■程煒軒 許國(guó)煥 張 麗* 李 薇 印遇龍

（1.廣東省科學(xué)院微生物研究所，廣東廣州510070；2.廣東省菌種保藏與應(yīng)用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州510070；3.廣東省微生物應(yīng)用新技術(shù)公共實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州510070；4.華南應(yīng)用微生物國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州510070；5.廣東碧德生物科技有限公司，廣東廣州510663）

對(duì)于魚(yú)類，精氨酸是必需氨基酸之一，在體內(nèi)參與體內(nèi)蛋白質(zhì)的合成、尿素循環(huán)、肌酸(creatine)、多胺(polyamines)及一氧化氮(nitric oxide，NO)的合成。在魚(yú)類生長(zhǎng)、心血管、內(nèi)分泌、免疫等方面起著重要作用，且能促使多個(gè)脂解基因表達(dá)量增加[1]。精氨酸對(duì)魚(yú)類脂肪的調(diào)節(jié)途徑目前報(bào)道的有兩條途徑，其中一條是一氧化氮途徑[2]，另外一條是在大西洋鮭中發(fā)現(xiàn)的多胺途徑[3]。有研究指出，哺乳類動(dòng)物同時(shí)具有這兩條途徑，而且這兩條途徑在動(dòng)物某些細(xì)胞，如人內(nèi)皮細(xì)胞分化中起著競(jìng)爭(zhēng)性的相互抑制作用[4]。

動(dòng)物體內(nèi)的多胺按來(lái)源可分為內(nèi)源性多胺和外源性多胺，外源性多胺來(lái)源于母乳和飼料，內(nèi)源性多胺主要由動(dòng)物體組織自身合成，能夠與DNA 和RNA結(jié)合，從而影響轉(zhuǎn)錄和翻譯，對(duì)于細(xì)胞生長(zhǎng)和分化以及線粒體功能和完整性至關(guān)重要[3]。其體內(nèi)合成主要通過(guò)鳥(niǎo)氨酸脫羧酶(ornithine decarboxylase, ODC)、亞精胺合成酶以及精氨酸合成酶三步酶促反應(yīng)轉(zhuǎn)變而成。另外，多胺可以影響肉堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶-1 (CPT1)的活性，該酶是長(zhǎng)鏈脂肪酸β氧化的限速酶[5]，乙酰輔酶A羧化酶（Acetyl CoA carboxylase，ACC）催化生物體內(nèi)由乙酰輔酶A 轉(zhuǎn)變成丙二酰輔酶A 的化學(xué)反應(yīng)。制約著脂肪酸合成第一階段的速度。而脂肪酸合成酶（Fatty acid synthase, FAS）催化乙酰輔酶A 以及丙二酰輔酶A合成脂肪酸，是體內(nèi)脂肪合成的關(guān)鍵酶[6]。

尼羅羅非魚(yú)是我國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)養(yǎng)殖魚(yú)類，但是多胺途徑對(duì)于脂肪的調(diào)節(jié)作用以及與一氧化氮途徑的關(guān)系尚不明確。本研究用定量RT-PCR 方法檢測(cè)不同濃度精氨酸培養(yǎng)基孵育尼羅羅非魚(yú)肝細(xì)胞，并在孵育培養(yǎng)基中添加一氧化氮酶抑制劑及ODC 酶抑制劑，檢測(cè)多胺途徑相關(guān)基因ODC、SSAT、CPT1 以及ACC、FAS 兩個(gè)在脂肪酸合成起關(guān)鍵作用基因的影響。以期揭示精氨酸對(duì)尼羅羅非魚(yú)肝臟細(xì)胞多胺及脂肪酸代謝的影響以及多胺與一氧化氮途徑在調(diào)控脂肪代謝過(guò)程中是否存在相互干擾。為精氨酸通過(guò)多胺途徑調(diào)節(jié)脂肪代謝研究提供基礎(chǔ)參考資料。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)魚(yú)購(gòu)于廣東省羅非魚(yú)良種場(chǎng)(廣州市番禺區(qū)大穩(wěn)村)，購(gòu)回的羅非魚(yú)用普通商品飼料定時(shí)定量投喂，水溫(30±1) ℃，pH 值7.0，溶解氧8.0 mg/l 以上，氨氮濃度小于0.2 mg/l，一天投喂3次，投喂量為飽食量80%，飼養(yǎng)2 周以上，取3 尾尼羅羅非魚(yú)，體重為(150.98±2.13) g，進(jìn)行肝臟細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)。

1.2 肝臟細(xì)胞分離與RNA提取

飼喂后6 h，用MS222 麻醉羅非魚(yú)，使用胰蛋白酶消化法分別分離每尾魚(yú)的肝臟細(xì)胞[7]，混合后使用PBS 洗3 次后，將顆粒狀細(xì)胞懸浮在L-15 培養(yǎng)基內(nèi)，28 ℃，5% CO2孵育過(guò)夜后，置于24 孔板中準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)。所有L-15 培養(yǎng)基均加入了10%胎牛血清(cat#14-801F)，50 U/ml 青 霉 素/鏈 霉 素(cat#17-602E)和2% GlutamaxTM100×(cat#35056)。

在24 孔板內(nèi)，將每孔細(xì)胞稀釋至8×106個(gè)/cm2，28 ℃孵育24 h，細(xì)胞貼壁后，換新鮮培養(yǎng)基，實(shí)測(cè)精氨酸濃度為1.79 mM，另外配置高精氨酸含量培養(yǎng)基，在原培養(yǎng)基基礎(chǔ)上加入L-精氨酸(A8094)，使精氨酸終濃度為3.60 mM。精氨酸測(cè)定方法與之前的研究相同[8]。每組28 ℃孵育24 h后，進(jìn)行以下處理，分出2組維持原培養(yǎng)基，記為L(zhǎng)A 組與HA 組，分出2 組分別在LA 組及HA 的培養(yǎng)基基礎(chǔ)上加入1 mM ODC 酶抑制劑二氟甲鳥(niǎo)氨酸(DFMO)，記為DFMO-LA組與DFMO-HA 組，另外2 組分別在LA 組及HA 的培養(yǎng)基基礎(chǔ)上加入100 μΜ一氧化氮酶活抑制劑(L-NMMA)，記為L(zhǎng)-NMMA-LA 組與L-NMMA-HA 組，每組6 孔，28 ℃孵育24 h后，細(xì)胞用胰蛋白酶消化，待細(xì)胞完全溶解后，于冷凍離心機(jī)中2 200 r/min 離心5 min。然后將沉淀溶解在RNA later 中，-80 ℃保存。使用RNeasy Plus Mini kit(Germany)試劑盒提取RNA。

1.3 cDNA第一鏈合成與熒光定量PCR

逆轉(zhuǎn)錄過(guò)程則使用TaqMan Gold RT-PCR Kit(USA)試劑盒，取500 ng RNA 按以下程序進(jìn)行：25 ℃10 min，60 ℃48 min，95 ℃5 min，得到的cDNA-20 ℃保存，熒光定量PCR 則使用實(shí)時(shí)熒光定量?jī)xLightcycler 480(Switzerland)，按以下程序測(cè)定：以β-Actin作為參照基因，使用相應(yīng)引物(表1)，按照以下程序：95 ℃5 min，然后95 ℃10 s，60 ℃20 s，72 ℃30 s一個(gè)循環(huán)，共45個(gè)循環(huán)。完成后數(shù)據(jù)的處理按以下方法進(jìn)行。

表1 RT-PCR所用引物

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用ΔCt 法進(jìn)行目標(biāo)基因熒光定量分析；應(yīng)用SPSS 11.5軟件對(duì)獲得的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析(one-way ANOVA)和Duncan's 多重比較，所有數(shù)據(jù)以“平均值±SD”來(lái)表示，P＜0.05時(shí)表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同處理對(duì)尼羅羅非魚(yú)肝臟細(xì)胞ODC基因表達(dá)量的影響（見(jiàn)圖1）

圖1 各處理對(duì)尼羅羅非魚(yú)肝細(xì)胞ODC基因表達(dá)量的影響

由圖1 可知，與LA 組相比，DFMO-LA 組基因表達(dá)量顯著升高(P＜0.05)，L-NMMA-LA組與HA基因表達(dá)量顯著降低(P＜0.05)。與HA 組相比，DFMO-HA 組基因表達(dá)量顯著升高(P＜0.05)，而L-NMMA-HA 組無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。

2.2 不同處理對(duì)尼羅羅非魚(yú)肝臟細(xì)胞SSAT 基因表達(dá)量的影響（見(jiàn)圖2）

圖2 各處理對(duì)尼羅羅非魚(yú)肝細(xì)胞SSAT基因表達(dá)量的影響

由圖2 可知，與LA 組相比，DFMO-LA 組基因表達(dá)量顯著降低(P＜0.05)，而L-NMMA-LA 組基因表達(dá)量顯著升高(P＜0.05)，HA組基因表達(dá)量無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。與HA 組相比，DFMO-HA 組基因表達(dá)量降低但無(wú)顯著性差異(P＞0.05)，而L-NMMA-HA 組基因表達(dá)量顯著升高(P＜0.05)。

2.3 不同處理對(duì)尼羅羅非魚(yú)肝臟細(xì)胞CPT-1基因表達(dá)量的影響（見(jiàn)圖3）

圖3 各處理對(duì)尼羅羅非魚(yú)肝細(xì)胞CPT-1基因表達(dá)量的影響

由圖3 可知，與LA 組相比，L-NMMA-LA 組基因表達(dá)量顯著降低(P＜0.05)，而HA 組與DFMO-LA 組則無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。與HA 組相比，L-NMMAHA組基因表達(dá)量顯著降低(P＜0.05)，而DFMO-HA組則無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。

2.4 不同處理對(duì)尼羅羅非魚(yú)肝臟細(xì)胞ACC與FAS基因表達(dá)量的影響（見(jiàn)圖4）

圖4 各處理對(duì)尼羅羅非魚(yú)肝細(xì)胞ACC與FAS基因表達(dá)量的影響

由圖4 可知，與LA 組ACC 基因相比，DFMO-LA組ACC 基因表達(dá)量顯著降低(P＜0.05)，而與L-NMMA-LA 組無(wú)顯著性差異(P＞0.05)，與HA 組相比，DFMO-HA 組ACC 基因表達(dá)量顯著降低(P＜0.05)；與LA組FAS 基因相比，DFMO-LA 與L-NMMA-LA 組FAS基因表達(dá)量無(wú)顯著性差異(P＞0.05) ，而HA組表達(dá)量顯著降低(P＜0.05)；與HA 組相比，DFMO-HA 與L-NMMA-HA組FAS基因表達(dá)量無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。

3 討論

在長(zhǎng)期實(shí)驗(yàn)中，由于動(dòng)物對(duì)精氨酸逐漸適應(yīng)，攝入高濃度精氨酸未能觀察到精氨酸代謝相關(guān)基因表達(dá)量以及體重的顯著性差異[9]。因此短期的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)?zāi)芨媒沂緞?dòng)物對(duì)精氨酸的反應(yīng)機(jī)理。DFMO 是ODC 酶活的抑制劑。結(jié)果顯示，DFMO 處理下，無(wú)論培養(yǎng)基中精氨酸濃度高低，ODC基因表達(dá)量都顯著升高，可以預(yù)料這是因?yàn)镈FMO 抑制ODC 酶活，然后由于腐胺的耗盡，細(xì)胞上調(diào)ODC 基因表達(dá)[10]。在3T3-L1細(xì)胞中，DFMO會(huì)下調(diào)SSAT基因，從而影響多胺的轉(zhuǎn)化[11]，而尼羅羅非魚(yú)肝臟細(xì)胞SSAT 基因也同樣下調(diào)，SSAT 的下調(diào)將提高乙酰輔酶A 的細(xì)胞濃度[12]，而ACC 催化生物體內(nèi)由乙酰輔酶A 轉(zhuǎn)變成丙二酰輔酶A的化學(xué)反應(yīng)，因此將導(dǎo)致細(xì)胞ACC基因的下調(diào)。

ODC 和一氧化氮酶（NOS）的活性均依賴于通用底物L(fēng)-精氨酸，該底物可被NOS 直接加工成一氧化氮（NO）和L-瓜氨酸，或者在尿素循環(huán)中精氨酸酶作用于精氨酸以產(chǎn)生鳥(niǎo)氨酸，然后鳥(niǎo)氨酸進(jìn)入多胺生物合成。有文獻(xiàn)表明，NO能夠抑制ODC活性，而多胺則可以抑制NOS活性[13]。這些結(jié)果都表明這兩種代謝途徑可能在調(diào)節(jié)某些生理功能的過(guò)程中相互干擾，L-NMMA是NOS酶的抑制劑，L-NMMA處理下，在精氨酸含量較低的情況下，ODC基因表達(dá)量降低，估計(jì)這是因?yàn)長(zhǎng)-NMMA抑制NOS活性，導(dǎo)致更多鳥(niǎo)氨酸進(jìn)入多胺生物合成，導(dǎo)致細(xì)胞下調(diào)ODC表達(dá)量。而精氨酸含量較高的情況下，HA組ODC表達(dá)量已經(jīng)出現(xiàn)顯著性下調(diào)，可能與較多的精氨酸經(jīng)精氨酸酶轉(zhuǎn)化為鳥(niǎo)氨酸進(jìn)入多胺生物合成有關(guān)，細(xì)胞SSAT表達(dá)量上調(diào)，將對(duì)CPT-1起抑制作用，后者是長(zhǎng)鏈脂肪酸β 氧化的限速酶[14]。

DFMO 與L-NMMA 處理對(duì)FAS 的基因表達(dá)量都沒(méi)有產(chǎn)生顯著性變化，反而是培養(yǎng)基中高濃度精氨酸下調(diào)FAS基因的表達(dá)量，表明在本研究設(shè)定的精氨酸含量范圍以內(nèi)，高精氨酸濃度對(duì)于尼羅羅非魚(yú)脂肪酸合成有抑制作用。如前所述，尼羅羅非魚(yú)細(xì)胞多胺途徑與一氧化氮途徑在調(diào)控脂肪代謝的過(guò)程中存在相互干擾的現(xiàn)象。但是由于精氨酸濃度范圍的限制，具體推論仍需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

4 結(jié)論

①高精氨酸濃度對(duì)于尼羅羅非魚(yú)脂肪酸合成有抑制作用。

②尼羅羅非魚(yú)細(xì)胞多胺途徑與一氧化氮途徑在調(diào)控脂肪代謝的過(guò)程中存在相互干擾。