1，10：1，15：1 混合組溶液作為待測物，分別取2 mL DPPH工作液于5只試管中加入各待測物100 μL，以加入100 μL去離子水作為空白對照，避光靜置30 min，然后用紫外可見光分光光度計于517 nm測吸光度，每個樣品測定3次[9]。

根據(jù)DPPH自由基清除率計算公式：

式中 K——樣品對DPPH自由基的清除率；

Ai——加入待測物的吸光度；

A0——加入去離子水作為空白對照組的吸光度。

1.3.4.2 FRAP法

FRAP法常被作為鐵離子還原能力指標(biāo)用于試驗之中。Fe3+-吡啶三吖嗪可被抗氧化劑還原為二價鐵形式，使得溶液呈現(xiàn)出藍色，并于593 nm處具有最大吸收，根據(jù)吸光度大小計算樣品抗氧化活性的強弱[10]。很多文獻中都有介紹FRAP工作液的配制方法，按照所述的方法我們配制出3種溶液，然后把3種溶液按照10：1：1的比例配制成FRAR工作液。然后再以去離子水配制的0.05 mg/mL咖啡酸溶液及BSA與咖啡酸質(zhì)量比分別為 5：1，10：1，15：1 混合組溶液作為待測物，分別取2 mL FRAP工作液于5只試管中加入各待測物 100 μL，37 ℃中放置 10 min，于 593 nm測吸光度。每個樣品測定3次。

1.3.5 分子對接

利用Discovery Studio 軟件和Autodock vina軟件研究咖啡酸與BSA相互作用機制。BSA的晶體結(jié)構(gòu)來源于RCSB PDB數(shù)據(jù)庫（www.rcsb.org，ID CODE：4OR0），4OR0 共 A、B 兩條鏈，提取A鏈后刪除水分、結(jié)合物。使用Cdocker進行分子對接，分子對接過程中保持蛋白分子的剛性結(jié)構(gòu)不變，配體構(gòu)象發(fā)生改變，通過計算配體受體之間的非鍵相互作用，以Cdocker Interaction Energy（-ECD）表示結(jié)合自由能，根據(jù)-ECD值選取最優(yōu)構(gòu)象進行分析，具體對接方法參照文獻[11]。

1.4 統(tǒng)計分析

每個試驗重復(fù)3次，結(jié)果表示為Means±S.D.。采用Origin V8.0做圖。采用SAS 8.0 軟件（SAS Institute Inc.，NC，美國）的一般線性模型（GLM）進行方差分析。鄧肯氏多重檢驗用來確定數(shù)據(jù)間的差異，顯著水平為P＜0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 咖啡酸與牛血清白蛋白的結(jié)合反應(yīng)

牛血清白蛋白分子中內(nèi)源性熒光主要來自于色氨酸和酪氨酸殘基[12-13]。不同溫度下咖啡酸對BSA熒光猝滅效應(yīng)如圖1所示。

從圖1中可知，兩個溫度下，隨著咖啡酸的逐漸加入，BSA在330 nm的熒光發(fā)射峰強度明顯減弱，而峰形基本保持不變，呈現(xiàn)出典型的熒光猝滅現(xiàn)象，說明咖啡酸與BSA之間存在著相互作用；不同溫度下咖啡酸對BSA的熒光猝滅圖譜相似。圖中熒光發(fā)射波長出現(xiàn)了輕微紅移，說明咖啡酸與BSA之間生成復(fù)合物，并且復(fù)合物的生成使BSA的結(jié)構(gòu)產(chǎn)生了微弱的改變。

熒光猝滅主要包括動態(tài)猝滅和靜態(tài)猝滅2 種類型[14]，動態(tài)猝滅過程遵循 Stern-Volmer方程[15-16]：

式中 F0，F(xiàn)——不存在和存在猝滅劑時的熒光強度；

Kq——雙分子猝滅常數(shù)；

τ0——不存在猝滅劑時熒光體的平均壽命（一般約為 1×10-8s[17-18]）；

Ksv——動態(tài)猝滅常數(shù)；

[Q]——猝滅劑的濃度。

對于動態(tài)猝滅作用，升高溫度Kq隨之增大；而靜態(tài)猝滅則相反，溫度升高，Kq也將隨之減小。由文獻可知猝滅劑對熒光分子最大動態(tài)擴散猝滅常數(shù)為 2.0×1010L/mol/s[19]。由表 1 可以看出兩2個溫度下猝滅常數(shù)均大于2.0×1010L/mol/s，且Kq隨著溫度的升高而減小。因此，咖啡酸對BSA的熒光猝滅屬于靜態(tài)猝滅，即反應(yīng)形成了新的復(fù)合物。

表1 咖啡酸對BSA熒光猝滅Stern-Volmer方程和猝滅常數(shù)

2.2 咖啡酸與牛血清白蛋白的結(jié)合常數(shù)及結(jié)合位點

咖啡酸對BSA的猝滅屬于靜態(tài)猝滅，結(jié)合位點和猝滅劑濃度滿足以下關(guān)系[20]：

式中 Ka——結(jié)合常數(shù)；

n——結(jié)合位點數(shù)；

[Q]——咖啡酸溶液的濃度。

以 lg[（F0-F）/F]對 lg[Q]做雙對數(shù)擬合可以得到咖啡酸與BSA結(jié)合的Ka和n值。由表2可知咖啡酸與BSA有很強的結(jié)合能力，且只形成了一個結(jié)合位點，而隨著溫度升高，咖啡酸與BSA之間的作用減弱，結(jié)合常數(shù)與結(jié)合位點都減小，此結(jié)果與熱力學(xué)參數(shù)相一致，結(jié)合反應(yīng)是放熱反應(yīng)，反應(yīng)溫度升高不利于反應(yīng)的進行。

表2 咖啡酸與BSA的結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點數(shù)

2.3 咖啡酸與牛血清白蛋白的結(jié)合作用力類型

小分子與蛋白質(zhì)分子間的作用力類型包括氫鍵、范德華力、靜電相互作用、疏水相互作用和共價結(jié)合等[21]。根據(jù)反應(yīng)前后的熱力學(xué)中的焓變ΔH和熵變ΔS的相對大小可以判斷二者之間的主要作用力類型[22]。當(dāng)溫度變化不大時可把焓變ΔH看成一個常量，根據(jù)熱力學(xué)參數(shù)方程進行計算：

表3 咖啡酸與BSA結(jié)合熱力學(xué)參數(shù)

根據(jù)熱力學(xué)規(guī)律：當(dāng)ΔH＜0，ΔS＞0主要表現(xiàn)為靜電作用力或者疏水作用力，且ΔH/ΔG ＞80%，說明焓驅(qū)動，作用力以靜電相互作用為主疏水相互作用為輔[23]。加之，咖啡酸結(jié)構(gòu)中含有多個羥基，能夠比較容易的與BSA之間形成氫鍵，氫鍵作用力的大小與分子中的羥基數(shù)目存在密切的關(guān)聯(lián)，而結(jié)合過程中ΔH的值也說明了分子與BSA之間的互相作用是較弱的。ΔG＜0，可知兩者之間的結(jié)合反應(yīng)是自發(fā)過程，且二者之間的反應(yīng)是個放熱過程，升溫則不利于二者的結(jié)合。

2.4 咖啡酸對牛血清白蛋白構(gòu)象的影響

同步熒光光譜常常用來研究活性分子對蛋白質(zhì)構(gòu)象的影響。當(dāng)Δλ=15 nm、Δλ=60 nm分別顯示酪氨酸殘基和色氨酸殘基特性熒光[24]。酪氨酸殘基和色氨酸殘最大發(fā)射波長與其所處的微環(huán)境有關(guān)，因此可以考察蛋白質(zhì)的構(gòu)象變化[25]。試驗中，固定BSA的濃度1.2×10-6mol/L，37 ℃條件下逐漸增加咖啡酸的濃度掃描體系的同步熒光光譜見圖2。由圖2可知，酪氨酸、色氨酸殘基的熒光強度都隨著咖啡酸濃度的增加而不斷降低，當(dāng)Δλ=15 nm，酪氨酸殘基熒光峰的最大發(fā)射波長無明顯移動；當(dāng)Δλ=60 nm時，色氨酸殘基的最大發(fā)射波長有一定程度的紅移，說明BSA內(nèi)的疏水環(huán)境的極性增強，疏水性減弱，肽鏈的伸展程度有所增強[26]。因此二者的結(jié)合影響了BSA的構(gòu)象，且主要是影響了BSA中色氨酸殘基所處的微環(huán)境。即在咖啡酸的存在下，BSA的構(gòu)象發(fā)生了變化。

2.5 共存金屬離子的影響

人體中金屬離子的含量極少，但與人體的生理功能有著密切的關(guān)系。研究人體內(nèi)的主要金屬離子對小分子與蛋白質(zhì)結(jié)合的影響非常重。本文考察了 Mg2+、Fe3+、Cu2+、Mn2+、Ca2+5 種金屬離子對咖啡酸與BSA之間相互作用的影響。由表4可知，Mg2+、Fe3+、Cu2+、Mn2+、Ca2+金屬離子的存在不同程度抑制了咖啡酸與BSA的結(jié)合，抑制能力排序為Ca2+＞Fe3+＞Mn2+＞Cu2+＞Mg2+。這些金屬離子的存在，對咖啡酸與BSA的作用存在競爭作用，二者的結(jié)合常數(shù)減小，從而減小了藥物的釋放時間，使得藥物短時間內(nèi)的作用強度增加，這在臨床治療上短時間內(nèi)提高治療效果是具有參考價值的。

表4 金屬離子存在時對咖啡酸與BSA結(jié)合的影響

2.6 BSA對咖啡酸抗氧化活性的影響

抗氧化活性試驗中，咖啡酸與BSA結(jié)合前后的抗氧化活性變化如圖3、圖4所示。如圖3所示，隨著BSA濃度的增加，咖啡酸DPPH自由基清除活性顯著性降低（P＜0.05），表明BSA的加入產(chǎn)生了咖啡酸-BSA復(fù)合物，復(fù)合物的形成掩蔽了咖啡酸的活性基團，進一步證實了BSA與咖啡酸的結(jié)合改變了咖啡酸的結(jié)構(gòu)特性，形成咖啡酸-BSA復(fù)合物有效地保護了咖啡酸的活性。

通過FRAP法檢測BSA對咖啡酸抗氧化活性的影響，其結(jié)果見圖4。隨著BSA濃度增加，吸光度值顯著降低，同樣驗證了BSA與咖啡酸結(jié)合后顯著影響了咖啡酸的總抗氧化能力。綜上可知，體系中BSA與咖啡酸同時存在時，其會發(fā)生相互結(jié)合，結(jié)合反應(yīng)顯著的影響咖啡酸的物理特性，而結(jié)合反應(yīng)后BSA物理特性如何發(fā)生變化還有待進一步的研究。

2.7 分子對接

分子對接研究表明多酚與BSA結(jié)合位點大部分可能存在于TRP213附近[27]。兩種分子模擬方法得到最優(yōu)構(gòu)象如表5所示。分子對接結(jié)果表明咖啡酸結(jié)合位點位于內(nèi)部疏水區(qū)sudlow's siteⅠ（ⅡA），在TRP213附近，位點5?范圍氨基酸殘基見表5，可以看出2種模擬方法結(jié)果相一致，同樣圖5（c）表明2種對接方法結(jié)合位點基本重合.分子對接與熒光猝滅結(jié)合常數(shù)的差異主要來源于兩種試驗不同的相，顯然緩沖溶液中溶劑化蛋白與分子模擬中X-ray晶體結(jié)構(gòu)不同。在常態(tài)下，BSA三級結(jié)構(gòu)內(nèi)部含有疏水基團，而極性基團則多出現(xiàn)在表面。氫鍵可能發(fā)生在CA的羥基與BSA的多肽鏈之間；另外，配體分子的芳香結(jié)構(gòu)在配體-蛋白結(jié)合過程中起到非常重要的作用，因為苯基和結(jié)合位點內(nèi)主要疏水氨基酸殘基形成疏水相互作用，因此咖啡酸與BSA結(jié)合的主要驅(qū)動力為氫鍵、靜電相互作用和疏水相互作用，結(jié)合位點為siteⅠ，此結(jié)果與熒光分析結(jié)果一致。

表5 CA-BSA結(jié)合位點氨基酸殘基及結(jié)合自由能

3 結(jié)語

論文采用熒光光譜法結(jié)合分子對接法研究了咖啡酸與BSA之間的相互作用。研究發(fā)現(xiàn)，咖啡酸對BSA存在內(nèi)源熒光猝滅，通過stern-volmer分析，猝滅屬于靜態(tài)猝滅，即兩者結(jié)合生成咖啡酸-BSA復(fù)合物。熱力學(xué)分析表明，結(jié)合焓增驅(qū)動下自發(fā)進行，二者結(jié)合的主要作用力為離子相互作用。同時利用同步熒光光譜研究了咖啡酸與BSA結(jié)合對BSA構(gòu)象的影響，結(jié)果表明二者結(jié)合增大了TRP213附近微環(huán)境的極性，也就是BSA蛋白疏水區(qū)展開。人體內(nèi)必需金屬離子一定程度上抑制了二者結(jié)合，從而縮短活性成分的釋放時間，臨床上具有積極意義?？寡趸钚栽囼灴芍獌烧叩慕Y(jié)合有效的保護了咖啡酸的抗氧化活性。分子對接結(jié)果表明兩者結(jié)合的主要驅(qū)動力為氫鍵、靜電相互作用和疏水相互作用，結(jié)合位點為siteⅠ。論文為闡明咖啡酸與蛋白質(zhì)結(jié)合的分子機制，對于開發(fā)活性成分有效的遞送載體非常重要。