（閩南師范大學(xué) 生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，福建漳州 363000）

0 引言

黑米（Nigrum rice）是由禾本科植物稻谷經(jīng)長期培育形成的一類藥食兼用的大米。其種植歷史悠久，是我國古老而名貴的水稻品種。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)也證實(shí)黑米具有滋陰補(bǔ)腎、健脾暖肝、明目活血等功效[1]。并且經(jīng)研究證明，黑米所表現(xiàn)出來的保健功效是來自黑米皮中豐富的花色苷[2]，而不是自身所含有的膳食纖維、維生素和礦物質(zhì)等營養(yǎng)素，花色苷是在自然界廣泛存在的一類黃酮化合物，在大部分植物的根、莖、葉、花、果實(shí)和種皮中都有不同比例的存在。隨著黑米成熟度的增加，其種皮中的花色苷含量逐漸增加，使黑米的顏色發(fā)生由紅、紫紅、紫黑直至黑的變化。隨著近年來對(duì)植物花色苷研究的逐漸深入，發(fā)現(xiàn)花色苷不僅能夠賦予植物不同的色彩變化，還具有抗氧化性、抑菌性、降低血脂等生物活性[3]。在我國，黑米資源豐富，但是目前對(duì)其的開發(fā)應(yīng)用方面還較淺[4]，種植者經(jīng)簡(jiǎn)單加工便出售，經(jīng)濟(jì)效益較低。而黑米中花色苷含量豐富[5]，并且花色苷作為天然的植物色素，安全無害，在食品工業(yè)中有廣闊應(yīng)用前景[6]。

試驗(yàn)通過浸提法提取黑米中花色苷，測(cè)定不同pH值、不同濃度揮發(fā)氨、不同肉類下花色苷的顏色響應(yīng)，分析黑米花色苷的pH敏感性及其敏感度；以維生素C溶液為對(duì)比，測(cè)定花色苷抗氧化性強(qiáng)弱。通過這幾項(xiàng)測(cè)試內(nèi)容分析黑米花色苷作為添加劑加入pH敏感性食品包裝膜的可行性，為黑米的深層次開發(fā)與應(yīng)用提供借鑒，為pH敏感型食品包裝膜的研發(fā)和制備提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黑米、豬肉和牛肉購于漳州新華都超市；抗壞血酸（Vc）和 1，1-二苯基-2-苦基肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）購于上海源葉生物科技有限公司；無水乙醇、乙酸、氯化鉀、濃鹽酸（37%）、濃氨水（28%）和乙酸鈉購于西隴科學(xué)股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

JSM-6010LA掃描電子顯微鏡（日本電子株式會(huì)社）；FW100高速萬能粉碎機(jī)（天津市泰斯特儀器有限公司）；MultiSkan Go全波長酶標(biāo)儀（美國賽默飛世爾有限公司）；NICOLET IS 10傅里葉紅外分光光度計(jì)（美國賽默飛世爾有限公司）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 黑米花色苷的提取

使用粉碎機(jī)將黑米粉碎后過40目篩得到干粉狀原料，置于棕色試劑瓶中避光保存。使用2%乙酸水溶液與無水乙醇1：1混合作為浸提劑，并與黑米粉按照料液比1：20 g/mL混合，經(jīng)超聲處理30 min，并在50 ℃水浴鍋中浸提90 min，取出上清液后經(jīng)4 ℃、4 000 r/min離心再次將雜質(zhì)沉淀后經(jīng)抽濾得到色素浸提液。將色素浸提液與50 ℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，除去浸提液，得到黑米花色苷濃縮液，冷藏避光保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 花色苷含量測(cè)定

參照文獻(xiàn)[7]以矢車菊素-3-葡萄糖苷為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，利用pH示差法測(cè)定黑米花色苷提取物中的花色苷含量。按照式（1）計(jì)算花色苷含量。

其中 A=（A513nm-A700nm）pH1.0-（A513nm-A700nm）pH4.5

式中 A——吸光度值；

MW——矢車菊素-3-葡萄糖苷（Cyanidin-3-O-glucoside）的相對(duì)分子量（449.2 g/mol）；

ε——摩爾消光系數(shù)（26 900 L·mol-1·cm-1）；

DF——稀釋因子 /V·（Wt）-1。

1.3.3 黑米花色苷對(duì)pH值的響應(yīng)測(cè)試

配 制 pH 值 為 1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，9.0，10.0，11.0，12.0，13.0 的緩沖液備用；將 13份1 mL花色苷濃縮液分別加入到13支10 mL離心管中，分別用配置好的緩沖溶液定容至10 mL，并通過全波長酶標(biāo)儀作可見光區(qū)波段掃描，分析黑米花色苷提取物的吸光特性及其對(duì)pH值的響應(yīng)。

1.3.4 黑米花色苷的智能指示

氨基酸脫羧后產(chǎn)生的胺類物質(zhì)是食品腐敗及微生物生長的重要指標(biāo)，這些胺類物質(zhì)主要是氨氣、硫化氫及二甲胺等堿性氣體，它們能夠改變周圍環(huán)境pH值，從而使花色苷產(chǎn)生不同的顏色變化。本次試驗(yàn)以氨氣為腐敗特征氣體[8]，模擬肉類食品在腐敗過程中含氮化合物的揮發(fā)，以豬肉、牛肉兩種生活中常見肉類為肉類樣品，在日常生活條件下進(jìn)行試驗(yàn)，測(cè)試黑米花色苷對(duì)氨氣、肉類樣品的顏色響應(yīng)，及其對(duì)腐敗氣體的顏色響應(yīng)靈敏程度，評(píng)價(jià)黑米花色苷用于對(duì)食品腐敗進(jìn)行時(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)的可行性。

（1）黑米花色苷對(duì)揮發(fā)氨的響應(yīng)測(cè)試。取25 mL花色苷濃縮液定容至100 mL，配置1.484、0.742、0.495、0.371、0.297 mol/L 的氨水，取 5份5 mL花色苷稀釋液分別加入到于微量擴(kuò)散皿內(nèi)室中，并取以上各濃度氨水5 mL，分別加入上述擴(kuò)散皿外室中，于通風(fēng)櫥中儲(chǔ)藏60 min，每10 min對(duì)其做作可見光區(qū)波段掃描，探討隨著時(shí)間的增長黑米花色苷提取物對(duì)揮發(fā)氨的響應(yīng)。

（2）黑米花色苷對(duì)肉類腐敗氣味的響應(yīng)測(cè)試。取25 mL花色苷濃縮液定容至100 mL，取2份5 mL花色苷稀釋液分別加入到于微量擴(kuò)散皿內(nèi)室中，用分析天平分別稱取1份25 g豬肉和牛肉，切碎置于上述微量擴(kuò)散皿外室中，作3份平行樣，于通風(fēng)櫥中常溫儲(chǔ)藏5 d，每天對(duì)其作可見光區(qū)波段掃描，分析肉類食品新鮮度對(duì)黑米花色苷的影響。

1.3.5 DPPH自由基清除率測(cè)定

取10 mL黑米花色苷濃縮液定容至100 mL，配置濃度為0.25 mmol/L DPPH溶液和 50 mg/L維生素C溶液，取18份4 mL DPPH溶液分別放入離心管中，分別取 0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8 mL 的花色苷溶液及 0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8，0.9 mL維生素C溶液放入上述離心管，以只加入4 mL DPPH的離心管作為空白對(duì)照，黑暗中靜置30 min，做可見光區(qū)波段掃描，按式（2）計(jì)算DPPH自由基清除率。

式中 A0——空白對(duì)照測(cè)得的吸光度；

An——樣品測(cè)得的吸光度。

1.3.6 花色苷提取物的分子基團(tuán)及表觀形貌分析

通過NICOLET IS10型傅里葉紅外光譜儀對(duì)黑米花色苷進(jìn)行全反射傅里葉紅外光譜分析（ATR-FTIR）表征黑米花色苷的表面基團(tuán)，光譜范圍為 4 000～650 cm-1，分辨率 4 cm-1，掃描次數(shù)64次；使用掃描電鏡（SEM）在合適視野中觀察黑米花色苷粗提物的微觀圖像，研究其表觀形貌。

2 結(jié)果與分析

2.1 黑米花色苷的含量

樣品中總花色苷的含量結(jié)果如圖1所示，經(jīng)計(jì)算，黑米花色苷濃縮液中花色苷含量為86.50 mg/L。

2.2 黑米花色苷顏色對(duì)pH值的響應(yīng)

黑米花色苷顏色對(duì)pH值的響應(yīng)如圖2（a）所示。具體來說，如圖2（b）～（e）所示，圖中吸收峰波長發(fā)生了4次明顯變化，分別對(duì)應(yīng)了不同pH值下花色苷4種結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)變：從pH1.0～4.0時(shí)，吸收峰位置出現(xiàn)在520 nm左右，這是由于花色苷以紅色的花色烊陽離子形式存在導(dǎo)致的；隨著pH值的不斷增大，其在520 nm處的吸收峰強(qiáng)度逐漸降低，這是由于花色烊陽離子結(jié)構(gòu)的減少且逐漸轉(zhuǎn)化為無色的甲醇假堿和查爾酮假堿導(dǎo)致的[9]；當(dāng)pH值上升至7.0時(shí)，花色烊陽離子結(jié)構(gòu)幾乎完全消失，花色苷最大吸收波長發(fā)生紅移圖2（c）；當(dāng)pH值達(dá)到8.0時(shí)，溶液呈黃綠色，花色苷最大吸收波長在600 nm左右，這是由于花色苷轉(zhuǎn)變?yōu)樗{(lán)色醌式結(jié)構(gòu)同時(shí)其芳環(huán)上發(fā)生甲基化反應(yīng)，使花色苷產(chǎn)生了黃色物質(zhì)[10]，且隨著pH值繼續(xù)上升，花色苷顏色逐漸變向黃色轉(zhuǎn)變，最大吸光度隨之上升圖2（d）；當(dāng)pH值繼續(xù)上升至9.0～13.0時(shí)，溶液變?yōu)辄S色，在600 nm處的吸收峰隨著pH值的上升其吸光度逐漸降低，這表明了在強(qiáng)堿環(huán)境下，花色苷的醌式結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，會(huì)形成共振穩(wěn)定的醌式陰離子[11]。

2.3 黑米花色苷的智能指示

2.3.1 黑米花色苷對(duì)揮發(fā)氨的響應(yīng)測(cè)試

圖3是黑米花色苷在不同濃度氨水下的可見光譜變化。如圖3所示，隨著時(shí)間的增加，擴(kuò)散皿內(nèi)部的NH3濃度不斷增大，皿內(nèi)環(huán)境pH值逐漸升高，黑米花色苷分子結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變?yōu)橐约t色的花色烊陽離子為主，導(dǎo)致其吸光度在520 nm處有強(qiáng)的吸收峰，而當(dāng)NH3濃度繼續(xù)增大時(shí)，黑米花色苷開始以查爾酮或醌型堿結(jié)構(gòu)為主[12]，而花色烊陽離子逐漸減少，故出現(xiàn)吸收峰達(dá)到最高后下降并且最大吸收波長發(fā)生紅移的現(xiàn)象。在濃氨水稀釋程度增加時(shí)，雖沒有出現(xiàn)最大吸收波長發(fā)生紅移的現(xiàn)象，但是隨著時(shí)間的延長，NH3濃度的逐漸增大，黑米花色苷仍會(huì)產(chǎn)生明顯的顏色變化，說明其能夠根據(jù)食品腐敗氣體不同濃度發(fā)生靈敏的智能指示[13]。

2.3.2 黑米花色苷對(duì)肉類腐敗氣味的響應(yīng)測(cè)試

如圖4所示，黑米花色苷對(duì)豬肉和牛肉的吸光值響應(yīng)基本一致，貯藏前2 d在520 nm處的吸收峰逐漸降低，伴隨著花色苷紅色逐漸褪去，說明花色苷此時(shí)的紅色烊陽離子結(jié)構(gòu)正在逐漸減少[14]，轉(zhuǎn)變?yōu)榧状技賶A和查爾酮假堿等無色物質(zhì)。隨著豬肉和牛肉腐敗程度的增加，黑米花色苷的花色烊陽離子結(jié)構(gòu)幾乎完全消失，其最大吸收波長發(fā)生紅移，隨后吸收峰也繼續(xù)降低，花色苷顏色也轉(zhuǎn)變?yōu)辄S綠色，說明其形成藍(lán)色的醌式結(jié)構(gòu)，并且結(jié)構(gòu)中一芳環(huán)發(fā)生甲基化，使花色苷轉(zhuǎn)變?yōu)辄S色[15]。因此黑米花色苷能夠根據(jù)食品腐敗程度展現(xiàn)出不同的顏色變化。

2.4 黑米花色苷的DPPH自由基清除能力

從花色苷溶液和維生素C溶液對(duì)DPPH·的清除能力（如圖5）發(fā)現(xiàn)，在自由基清除劑加入的1 min內(nèi)，離心管中溶液顏色便隨著清除劑添加量的增加而逐漸變淺。由圖可知，兩種自由基清除劑的DPPH·清除率均隨著劑量的增加而增加，經(jīng)計(jì)算可以得出，黑米花色苷和維生素C對(duì)DPPH·清除率的 IC50 值分別為 4.462 μg/L、34.56 μg/L，通過比較得出，黑米花色苷的DPPH·清除能力遠(yuǎn)高于維生素C，且在所選添加量范圍內(nèi)，DPPH自由基清除率與花色苷添加量呈正相關(guān)，隨著花色苷濃度增加，對(duì)DPPH自由基的清除能力能達(dá)到70 %以上。

2.5 黑米花色苷的表觀形貌

如圖6所示，由于黑米花色苷結(jié)構(gòu)中含有苯環(huán)及與苯環(huán)連接的多個(gè)糖基上的羥基伸縮振動(dòng)，導(dǎo)致了紅外圖譜在3 340 cm-1有一強(qiáng)而寬的吸收峰，并且羥基間形成了氫鍵，故吸收峰的波形逐漸變寬，并逐漸向低頻移動(dòng)。

圖中2 979 cm-1處的吸收峰是由糖基上的亞甲基伸縮振動(dòng)引起的；在1 644 cm-1處的一吸收峰則為共軛羰基的伸縮振動(dòng)特征峰，對(duì)應(yīng)了苯環(huán)上的α-羰基結(jié)構(gòu)，由此可以看出黑米花色苷中存在有酰基基團(tuán)[16]。1 455，1 415 cm-1處則對(duì)應(yīng)了花色苷中苯并吡楠的芳環(huán)和雜環(huán)的骨架振動(dòng)。1 383，1 327，1 273 cm-1處的一系列吸收峰對(duì)應(yīng)了黑米花色苷糖環(huán)上碳氧鍵的伸縮振動(dòng)。因此，初步判斷黑米花色苷是一種苯環(huán)結(jié)構(gòu)上存在-OH基和-OCH3基團(tuán)并與一個(gè)氧雜原子的六元雜環(huán)組成的具有一定?；幕衔铩：诿谆ㄉ辗肿颖砻娲嬖诖罅慷嗵墙宦?lián)結(jié)構(gòu)，粗糙不平，褶皺豐富，大大增加了其表面積，從而使黑米能夠更靈敏的與腐敗氣體反應(yīng)，起到更好的智能指示作用[17]。

3 結(jié)語

本試驗(yàn)以浸提法提取黑米花色苷，其粗提物濃縮液含量為86.50 mg/L；對(duì)黑米花色苷進(jìn)行pH響應(yīng)試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)黑米花色苷對(duì)pH值敏感，能夠隨著不同的pH值展現(xiàn)由紫紅到紅、無色、綠以及黃綠的顏色變化。使用氨氣為腐敗特征氣體，模擬肉類食品在腐敗過程中含氮化合物的揮發(fā)，以豬肉、牛肉兩種生活中常見肉類為肉類樣品，在日常生活條件下進(jìn)行試驗(yàn)，測(cè)試黑米花色苷對(duì)氨氣、肉類樣品的顏色響應(yīng)，發(fā)現(xiàn)黑米花色苷能夠通過揮發(fā)性氮含量的增加而發(fā)生不同程度的顏色變化。對(duì)黑米花色苷進(jìn)行自由基清除能力試驗(yàn)，以維生素C為對(duì)照，根據(jù)兩種抗氧化劑對(duì)DPPH·的清除率計(jì)算得出，黑米花色苷和維生素C溶液對(duì)DPPH·清除率的IC50值分別為4.645 μg/L、34.56 μg/L，發(fā)現(xiàn)花色苷清除DPPH自由基能力強(qiáng)于維生素C，因此黑米花色苷具有很強(qiáng)的抗氧化性能。通過紅外光譜和電鏡觀察黑米花色苷的表觀形貌，可以看出黑米花色苷是一種苯環(huán)結(jié)構(gòu)上存在-OH基和-OCH3基團(tuán)并與一個(gè)氧雜原子的六元雜環(huán)組成的具有一定?；倪拎衔铮⑶矣捎谄浣Y(jié)構(gòu)的特點(diǎn)能夠更好地發(fā)揮對(duì)食品新鮮度進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)的作用[18]。

因此，黑米花色苷作為天然色素，來源豐富，安全性系數(shù)高，擁有較好的抗氧化能力。能夠起到防止食品腐敗變質(zhì)，延長其保質(zhì)期的作用[19]。同時(shí)，黑米花色苷能夠根據(jù)食品新鮮度的變化展現(xiàn)出不同的顏色變化。有望將其應(yīng)用于pH敏感型智能活性食品包裝膜的制備中，起到對(duì)食品進(jìn)行保鮮和新鮮度智能指示的作用[20]，方便消費(fèi)者辨別食品新鮮度，為黑米花色苷的開發(fā)應(yīng)用提供參考依據(jù)。