■盧文麒 何英霞 梁 英 陳學(xué)豪* 翟少偉，2

（1.集美大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院 鰻鱺現(xiàn)代產(chǎn)業(yè)技術(shù)教育部工程研究中心，福建廈門361021；2.福建省水產(chǎn)生物育種與健康養(yǎng)殖工程研究中心，福建廈門361021）

研究表明，飼料中高水平組胺會導(dǎo)致肉食性魚體內(nèi)產(chǎn)生過量的氧自由基并使其代謝失衡，降低肝臟抗氧化酶活性，造成肝臟氧化應(yīng)激和正常肝細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致生長受到抑制[1-7]。為了緩解魚類養(yǎng)殖中的氧化應(yīng)激，在飼料中添加植物多酚成為近年來魚類抗應(yīng)激添加劑領(lǐng)域的研究熱點，特別是葡萄籽原花青素（GSPs）因其能夠清除魚體內(nèi)多種自由基，維持肝細(xì)胞膜的正常通透性，減少肝臟轉(zhuǎn)氨酶的釋放，降低丙二醛水平，提高肝臟抗氧化能力，改善內(nèi)臟器官健康而備受關(guān)注[8-9]。GSPs能增強飼料鎘脅迫下吉富羅非魚（Oreochromis niloticus）肝胰臟和珍珠龍膽石斑魚（Epinephelus lanceolatus×Epinephelus fuscoguttatus♀）肝臟的抗氧化能力[10-12]，提高熱應(yīng)激下綠唇鮑抗氧化能力和存活率[13]。GSPs在緩解飼料組胺脅迫方面，僅有改善美洲鰻鱺（Anguilla rostrata）生長性能和腸道健康的報道[14]，對美洲鰻鱺肝臟健康是否具有保護作用未知。因此，本試驗以美洲鰻鱺為試驗動物，研究在飼料組胺脅迫下添加GSPs 對美洲鰻鱺血清轉(zhuǎn)氨酶活性和肝臟抗氧化能力的影響，為GSPs 在鰻鱺飼料中的利用開發(fā)提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗動物與試驗設(shè)計

試驗動物美洲鰻鱺幼魚由廈門市同安區(qū)北溪鰻魚養(yǎng)殖場提供。選擇健康、規(guī)格接近、平均體重為（10.84±0.16）g 的美洲鰻鱺幼魚480 尾進行試驗，隨機分4 個處理組（每組4 個重復(fù)，每個重復(fù)30 尾），即對照組、HIS組、HIS+GSPs組Ⅰ、HIS+GSPs組Ⅱ，其中對照組投喂基礎(chǔ)飼料，其他組投喂在基礎(chǔ)飼料中分別添加300 mg/kg組胺、300 mg/kg組胺+300 mg/kg GSPs和300 mg/kg 組胺+600 mg/kg GSPs 的試驗飼料，試驗期為77 d。

1.2 試驗飼料

基礎(chǔ)飼料為福州海馬飼料有限公司生產(chǎn)的幼鰻配合飼料，主要由白魚粉、紅魚粉、淀粉、酵母粉、膨化大豆及復(fù)合預(yù)混料組成，營養(yǎng)水平為粗蛋白46.58%、粗灰分12.35%、粗脂肪6.70%、水分7.36%。配制4種試驗飼料，按照試驗設(shè)計分別將組胺、GSPs與基礎(chǔ)飼料逐級混勻（組胺添加量為300 mg/kg，飼料實測水平為534 mg/kg），分裝于自封袋中，-20 ℃冷凍保存。組胺（C5H9N3，有效含量為98.2%）由上海源葉生物技術(shù)有限公司提供，配制飼料前將顆粒狀研磨至粉末狀；葡萄籽原花青素（GSPs，有效含量為98%）為葡萄籽中提取純化的粉末狀產(chǎn)品，由南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司提供。

1.3 飼養(yǎng)管理

試驗于集美大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院海水場開展，將480尾美洲鰻鱺置于兩個無循環(huán)水圓形養(yǎng)殖桶（直徑為1.10 m,高為0.80 m,注水量為800 L）暫養(yǎng)兩周。暫養(yǎng)期間投喂基礎(chǔ)飼料，按料水比為1∶1.1 混合，手工制成面團狀定時投喂，投喂1 h 后清除糞便。定時監(jiān)測水質(zhì)狀況，維持水溫為24～28 ℃，pH 值為7.2～7.9，溶氧濃度為7.0～9.0 mg/l，氨氮＜0.10 mg/l，亞硝酸鹽＜0.005 mg/l，日換水量為1/3～1/2。試驗開始后，將健康、規(guī)格相近的美洲鰻鱺隨機分到16 個具有循環(huán)水裝置的圓形養(yǎng)殖桶（直徑為0.60 m，高為1.40 m，注水量為320 L）中，投餌率為每桶中魚總重的1.5%左右，每日投喂兩次（6：00和18：00），每次投餌1 h后采用虹吸管收集各養(yǎng)殖桶底的殘餌和清除糞便。每天觀察美洲鰻鱺幼魚的攝食與生長狀況，記錄日投喂量、死亡數(shù)量，水質(zhì)與暫養(yǎng)期間一致。

1.4 樣品采集

試驗第11周結(jié)束后，停食24 h，從各養(yǎng)殖桶中隨機取9尾美洲鰻鱺，放入無水乙醇配制成2 g/l丁香酚中短暫麻醉，尾靜脈取血，靜置于4 ℃冰箱內(nèi)8 h，待凝固分層后，于4 ℃離心機下離心（3 000 r/min）10 min，取上層血清，-80 ℃凍存待測。美洲鰻鱺取血后，迅速將其解剖，分離出肝臟，稱量肝臟，并用4 ℃無菌去離子水清洗表面的血漬，液氮保存12 h 后，轉(zhuǎn)至-80 ℃冰箱保存。取肝臟樣品于4 ℃下解凍，漂洗，濾紙拭干及稱量，按質(zhì)量（g）∶體積（ml）=1∶9的比例加入預(yù)冷生理鹽水，采用玻璃勻漿機制成10%勻漿，在4 ℃條件下3 500 r/min 離心10 min,，取上清轉(zhuǎn)移至離心管中，-80 ℃保存待測。

1.5 試驗指標(biāo)測定

血清中谷草轉(zhuǎn)氨酶（GPT）和谷丙轉(zhuǎn)氨酶（GOT）活性，肝臟超氧化物歧化酶（SOD）和過氧化氫酶（CAT）活性，總抗氧化能力(T-AOC)、谷胱甘肽（GSH）和丙二醛(MDA)水平的測定均嚴(yán)格按照南京建成生物工程研究所的試劑盒說明書的步驟進行。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

所有結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±SD）”表示，用SPSS 22.0分析軟件進行單因素方差分析（one-way ANOVA），采用Duncan's 法對存在顯著差異的數(shù)據(jù)進行多重比較，P＜0.05為差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 GSPs對飼料組胺脅迫下美洲鰻鱺血清轉(zhuǎn)氨酶活性的影響(見圖1)

圖1 GSPs對飼料組胺脅迫下美洲鰻鱺血清轉(zhuǎn)氨酶活性的影響

由圖1 可知，與對照組相比，HIS 組血清GPT 和GOT 活性顯著升高（P＜0.05）；HIS+GSPs 組與對照組和HIS 組接近（P＞0.05），HIS+GSPs 組間無顯著差異（P＞0.05）。

2.2 GSPs對飼料組胺脅迫下美洲鰻鱺肝臟抗氧化指標(biāo)的影響(見圖2)

由圖2 可見，HIS 組美洲鰻鱺肝臟T-AOC 和CAT活性顯著低于對照組（P＜0.05），GSH 和MDA 水平無顯著變化（P＞0.05）；HIS+GSPs 組美洲鰻鱺肝臟TAOC、GSH水平和CAT活性與對照組相比無顯著變化（P＞0.05），但HIS+GSPs 組Ⅰ的MDA 水平顯著低于對照組（P＜0.05）；HIS+GSPs 組美洲鰻鱺肝臟CAT 活性顯著高于HIS 組（P＜0.05），MDA 水平顯著低于HIS 組（P＜0.05），HIS+GSPs 組Ⅱ美洲鰻鱺肝臟T-AOC 和GSH 水平顯著高于HIS 組（P＜0.05）；HIS+GSPs 組Ⅰ、Ⅱ間各指標(biāo)均無顯著變化（P＞0.05）。所有組間SOD活性均無變化（P＞0.05）。

3 討論

血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶（GOT）和谷草轉(zhuǎn)氨酶（GPT）屬于細(xì)胞內(nèi)酶，正常條件下受細(xì)胞膜的屏障保護不易滲出，當(dāng)魚類肝細(xì)胞受損或器官功能障礙發(fā)生時，細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)氨酶釋放到血液，因此血清轉(zhuǎn)氨酶的變化可以評價肝細(xì)胞受損的程度[15]。本試驗中，HIS 組美洲鰻鱺血清的GOT 和GPT 活性顯著高于對照組，這與蘭菲菲[1]在美洲鰻鱺飼料中添加300 mg/kg 組胺，血清中谷草轉(zhuǎn)氨酶和谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性顯著升高的結(jié)果一致，說明飼料組胺對美洲鰻鱺肝臟有損傷作用。而在飼料組胺脅迫下添加GSPs，血清中GOT 和GPT活性與對照組相比無顯著差異，表明GSPs 能夠緩解飼料組胺對肝臟的損傷。飼料鎘脅迫下在吉富羅非魚飼料中添加400 mg/kg GSPs、珍珠龍膽石斑魚飼料中添加800 mg/kg GSPs 可降低血清的GOT 和GPT 活性[10-11]。GSPs 降低血清的GPT、GOT 活性，緩解肝臟損傷可能與其直接發(fā)揮抗氧化能力，清除過多自由基有關(guān)；還可能與其減少炎癥細(xì)胞因子的產(chǎn)生，保持脅迫下肝細(xì)胞完整性有關(guān)[5,16]。

總抗氧化能力（T-AOC）可以反映魚體對外界脅迫下分解與清除自由基的代謝能力，是綜合評價機體抗氧化系統(tǒng)的指標(biāo)[17]。谷胱甘肽（GSH）是機體重要的抗氧化因子，能清除損傷細(xì)胞的活性氧，維持生物體內(nèi)氧自由基的代謝平衡[18]；超氧化物歧化酶（SOD）能清除氧化應(yīng)激產(chǎn)生的超氧化自由基，減輕自由基對肝細(xì)胞的損傷[16]；過氧化氫酶（CAT）屬于含F(xiàn)e3+的血蛋白酶，能清除SOD 反應(yīng)后產(chǎn)生的H2O2，也可阻止ROS對肝細(xì)胞的損傷，在肝抗氧化防御體系中發(fā)揮重要的作用[19]；丙二醛（MDA）是脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物，由自由基誘導(dǎo)膜脂質(zhì)過氧化產(chǎn)生，可與蛋白質(zhì)、氨基酸殘基等發(fā)生交聯(lián)聚合反應(yīng)，對細(xì)胞有損傷作用，是評估氧化應(yīng)激引起肝臟脂質(zhì)過氧化程度的指標(biāo)[20]。

圖2 GSPs對飼料組胺脅迫下美洲鰻鱺肝臟抗氧化指標(biāo)的影響

本試驗中，與對照組相比，HIS 組中GSH 水平有降低趨勢，機體內(nèi)產(chǎn)生的GSH不能滿足正常的生理功能，而T-AOC 水平和CAT 活性顯著降低。說明本試驗條件下飼料組胺可降低美洲鰻鱺肝臟抗氧化能力。這與投喂含高組胺的飼料可顯著降低黃顙魚肝臟SOD、CAT 活性，升高MDA 水平，造成肝臟氧化損傷的研究結(jié)果一致[21-22]。飼料組胺降低肝臟抗氧化能力的原因可能是過量的自由基大量消耗抗氧化酶，致使肝內(nèi)氧化與抗氧化系統(tǒng)的失衡，導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化物代謝能力減弱；也與刺激肝臟快速釋放IL-1β、IL-6、IL-8 和TNF-α等炎癥因子從而激活NF-кB 通路，引起炎性反應(yīng)過激造成肝細(xì)胞損傷有關(guān)[4,23]。

本試驗中，與HIS 組相比，HIS+GSPs 組美洲鰻鱺肝臟CAT活性顯著升高，MDA水平顯著降低；僅HIS+GSPs 組Ⅱ美洲鰻鱺肝臟T-AOC 和GSH 水平顯著升高；HIS+GSPs 組各項指標(biāo)與對照組接近。說明GSPs能提高美洲鰻鱺肝臟清除自由基和抗氧化能力，一定程度緩解飼料組胺脅迫的氧化損傷。這與吉富羅非魚飼料添加400 mg/kg GSPs 減少自由基的產(chǎn)生，緩解100 mg/kg鎘脅迫下肝胰臟氧化損傷結(jié)果類似[24]。此外，添加800 mg/kg GSPs可提高300 mg/kg飼料鎘脅迫下珍珠龍膽石斑魚肝臟CAT活性和降低MDA水平[11]；添加47.6 mg/kg GSPs可提高熱應(yīng)激綠唇鮑SOD活性[13]。GSPs 提高不同脅迫下肝臟抗氧化能力可能的途徑是：①通過分子結(jié)構(gòu)的多個酚羥基直接捕獲氧化過程中產(chǎn)生的自由基，清除過多的ROS，提高抗氧化酶活性和非酶系物質(zhì)水平等維持機體抗氧化系統(tǒng)平衡[10]。②阻止脂質(zhì)過氧化鏈反應(yīng)的啟動，消除機體被脅迫下脂質(zhì)過氧化過程中的中間產(chǎn)物L(fēng)OO-，阻斷脂質(zhì)過氧化鏈延長，中斷自由基鏈反應(yīng)，降低MDA 水平[25]。③其分子結(jié)構(gòu)中的羥酚基通過螯合金屬離子(如Fe3+、Cu2+、Al3+)，鈍化金屬離子的活性，抑制催化自由基反應(yīng)[26]。④通過調(diào)節(jié)GSH 氧化還原循環(huán)來改善細(xì)胞氧化還原狀態(tài)，提高GSH清除自由基和活性氧的能力[27]。

4 結(jié)論

綜上所述，飼料組胺脅迫下添加300 mg/kg GSPs即可降低美洲鰻鱺的血清轉(zhuǎn)氨酶活性及肝臟丙二醛水平，提高肝臟抗氧化能力，緩解飼料組胺脅迫誘導(dǎo)產(chǎn)生的氧化應(yīng)激，改善肝臟健康狀態(tài)。