蔣雅茜，胡文鋒，李 昕，楊靜蕓，劉怡君，全沁果

（1.湖南科技學(xué)院 化學(xué)與生物工程學(xué)院，湖南永州 425100；2.湖南省銀杏工程技術(shù)研究中心，湖南 永州 425100；3.湘南優(yōu)勢(shì)植物資源綜合利用湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南永州 425100）

0 引言

食品行業(yè)每年由腐敗變質(zhì)造成的經(jīng)濟(jì)損失接近20%[1]，因此，食品的防腐保鮮在食品流通與儲(chǔ)藏過(guò)程中備受重視。添加食品防腐劑是控制食品劣變的有效手段之一，其效果理想且成本合理，根據(jù)其來(lái)源不同可歸為化學(xué)防腐劑和天然防腐劑兩類(lèi)[2]。化學(xué)防腐劑是目前防腐劑產(chǎn)品中的主流，其中亞硝酸鹽是最具代表性的一類(lèi)，但已證實(shí)亞硝酸鹽在人體內(nèi)可轉(zhuǎn)化為具有致癌性的亞硝胺[3]。天然防腐劑在發(fā)揮防腐功能的同時(shí)，不僅不會(huì)產(chǎn)生對(duì)人體健康具有危害的代謝產(chǎn)物，還能為人體提供一定的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，近年來(lái)受到了消費(fèi)者的追捧[4]。目前，天然防腐劑主要取材于動(dòng)物、植物和微生物等[5]。其中，來(lái)源于植物的天然防腐劑由于其資源廣闊、分離過(guò)程簡(jiǎn)單、純度高等特點(diǎn)受到了更多的關(guān)注。若將天然防腐劑取材于農(nóng)產(chǎn)品加工副產(chǎn)物，在保持天然防腐劑上述優(yōu)點(diǎn)的同時(shí)又可縮小與化學(xué)防腐劑相比的成本劣勢(shì)，則具有更高的市場(chǎng)價(jià)值。

江永香柚是湖南省永州市江永縣經(jīng)移栽的特有沙田柚品種，和香芋、香姜、香米、香菇并稱(chēng)“江永五香”，種植面積較大，每年有大量柚皮被隨意丟棄，造成資源浪費(fèi)和環(huán)境污染[6]。近年來(lái)，江永香柚皮、籽中的揮發(fā)油、多糖、檸檬苦素等成分得到了科研人員的關(guān)注，但其具體活性以及產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用還有待進(jìn)一步研究[7-9]。而該過(guò)程需要重點(diǎn)考慮提取活性成分技術(shù)路線的放大難度，亦要權(quán)衡企業(yè)對(duì)開(kāi)發(fā)成本的接受能力。為此，本文擬通過(guò)響應(yīng)面法建立江永香柚皮水提參數(shù)與提取物對(duì)金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，S.aureus）抑制作用的模型，并將其應(yīng)用到液體食品中考察其實(shí)際抑菌效果，可為開(kāi)發(fā)液體食品天然防腐劑的選材提供一種新的思路。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

江永香柚皮（周邊集市收集，經(jīng)洗凈后自然晾干，于60 ℃下干燥至恒重，粉碎過(guò)篩后密封儲(chǔ)存）；S.aureus，本校微生物試驗(yàn)室保存；鹽水溶液，0.15 mol/L的NaCl；酸梅湯、純牛奶、橙汁、黃豆醬、食用油購(gòu)于永州市零陵區(qū)河西菜市場(chǎng)，珍珠奶茶購(gòu)于湖南科技學(xué)院周邊奶茶店；平板計(jì)數(shù)培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)肉湯基料，購(gòu)自環(huán)凱微生物科技有限公司；其余試劑均為分析純，購(gòu)自天津市大茂化學(xué)試劑廠。

1.2 儀器與設(shè)備

01J2003-04型立式壓力蒸汽滅菌器筒（上海博迅實(shí)業(yè)有限公司）、PHS-3C精密pH計(jì)（大連中匯達(dá)科技儀器有限公司）、DZF-6051型真空干燥箱（上海賀德試驗(yàn)設(shè)備有限公司）、WG-71 電熱鼓風(fēng)干燥箱（天津市泰斯特儀器有限公司）、SW-CJ-2潔凈工作臺(tái)（蘇州安泰空汽技術(shù)有限公司）、FZ-102 植物粉碎機(jī)（上海勝啟儀器儀表有限公司）、HWS 智能型恒溫恒濕培養(yǎng)箱（寧波市科技園區(qū)新江南儀器有限公司），DT5-6A型臺(tái)式離心機(jī)（北京時(shí)代北利離心機(jī)有限公司）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 S.aureus培養(yǎng)物的制備

在無(wú)菌條件下挑取適量S.aureus接入50 mL經(jīng)滅菌的營(yíng)養(yǎng)肉湯，置于恒溫恒濕培養(yǎng)箱中。在200 r/min下培養(yǎng)12 h后，將所得物于4 ℃、10 000 r/min離心5 min，將其經(jīng)無(wú)菌生理鹽水洗滌2次后制備成約109cfu/mL的菌懸液備用。

1.3.2 抑菌活性的測(cè)定

將干凈的濾紙經(jīng)打孔器統(tǒng)一制成直徑約4 mm的圓片，滅菌后分別將其置于提取液和蒸餾水中浸泡30 min，瀝去多余的試液后用無(wú)菌鑷子夾至涂好菌液的培養(yǎng)基平板上（100 μL菌懸液），每個(gè)處理組按“+”形對(duì)稱(chēng)放置4張濾紙片（平行3次，外加空白對(duì)照），于37 ℃下恒溫培養(yǎng)24 h，采用游標(biāo)卡尺十字交叉法測(cè)量和計(jì)算抑菌圈大小R（扣除濾紙片及空白直徑）。

1.3.3 單因素試驗(yàn)

提取的條件為超聲時(shí)間10 min、提取溫度30 ℃、料液比1:10、粒徑20目。在此基礎(chǔ)上依次研究超聲時(shí)間（10、20、30、40、50 min）、提取溫度（30、35、40、45、50 ℃）、粒徑（20、40、60、80、100目）和料液比（1:10、1:15、1:20、1:25、1:30 g/mL）4個(gè)單因素的改變對(duì)柚皮水提取物抑菌效果的影響。

1.3.4 響應(yīng)面試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，以抑菌圈大小為響應(yīng)值，選取影響較大的3個(gè)因素超聲時(shí)間（X1）、超聲溫度（X2）和料液比（X3）進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)，以對(duì)S.aureus的抑菌圈大小（R）為響應(yīng)值，試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1，并驗(yàn)證最佳工藝條件。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平表

1.3.5 提取物對(duì)不同液體食品中S.aureus的抑制作用

分別移取 S.aureus菌懸液 1、2、3、4、5 mL，用經(jīng)滅菌的生理鹽水溶液逐個(gè)定容至100 mL容量瓶中，研究江永香柚皮水提物不同用量對(duì)鹽水溶液（pH 7.0）中S.aureus致死率的變化，進(jìn)而確定最適用量。分別移取1 mL S.aureus菌懸液和1.3.4中得到的最適用量的江永香柚皮水提物加入到不同液體食品中（共100 mL體系），對(duì)照組中添加1 mL S.aureus菌懸液和等量的無(wú)菌水，搖勻后于37 ℃下恒溫培養(yǎng)。每隔1、2、4、8 h取樣檢測(cè)，計(jì)數(shù)方法參考 GB 4789.2-2010[10]，采用細(xì)菌致死率S評(píng)價(jià)各體系的抑菌效果：lgS=lg（N/N0）（N、N0分別表示處理后和處理前S.aureus菌落的總數(shù)（CFU/mL）[11-12]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

各試驗(yàn)組均平行3次，取其平均值。利用Origin 8.0和Design Expert 8.0.6進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，并用SPSS 19.0進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

由圖1（a）知，江永香柚皮水提物的抑菌效果受超聲時(shí)間變化的影響最為顯著，總體上呈先升后降趨勢(shì)。超聲時(shí)間為30 min時(shí)，水提物的抑菌效果最好。此時(shí)其對(duì)S.aureus的抑菌圈為13.21 mm，相對(duì)于10 min抑菌效果提高約40.38%。而當(dāng)超聲時(shí)間延長(zhǎng)至50min時(shí)，其抑菌效果約為30 min的84.33%。超聲作用能提升破壁效果而促進(jìn)抑菌成分的溶出，但超聲時(shí)間過(guò)長(zhǎng)則會(huì)使得抑菌成分的分解效率大于其溶出效率[13]。由圖1（b）知，在30～50 ℃的處理組中，當(dāng)控制超聲溫度為40 ℃時(shí)水提物的抑菌能力最強(qiáng)，其對(duì)S.aureus的抑菌圈為10.94 mm；當(dāng)溫度升高至50 ℃后，水提物的抑菌效果明顯下降，抑菌圈大小僅為8.92 mm，可能是過(guò)高的溫度使得江永香柚皮水提物中的抑菌成分受熱分解和構(gòu)象改變[14]。由圖1（c）知，粒徑的變化對(duì)江永香柚皮水提物抑菌效果的影響較小，當(dāng)粒徑達(dá)到40目以后，其抑菌圈的變化無(wú)顯著差異。因此，確定江永香柚皮提取水溶性抑菌成分的最適粒徑為40目。

由圖1（d）知，料液比達(dá)到1:15 g/mL時(shí)，繼續(xù)增加液料比無(wú)助于抑菌效果的提升；超過(guò)1:20 g/mL后，江永香柚皮水提物抑菌效果的下降程度變得顯著，其抑菌圈最低時(shí)僅為8.24 mm。加水過(guò)少使得提取過(guò)程中的有效成分的溶出效率不充分，江永香柚皮抑菌成分不能完全溶出，而料液比過(guò)高減少提取溶劑與原料的碰撞頻率，還會(huì)造成資源浪費(fèi)，且對(duì)后續(xù)分離純化步驟不利[15]。

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)

固定樣品的粒徑為40目，選取超聲時(shí)間、超聲溫度和料液比3個(gè)因素進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)方案及結(jié)果

由表2可知，采用Design expert 8.0.6軟件計(jì)算得到抑菌圈（R）對(duì)超聲時(shí)間（A）、超聲溫度（B）、料液比（C）的二次多項(xiàng)回歸模型方程：

2.3 回歸模型方差分析

回歸模型方差分析結(jié)果（見(jiàn)表3）可知，模型的 F=48.25、P=0.000 1，差異極顯著；失擬項(xiàng)的P值為0.923 0，差異不顯著，說(shuō)明試驗(yàn)誤差在可接受范圍內(nèi)；校正系數(shù)R2=0.936 2，說(shuō)明響應(yīng)值的變化有93.62%來(lái)源于所選因素，即來(lái)源于X1、X2、X3，顯示模型較為可信；變異系數(shù)（CV）僅為3.41%，說(shuō)明模型有良好的重現(xiàn)性。響應(yīng)面模型中一次項(xiàng)X1及其二次項(xiàng)X12、X22達(dá)到極顯著（P＜0.01）；一次項(xiàng)X2和二次項(xiàng)X32達(dá)到顯著（P＜0.05），其余各項(xiàng)不顯著（P＞0.05）。各因素對(duì)抑菌圈大小的影響大小為：X1（超聲時(shí)間）＞X2（超聲溫度）＞X3（料液比）。

根據(jù)回歸方程得出不同因子的3D響應(yīng)面圖見(jiàn)圖2，曲面的陡峭程度反映了操作條件改變下響應(yīng)值敏感性的大小[16]，結(jié)合回歸模型分析知，交互因子對(duì)提取物抑菌效果的影響不明顯。

2.4 驗(yàn)證性試驗(yàn)

通過(guò)Design-expert 8.0.6軟件擬合得到最適工藝參數(shù)為：超聲時(shí)間28.19 min，超聲溫度為39.04 ℃，料液比為 1：15.33 g/mL，預(yù)測(cè)抑菌圈大小為15.288 7 mm。結(jié)合現(xiàn)實(shí)中工藝放大的實(shí)際需求，最終工藝定為：超聲時(shí)間28 min，超聲溫度39 ℃，料液比為1：15 g/mL，粒徑為40目。在此條件下進(jìn)行驗(yàn)證，重復(fù)4次，與取消超聲輔助提取的試驗(yàn)組進(jìn)行對(duì)照，結(jié)果見(jiàn)表4和圖3。

表4 提取物的抑菌圈大小

2.5 提取物抑菌條件的確定

圖4顯示了S.aureus的致死率在鹽水溶液中隨香柚皮水提物用量增加及處理時(shí)間延長(zhǎng)的變化規(guī)律。S.aureus在鹽水體系中的致死率隨提取物用量的增加和處理時(shí)間的延長(zhǎng)而提升，當(dāng)提取物用量達(dá)到3 mL和處理時(shí)間超過(guò)25 min后，S.aureus致死率的變化基本穩(wěn)定，由此確定香柚水提物最適用量為3 mL，最適處理時(shí)間為25 min。

2.6 提取物對(duì)不同液態(tài)食品中S.aureus的抑制作用

相對(duì)于空白（每個(gè)樣品組下欄），江永香柚皮水提物對(duì)6種不同食品中接種的S.aureus均存在一定抑制作用（具體見(jiàn)表5）。向各樣品中加入江永香柚皮水提物后發(fā)現(xiàn)，抑菌能力因食品體系不同而差異顯著。在奶茶、酸梅湯、食用油、橙汁等固形物含量低的液體食品中其抑菌效果較好，接種至對(duì)應(yīng)體系中S.aureus菌落總數(shù)的抑制能力接近或超過(guò)3個(gè)數(shù)量級(jí)。而在固形物含量較高的牛奶和黃豆醬中抑制效果較差，分別只減少了0.85和1.78個(gè)數(shù)量級(jí)，原因可能是江永香柚皮水提物在固形物含量高的液態(tài)食品中不易擴(kuò)散所致。

表5 各種液體食品中水溶性抑菌成分對(duì)S.aureus的抑制率比較

3 結(jié)語(yǔ)

柚皮中被證實(shí)具有抑菌活性的功能性成分以多糖、黃酮和精油為主[17-19]。其中水溶性抑菌成分所占比重較高，且開(kāi)發(fā)成本較低。超聲波輔助法在植物有效成分提取中已被廣泛應(yīng)用，相對(duì)于常規(guī)浸提工藝，提取效率顯著提高[20]。目前，柚皮活性成分的抑菌試驗(yàn)多建立在培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，而考察其在復(fù)雜的食品體系中抑菌效果的研究甚少。同時(shí)，S.aureus是引起食物中毒最為常見(jiàn)的致病菌[21]。因此，考察抑菌劑在食品中對(duì)S.aureus的抑制效果具有現(xiàn)實(shí)意義。研究發(fā)現(xiàn)，通過(guò)優(yōu)化提取得到的江永香柚皮水提物作為天然抑菌劑在奶茶、酸梅湯、食用油、橙汁中應(yīng)用前景良好。

本研究發(fā)現(xiàn)，江永香柚皮水提物對(duì)6類(lèi)不同食品中S.aureus均有一定的抑制作用，比較適合在酸梅湯、橙汁和奶茶等固形物含量少的食品中應(yīng)用。研究表明其對(duì)食用油中的S.aureus的抑制作用同樣較為突出，這是由于試驗(yàn)中對(duì)樣品的振蕩使得該體系形成了乳濁液，而在實(shí)際應(yīng)用中還需進(jìn)一步研究。迄今為止，江永香柚皮水提物的抑菌成分尚不明確，不同提取態(tài)的抑菌效果比較也缺乏數(shù)據(jù)支持。