■杜孟思 王曉冰 姚蒙蒙 斯大勇

（中國農(nóng)業(yè)大學(xué)飼料生物技術(shù)實驗室動物營養(yǎng)學(xué)國家重點實驗室，北京100193）

丁酸梭菌（Clostridium butyricum），作為2009 年我國批準(zhǔn)的新一代微生物飼料添加劑，由于其嚴(yán)格厭氧和難以培養(yǎng)的特點，在實際生產(chǎn)中面臨著生物量低、成本高等問題，還未實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化批量生產(chǎn)[1]。但是，與其他非芽孢類益生菌相比，丁酸梭菌因其內(nèi)生孢子，具有更好的抗逆性。在體外經(jīng)90 ℃處理20 min后仍不失活；在體內(nèi)能耐胃酸和膽鹽，且只對極少數(shù)抗生素敏感。同時丁酸梭菌還能產(chǎn)生丁酸、氫氣以及多種酶等對畜禽有益的物質(zhì)，其中，丁酸是代謝過程中的主要產(chǎn)物之一，是結(jié)腸上皮細(xì)胞的主要能量來源，可為腸黏膜細(xì)胞提供70%以上的能量，它在腸黏膜修復(fù)和維持腸道結(jié)構(gòu)完整性中起重要作用[2-4]。因此丁酸梭菌在實際生產(chǎn)中具有較高的應(yīng)用價值。本實驗室前期從不同動物腸道和糞便中分離篩選出16株丁酸梭菌，以SCFA產(chǎn)量為指標(biāo)，從中挑選出5株產(chǎn)酸能力較強(qiáng)的菌株進(jìn)行生化鑒定和特異性分子鑒定；然后以活菌數(shù)、芽孢存活率以及淀粉酶和纖維素酶活力等指標(biāo)進(jìn)行復(fù)篩，最后挑選出一株生物學(xué)性能和抗逆性優(yōu)異的丁酸梭菌CGMCC No.8187。研究發(fā)現(xiàn)該菌株可以產(chǎn)生丁酸、SOD、NADH氧化酶以及H2和CO2等氣體，其中H2產(chǎn)量高達(dá)37.49 ml/50 ml發(fā)酵液，24 h產(chǎn)丁酸18 mM[5]。為了進(jìn)一步實現(xiàn)產(chǎn)氫抗氧化丁酸梭菌高效發(fā)酵，本試驗旨在通過單因素試驗和正交試驗，優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基的組成，來提高丁酸梭菌的生物量，為丁酸梭菌的工業(yè)發(fā)酵工藝和實際應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗菌種

丁酸梭菌CGMCC No.8187（Clostridium butyricumCGMCC No.8187）由本實驗室前期自行篩選獲得，并授權(quán)發(fā)明專利ZL201410469885X。

1.2 主要儀器

智能型生化培養(yǎng)箱(廣東省醫(yī)療器械廠)、電熱鼓風(fēng)干燥箱(北京博宇寶威試驗設(shè)備有限公司)、pH 計(METTLER TOLEDO)、立式壓力蒸汽滅菌器(江陰濱江醫(yī)療設(shè)備有限公司)、數(shù)顯恒溫攪拌循環(huán)水箱(常州國華電器有限公司)、生物顯微鏡(重慶澳浦光電技術(shù)有限公司)。

1.3 培養(yǎng)基的配制

強(qiáng)化梭菌培養(yǎng)基（Reinforced Clostridium Medium,RCM）：10 g/l 牛肉膏、5 g/l 葡萄糖、10 g/l 胰蛋白胨、3 g/l 酵母浸粉、5 g/l 氯化鈉、1 g/l 可溶性淀粉、0.5 g/l半胱氨酸鹽酸鹽、3 g/l 乙酸鈉，調(diào)節(jié)pH 值至（7.1±0.1），121 ℃滅菌20 min。

初始發(fā)酵培養(yǎng)基：10 g/l酵母浸粉、20 g/l葡萄糖、1 g/l硫酸銨、5 g/l 氯化鈉、4 g/l磷酸氫二鉀、5 g/l增效劑、2 g/l碳酸鈣，調(diào)節(jié)pH值至（7.1±0.1），121 ℃滅菌20 min。

1.4 丁酸梭菌的培養(yǎng)及計數(shù)方法

種子活化及培養(yǎng)方法：取儲存在-80 ℃冰箱中的甘油管菌株500 μl 接種到含有9 ml 的強(qiáng)化梭菌培養(yǎng)基的試管中，在培養(yǎng)基表面覆蓋高約2 cm 的1∶1 混合配制的石蠟凡士林以進(jìn)行油封，并在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中靜止培養(yǎng)48 h。隨后，再吸取1 ml接種到新鮮滅菌的強(qiáng)化梭菌培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)至對數(shù)期即可作為種子液進(jìn)行后續(xù)試驗。丁酸梭菌的發(fā)酵培養(yǎng)采用液體深層靜止培養(yǎng)，100 ml 三角瓶裝液量100 ml，用石蠟凡士林對三角瓶進(jìn)行油封，于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中靜止培養(yǎng)24 h后計數(shù)。

計數(shù)方法采用血球計數(shù)板法[6]。

1.5 單因素試驗

1.5.1 有機(jī)氮源的篩選

選取胰蛋白胨、牛肉膏、酵母浸粉、大豆蛋白胨、大豆粕和肽粉進(jìn)行有機(jī)氮源篩選試驗，起始添加量均為1%，初始培養(yǎng)基中其他成分固定不變。37 ℃培養(yǎng)24 h 后，取樣測定菌體濃度，探究不同有機(jī)氮源對丁酸梭菌菌體濃度的影響。

1.5.2 有機(jī)氮源添加量的篩選

在確定最佳有機(jī)氮源后，進(jìn)一步篩選有機(jī)氮源的最優(yōu)添加量（0.5%、1.0%、2.0%、3.0%、4.0%和5.0%）。

1.5.3 無機(jī)氮源的篩選

有機(jī)氮源成分確定后，在硫酸銨、氯化銨、尿素和檸檬酸銨中篩選最佳的無機(jī)氮源種類。以初始發(fā)酵培養(yǎng)基中1 g/l的硫酸銨含氮量為基準(zhǔn)，固定其余無機(jī)氮源的含氮量一致，起始添加量均為含氮量0.2 g/l，初始培養(yǎng)基中其他成分固定不變。37 ℃培養(yǎng)24 h后，取樣測定菌體濃度，探究不同無機(jī)氮源對丁酸梭菌菌體濃度的影響。

1.5.4 無機(jī)氮源添加量的篩選

在確定最佳無機(jī)氮源后，進(jìn)一步篩選無機(jī)氮源的最優(yōu)添加量（0.05%、0.10%、0.20%、0.30%和0.40%）。

1.5.5 碳源的篩選

分別以葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉、玉米纖維和麩皮5 種碳源來替換原培養(yǎng)基中1%的葡萄糖，剩余的1%葡萄糖添加量以及培養(yǎng)基其他成分均保持不變。37 ℃培養(yǎng)24 h后，取樣測定菌體濃度，探究不同碳源對丁酸梭菌菌體濃度的影響。

1.5.6 碳源添加量的篩選

確定最佳碳源后，進(jìn)一步篩選出碳源的最優(yōu)添加量(1.0%、1.5%、2.0%、2.5%和3.0%)。

1.5.7 除氧劑的篩選

丁酸梭菌屬于嚴(yán)格厭氧菌，在培養(yǎng)基中加入合適的除氧劑能夠達(dá)到降低培養(yǎng)液中溶解氧濃度的目的，從而更有利于菌體的生長。因此本試驗選擇了半胱氨酸鹽酸鹽、抗壞血酸和還原鐵粉作為除氧劑，起始添加量均為1%，初始培養(yǎng)基中其他成分固定不變。37 ℃培養(yǎng)24 h后，取樣測定菌體濃度，探究不同除氧劑對丁酸梭菌菌體濃度的影響。

1.5.8 除氧劑添加量的篩選

確定最佳除氧劑后，進(jìn)一步篩選除氧劑的最優(yōu)添加量（0.05%、0.10%、0.20%、0.30%和0.40%）。

1.5.9 磷酸氫二鉀最佳濃度的篩選

影響丁酸梭菌生長的其中一個重要原因是酸脅迫效應(yīng)。丁酸梭菌生長過程中會產(chǎn)生丁酸和乙酸，而培養(yǎng)液中有機(jī)酸的不斷積累會毒害細(xì)胞并影響菌體生長，而磷酸氫二鉀作為磷源緩沖劑，當(dāng)微生物分泌酸性物質(zhì)時，它與磷酸氫二鉀反應(yīng)生成磷酸二氫鉀。因此進(jìn)行磷酸氫二鉀的最佳添加量的篩選（0.20%、0.30%、0.40%、0.50%和0.60%）。

1.6 正交試驗

根據(jù)前面單因素篩選試驗得出的結(jié)果，選擇影響丁酸梭菌菌體生長最顯著的三個因素進(jìn)行正交試驗，綜合其最佳濃度設(shè)計L9(34)正交試驗，每個組合進(jìn)行三次重復(fù)試驗，以確定在上述3個因素的作用下適合丁酸梭菌生長的最優(yōu)組合方案。

1.7 結(jié)果分析和統(tǒng)計方法

運用SPSS 22.0 統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，統(tǒng)計數(shù)據(jù)可視化采用Excel軟件。

2 結(jié)果

2.1 單因素試驗

2.1.1 有機(jī)氮源的篩選

不同有機(jī)氮源種類篩選結(jié)果如圖1所示。由圖1可知，大豆蛋白胨為最佳的有機(jī)氮源，能促進(jìn)丁酸梭菌的生長，菌體濃度高于酵母浸粉（P＞0.05），并顯著高于其他有機(jī)氮源（P＜0.05），達(dá)到1.62×108個/ml。

圖1 不同有機(jī)氮源對丁酸梭菌菌體濃度的影響

2.1.2 有機(jī)氮源添加量的篩選

在以大豆蛋白胨為最佳有機(jī)氮源的基礎(chǔ)上，優(yōu)化其添加量，其結(jié)果如圖2所示。由圖2可知，大豆蛋白胨添加量為0.5%時菌體濃度最高，為1.5×108個/ml，與1%添加量沒有顯著差異（P＞0.05），但極顯著高于其他添加水平組（P＜0.01）。

圖2 大豆蛋白胨濃度對丁酸梭菌菌體生長的影響

考慮到復(fù)合有機(jī)氮源可能比單獨添加一種有機(jī)氮源更有利于丁酸梭菌菌體生長，因此隨后選擇了效果最好的兩種有機(jī)氮源（大豆蛋白胨和酵母浸粉）進(jìn)行復(fù)合氮源試驗。保持0.5%的總添加量不變，大豆蛋白胨∶酵母浸粉分別為3∶0、2∶1、1∶1、1∶2和0∶3。其結(jié)果如圖3所示。當(dāng)大豆蛋白胨∶酵母浸粉為1∶2時，菌體濃度達(dá)到2.3×108個/ml，極顯著高于其他組（P＜0.01），比單獨添加大豆蛋白胨時菌量提高了40%左右。綜合上述試驗結(jié)果，最終選定大豆蛋白胨和酵母浸粉作為復(fù)合有機(jī)氮源添加，添加總量為0.5%，比例為1∶2。

圖3 復(fù)合有機(jī)氮源對丁酸梭菌菌體濃度的影響

2.1.3 無機(jī)氮源的篩選

由于微生物對有機(jī)氮源利用速率不如無機(jī)氮源，為保證菌體早期生長，需要對無機(jī)氮源種類以及添加量進(jìn)行篩選，無機(jī)氮源篩選結(jié)果如圖4所示。檸檬酸銨是最適合丁酸梭菌菌體生長的無機(jī)氮源，菌體濃度達(dá)到1.91×108個/ml，顯著高于(除硫酸銨外)其他處理組(P＜0.05)。

2.1.4 無機(jī)氮源添加量的篩選

對無機(jī)氮源添加量進(jìn)行篩選，由圖5 可以看出，當(dāng)檸檬酸銨濃度提高到一定范圍后，菌體濃度并沒有隨著其提高而繼續(xù)增加，0.30%添加量組與0.40%添加組沒有顯著差異（P＞0.05），因此將檸檬酸銨的添加量定為0.3%，菌體濃度達(dá)到2.14×108個/ml，極顯著高于其他三個添加水平（P＜0.01）。

圖4 不同無機(jī)氮源對丁酸梭菌菌體濃度的影響

圖5 檸檬酸銨濃度對丁酸梭菌菌體濃度的影響

2.1.5 碳源的篩選

不同碳源種類篩選結(jié)果如圖6所示。由圖6可知，當(dāng)葡萄糖作為碳源時，丁酸梭菌菌體生長最佳，菌體濃度達(dá)到2.9×108個/ml，顯著高于其他處理組（P＜0.05）。

2.1.6 碳源添加量的篩選

確定最佳碳源種類后對添加量進(jìn)行篩選，其結(jié)果如圖7 所示。葡萄糖添加量為2%時菌體濃度最高，達(dá)到2.91× 108個/ml，與2.5%添加組沒有顯著差異（P＞0.05），與其他處理組差異極顯著（P＜0.01）。

2.1.7 除氧劑的篩選

除氧劑篩選結(jié)果如圖8 所示，與空白對照組相比，添加不同除氧劑后提高了丁酸梭菌的菌體濃度，其中抗壞血酸的除氧效果最佳，菌體濃度達(dá)4.3×108個/ml，極顯著高于其他處理組（P＜0.01）。

圖6 不同碳源對丁酸梭菌菌體濃度的影響

圖7 葡萄糖濃度對丁酸梭菌菌體濃度的影響

圖8 除氧劑對丁酸梭菌菌體濃度的影響

2.1.8 除氧劑添加量的篩選

結(jié)果如圖9所示，0.05%的添加量最適合丁酸梭菌的生長，菌體濃度達(dá)4.9×108個/ml，菌體濃度隨著抗壞血酸濃度的增加呈現(xiàn)不同程度的下降。因此，綜合上述試驗結(jié)果，最終選擇抗壞血酸作為除氧劑且添加量為0.05%。

圖9 抗壞血酸濃度對丁酸梭菌菌體濃度的影響

2.1.9 磷酸氫二鉀最佳濃度的篩選

磷酸氫二鉀最佳濃度的篩選結(jié)果如圖10 所示，由圖10可以看出，磷酸氫二鉀的添加量為0.3%時，菌體濃度最高，達(dá)4.73×108個/ml，顯著高于其他處理組（P＜0.05）。

圖10 磷酸氫二鉀濃度對丁酸梭菌菌體濃度的影響

2.2 正交試驗

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，選取葡萄糖（A）、復(fù)合有機(jī)氮源（B）以及磷酸氫二鉀（C）三個對菌體濃度的影響較大的三個因素，綜合其最佳濃度設(shè)計L9(34)正交試驗，每個組合進(jìn)行三次重復(fù)試驗，以確定在上述三個因素的作用下適合丁酸梭菌生長的最優(yōu)組合方案。正交試驗因素水平表見表1，正交試驗設(shè)計與結(jié)果見表2，方差分析見表3。

表1 正交試驗因素水平

由表2 和表3 可知，綜合極差分析和方差分析結(jié)果，各影響因素的主次順序為：葡萄糖＞復(fù)合氮源＞磷酸氫二鉀，且三個因素的水平均對試驗結(jié)果有極顯著影響（P＜0.01）。因此，根據(jù)試驗結(jié)果確定最優(yōu)組合方案為A2B1C3，即發(fā)酵培養(yǎng)基中葡萄糖濃度為2%，復(fù)合氮源（大豆蛋白胨∶酵母浸粉=1∶2）濃度為0.5%，磷酸氫二鉀濃度為0.4%。

表2 正交試驗設(shè)計方案與結(jié)果

表3 正交試驗方差分析

2.3 最優(yōu)組合驗證試驗

為了確定最佳培養(yǎng)基組合方案的穩(wěn)定性，根據(jù)直觀分析和方差分析得出的最優(yōu)組合方案，進(jìn)行進(jìn)一步的驗證試驗。即培養(yǎng)基各組分分別為：1.67 g/l 大豆蛋白胨、3.33 g/l 酵母浸粉、20 g/l 葡萄糖、3 g/l 檸檬酸銨、5 g/l 氯化鈉、4 g/l 磷酸氫二鉀、5 g/l 增效劑、2 g/l碳酸鈣、0.5 g/l 抗壞血酸，調(diào)初始pH 值為(7.1±0.1)，37 ℃培養(yǎng)24 h后測定菌體濃度。結(jié)果為在該條件下丁酸梭菌的菌體濃度達(dá)4.75×108個/ml，高于組合表中的最高值。綜合單因素試驗和正交試驗結(jié)果，丁酸梭菌菌體濃度較優(yōu)化前提高了3.3倍。

3 討論

目前，專門用于培養(yǎng)丁酸梭菌的培養(yǎng)基很少見，且通過優(yōu)化丁酸梭菌發(fā)酵培養(yǎng)基組分來提高生物量的研究較少，主要集中在提高其代謝產(chǎn)物丁酸、1,3-丙二醇或氫氣的產(chǎn)量上，丁酸梭菌的生物量普遍不高。本實驗室從動物腸道內(nèi)容物以及新鮮糞便中分離出一株生物學(xué)特性和抗逆性優(yōu)異的丁酸梭菌CGMCC No.8187。該菌株可以產(chǎn)生纖維素酶和淀粉酶，能水解纖維素和淀粉等碳水化合物生成低聚糖供有益菌利用；通過產(chǎn)生氫氣、SOD 和NADH 氧化酶等來提高機(jī)體的抗氧化能力；同時耐高溫、耐胃腸液[5]。丁酸梭菌與其他微生物一樣，生長和代謝過程受其培養(yǎng)條件的影響。因此，通過優(yōu)化丁酸梭菌的發(fā)酵培養(yǎng)基組分來提高其生物量，降低生產(chǎn)成本，為工業(yè)上大規(guī)模生產(chǎn)丁酸梭菌制劑提供有價值的參考。

本試驗首先采用單因素試驗對初始發(fā)酵培養(yǎng)基里的各組分進(jìn)行優(yōu)化，篩選出最適合丁酸梭菌生長的碳源、氮源和除氧劑的種類及濃度。對單一有機(jī)氮源種類進(jìn)行篩選后發(fā)現(xiàn)，大豆蛋白胨是最適合丁酸梭菌生長的有機(jī)氮源，其次是酵母浸粉。這與邢宏觀[7]的研究結(jié)果大致相同。進(jìn)行后續(xù)優(yōu)化發(fā)現(xiàn)，添加復(fù)合有機(jī)氮源的效果更好，并最終確定大豆蛋白胨∶酵母浸粉的添加比例為1∶2。接著又對培養(yǎng)基中無機(jī)氮源的種類和濃度進(jìn)行了篩選，確定檸檬酸銨效果最佳，其最適添加濃度為0.3%。碳源優(yōu)化結(jié)果發(fā)現(xiàn)葡萄糖是最適合丁酸梭菌生長的碳源，這與戚薇等[8]和耿正穎[9]的研究結(jié)果吻合，并進(jìn)一步優(yōu)化得出2%的添加量最適合丁酸梭菌生長，且隨著濃度的增高菌體濃度呈下降的趨勢。丁酸梭菌與大多數(shù)細(xì)菌一樣，在發(fā)酵過程中也存在碳溢流代謝現(xiàn)象，即當(dāng)培養(yǎng)基中的碳源豐富時，糖酵解途徑產(chǎn)生的丙酮酸不完全進(jìn)入三羧酸循環(huán)，而是產(chǎn)生例如乙酸和乳酸等代謝產(chǎn)物[10]。丁酸梭菌作為嚴(yán)格的厭氧微生物，主要通過發(fā)酵葡萄糖以糖酵解途徑和代謝過程中產(chǎn)生的乙酸、丁酸等給細(xì)胞供能。但當(dāng)培養(yǎng)基中碳源豐富發(fā)生碳溢流代謝時，不僅需要消耗ATP將產(chǎn)生的乙酸和丁酸分泌到胞外，同時也增加了其能量供給的壓力，從而影響了菌體的生長和代謝，這就是丁酸梭菌的酸脅迫效應(yīng)，大量有機(jī)酸的積累限制了丁酸梭菌的生長[11-12]。

除了酸脅迫效應(yīng)，氧氣是影響丁酸梭菌生長的另一個重要因素。丁酸梭菌對氧濃度極其敏感，Kawasaki 等[4]研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)培養(yǎng)基中有氧氣存在時，丁酸梭菌就會停止生長，但當(dāng)培養(yǎng)基中的氧氣除盡時又會重新開始正常生長。因此，考慮到這個因素，本試驗采取在培養(yǎng)基中加入還原性物質(zhì)來達(dá)到除氧的目的，結(jié)果表明添加除氧劑后均有促進(jìn)丁酸梭菌菌體生長的作用，其中抗壞血酸的效果最好，菌體量與不添加組相比提高了兩倍。隨后對抗壞血酸添加量進(jìn)行篩選后發(fā)現(xiàn)，0.5 g/l 的添加量最適合菌體生長，且隨著濃度的增加菌體濃度呈降低的趨勢，可能是由于添加過多的抗壞血酸影響了培養(yǎng)基的pH 值，進(jìn)而改變了菌體生長環(huán)境。

4 小結(jié)

在搖瓶階段根據(jù)單因素篩選試驗和正交試驗對丁酸梭菌發(fā)酵培養(yǎng)基組分進(jìn)行了優(yōu)化，最終確定的最佳培養(yǎng)基組合方案為：1.67 g/l大豆蛋白胨、3.33 g/l酵母浸粉、20 g/l 葡萄糖、3 g/l 檸檬酸銨、5 g/l 氯化鈉、4 g/l 磷酸氫二鉀、5 g/l 增效劑、2 g/l 碳酸鈣、0.5 g/l 抗壞血酸，調(diào)初始pH為（7.1±0.1），此條件下丁酸梭菌菌體濃度達(dá)4.75×108個/ml，較優(yōu)化前提高了3.3倍。