楊冠群 郭 春 魏海峰 周 煜 周曙杰 梁晨希 吳國境 許博涵 鄒永新 張曉杰 孫淑娜

1山東大學齊魯醫(yī)學院基礎醫(yī)學院遺傳學系，山東濟南，250012； 2山東中醫(yī)藥大學，山東濟南，250355；3山東中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院皮膚科，山東濟南，250011

龍膽瀉肝湯由龍膽草、梔子、黃芩、木通、澤瀉等十味中草藥配制而成[1]，是一種具備清肝利膽，瀉實火清濕熱之效用的清熱藥劑[2]。近年來,龍膽瀉肝湯已廣泛應用于中醫(yī)臨床皮膚科,并對銀屑病癥狀的改善有良好的效果[3]，但作用靶點和分子機制還未被了解，細胞和分子水平的作用效果也尚未得到驗證。銀屑病患者皮損處的表皮角質(zhì)形成細胞異常增殖是其最顯著的病理特征之一[4]，本研究利用人永生化角質(zhì)形成細胞分析了龍膽瀉肝湯對銀屑病皮損處角質(zhì)形成細胞凋亡的影響以及機制，為解釋龍膽瀉肝湯治療銀屑病的臨床作用機制提供可靠的理論依據(jù)和實驗數(shù)據(jù)。

1 實驗材料

1.1 細胞株 人永生化角質(zhì)形成細胞：武漢大學保藏中心 (china center for type culture collection， CCTCC)， 資源編號3142C0001000001712。

1.2 主要試劑 細胞培養(yǎng)用胰蛋白酶、DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清：美國Gibco生命技術(shù)公司；RIPA裂解液，Tunel凋亡染色試劑盒：上海碧云天公司；DAPI：西格瑪公司；Trizol RNA提取裂解液：美國英杰生命技術(shù)有限公司；Western blot用一抗：美國圣克魯斯生物技術(shù)公司；Western blot用辣根過氧化物酶(HRP)標記的二抗：北京ZSGB-Gio公司；Western blot ECL化學發(fā)光法檢測試劑盒：碧云天生物技術(shù)有限公司；Caspase-3抑制劑Z-DEVD-FMK：MedChem Express公司；PCR引物：上海Sangon Biotech公司；LightCycler 480 SYBR Green I Master：瑞士ROCHE公司；cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒：天根生化科技(北京)有限公司。

1.3 藥品 龍膽瀉肝湯藥液：龍膽草12 g、山梔18 g、澤瀉24 g、黃芩18 g、柴胡20 g、生地黃40 g、車前子18 g、當歸16 g、甘草12 g。將上述中藥濃縮成2 mL相當于3 g原中藥材的藥液，在超凈臺內(nèi)過濾除菌，于4℃冰箱保存?zhèn)溆?。細胞培養(yǎng)時稀釋到相應終濃度。

1.4 主要儀器 CO2培養(yǎng)箱(美國Thermo公司)、生物安全柜(美國Thermo公司)、倒置熒光顯微鏡(日本奧林巴斯株式會社)、熒光定量PCR儀(美國ABI公司)、蛋白垂直電泳系統(tǒng)(美國伯樂生命Bio-Rad產(chǎn)品有限公司)。

2 實驗方法

2.1 細胞培養(yǎng) 用DMEM培養(yǎng)基(含10%胎牛血清)培養(yǎng)HaCaT細胞，每24 h換液。取狀態(tài)較好的對數(shù)生長期HaCaT細胞進行實驗。藥物組，100 μg/mL藥液的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)72 h；對照組，含與藥物組藥物等體積去離子水的DMEM培養(yǎng)基同等條件下培養(yǎng)72 h。

2.2 Tunel法檢測細胞凋亡 等體積不同藥物濃度梯度的DMEM培養(yǎng)基同等條件下培養(yǎng)，設置藥物濃度梯度為：0 μg/mL，20 μg/mL，40 μg/mL，80 μg/mL，100 μg/mL。參照Tunel染色試劑盒說明書嚴格操作，用含有DAPI(4’,6-二脒基-2-苯基吲哚)的抗熒光淬滅封片液封片后，在熒光顯微鏡下觀察。每組細胞隨機選擇3個高倍鏡(×200)視野，每個視野計數(shù)100個細胞，計算HaCaT細胞凋亡率。凋亡率=BrdU陽性細胞/100×100%。取3個視野的平均百分數(shù)作為結(jié)果，實驗重復三次。

2.3 Western blot用RIPA裂解液冰上裂解提取藥物處理組的HaCaT細胞總蛋白 用BCA蛋白標準曲線法進行蛋白質(zhì)定量檢測；取40 μg樣品變性；SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜，在含5%脫脂奶粉的TBST封閉液中封閉(25℃，1 h)，一抗孵育(4℃，12 h)，TBST溶液洗膜三次，5 min/次，二抗孵育(37℃，1 h)，TBST溶液洗膜三次，5 min/次；ECL化學發(fā)光，顯影定影，膠片曝光，結(jié)果使用掃描儀掃描保存。實驗重復三次。

2.4 實時定量PCR 使用Trizol法裂解藥物處理的HaCaT細胞提取RNA，并參照說明書進行逆轉(zhuǎn)錄。實時定量PCR檢測，每個樣品設4個復孔。反應體系：每10 μL反應體系包括去離子水4.2 μL、cDNA 0.5 μL、逆轉(zhuǎn)錄引物0.3 μL、Light Cycler 480 SYBR Green I Master試劑5 μL。反應條件：預變性94℃，3 min；變性95℃，30 s；退火60℃，30 s；延伸72℃，30 s。共40個循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參，應用Roche Light Cycler 480自帶分析程序比較不同樣本同一目的基因的表達變化情況，并進行分析。引物序列見表1。實驗重復三次。

表1 引物序列

2.5 統(tǒng)計學方法 用SPSS 22.0(Windows)統(tǒng)計軟件處理上述實驗數(shù)據(jù)，采用單因素方差分析，組間數(shù)據(jù)應用t檢驗分析評價。以P<0.05為有統(tǒng)計學差異。

3 結(jié)果

3.1 龍膽瀉肝湯誘導HaCaT細胞凋亡 80 μg/mL龍膽瀉肝湯處理72 h后，在倒置顯微鏡下觀察，實驗組與未使用藥物處理的對照組相比，細胞的增殖受到明顯抑制。具體表現(xiàn)為：可見原來貼壁生長的細胞逐漸脫落，細胞體積減小、形狀變圓、折光性增強(圖1a)；DAPI染色后在熒光鏡下觀察，明顯可見細胞顯現(xiàn)出典型的凋亡細胞狀態(tài)(圖1b)，細胞核裂解為大小不等的凋亡小體。

Tunel染色結(jié)果顯示，龍膽瀉肝湯處理72 h后的HaCaT細胞與未經(jīng)處理的細胞凋亡比例相比，實驗組的 HaCaT細胞Tunel陽性染色細胞比例明顯上調(diào)，并且與龍膽瀉肝湯處理濃度的增加呈正相關(guān)(圖1c)，提示龍膽瀉肝湯誘導凋亡的作用呈劑量依賴性增加。

1a:對照組和藥物組倒置光學顯微鏡進行觀察；1b:熒光顯微鏡下觀察藥物組細胞凋亡，白色箭頭指示凋亡細胞；1c:Tunel檢測凋亡實驗。標尺，50 μm。與對照組比較，**：P<0.01；***：P<0.001

3.2 龍膽瀉肝湯抑制Bcl-2的表達，促進Bax的表達 為了明確龍膽瀉肝湯誘導HaCaT凋亡的作用機制，我們利用western blot分析了兩組HaCaT細胞內(nèi)調(diào)控細胞凋亡的關(guān)鍵基因Bcl-2和Bax表達量的變化，結(jié)果如圖2所示：40 μg/mL龍膽瀉肝湯處理72 h后細胞內(nèi)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達明顯下降，同時促凋亡蛋白Bax的表達有明顯上調(diào)(圖2a)。實時定量PCR結(jié)果與檢測到的蛋白水平的變化相一致，實驗組細胞內(nèi)Bcl-2的mRNA也有明顯下降，而Bax的mRNA有明顯上調(diào)(圖2b)。

2a：western blot實驗；2b：實時定量PCR *:P<0.05

3.3 龍膽瀉肝湯通過激活caspase 3依賴的途徑誘導細胞凋亡 caspase-3蛋白的激活在細胞凋亡過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，因此我們隨后對caspase-3的蛋白水平進行了檢測。結(jié)果顯示40 μg/mL濃度的龍膽瀉肝湯處理HaCaT細胞72 h后，無論是總蛋白水平還是活性caspase-3水平均有明顯的增加。為了進一步明確結(jié)論，我們使用caspase-3特異性抑制劑Z-DEVD-FMK(終濃度50 μM)預處理細胞2 h后再加入40 μg/mL龍膽瀉肝湯繼續(xù)培養(yǎng)細胞72 h。Tunel染色結(jié)果顯示， Z-DEVD-FMK可有效拯救藥液誘導的細胞凋亡。這些結(jié)果提示龍膽瀉肝湯可通過上調(diào)caspase-3誘導HaCaT細胞凋亡。

4 討論

銀屑病是一類臨床上常見的皮膚病[5]。據(jù)統(tǒng)計，銀屑病的全球平均發(fā)病率為2%～3%，在發(fā)達國家能達到4%～6%，而且多數(shù)銀屑病患者年齡在40歲以下[6,7]。銀屑病具有病程長、易復發(fā)的特點，很多患者終生不愈，生活質(zhì)量嚴重下降，患者不僅遭受著身心的折磨，其家庭乃至整個社會也承受著沉重的負擔[8]。相比目前常用的免疫抑制療法，傳統(tǒng)的中醫(yī)在銀屑病治療時在改善病情的同時，還展現(xiàn)出緩解期長、不良反應小等獨特優(yōu)勢。龍膽瀉肝湯具備清肝利膽，瀉實火清濕熱之效用，是中醫(yī)藥領(lǐng)域經(jīng)典的清熱方劑[2]，臨床上主要用于治療肝膽實火、目赤頭疼、口苦脅痛、耳聾耳腫、陰癢陰腫等癥狀[18]。近年來，龍膽瀉肝湯在銀屑病治療中也表現(xiàn)出較好的療效[2]，但其作用靶點和分子機制尚不清楚，細胞和分子水平的作用效果也尚未得到驗證。

3a: western blot實驗;3b: Caspase-3抑制劑逆轉(zhuǎn)Tunel法凋亡實驗，與對照組比較，**：P<0.01；***：P<0.001

角質(zhì)形成細胞(keratinocyte, KC)可以通過發(fā)揮防御病原體、隔離紫外線、防止水分蒸發(fā)等多種重要作用，維持皮膚的正常結(jié)構(gòu)和功能。KC增殖分化凋亡發(fā)生異常時可能會導致以銀屑病為代表的多種角化性皮膚病或其他表皮腫瘤。銀屑病皮損處存在明顯的KC增殖分化異常，例如，不完全的KC分化和成熟縮短(角化不全)以及KC增厚(角化過度)導致表皮的高增殖和棘層的肥厚，這種變化的結(jié)局是KC的異常積聚，形成鱗狀皮屑[7-9]。此外，細胞因子對銀屑病病程的發(fā)展也發(fā)揮著不容忽視的作用。皮損處活化T細胞產(chǎn)生的TNF、INF-γ、IL-17和IL-22等細胞因子可以活化KC內(nèi)NF-κB 和STAT3等信號通路，誘導KC異常增殖分化發(fā)揮作用。進一步研究證明KC也是產(chǎn)生細胞因子的重要細胞[8]，激活的KC又可以產(chǎn)生IL-1b,IL-6、IL-8、TNF-α、CXCL1、CXCL5、CXCL8、CXCL9、CXCL10、CCL2、CCL5、CCL20、LL37等，趨化多種炎性細胞，從而使皮損處及皮損周圍的炎癥反應級聯(lián)放大，形成一個惡性循環(huán)[7,8,10]。因此，抑制KC的過度增生對臨床治療銀屑病有著重要的實踐意義。紫外光療，外用維A酸、維生素D類似物以及注射水合鈣離子等臨床療法均是通過抑制KC增殖或誘導細胞凋亡實現(xiàn)其治療目的[7]。

誘導細胞凋亡是治療包括腫瘤在內(nèi)多種細胞異常增生疾病的有效途徑。在銀屑病治療中，誘導皮損處異常增殖KC凋亡也是緩解銀屑病的有效方法之一[11]，如紫外線光療。Bcl-2和Bax是調(diào)控細胞凋亡的兩個經(jīng)典“開關(guān)蛋白”。Bcl-2的激活和表達抑制細胞凋亡，而Bax在細胞內(nèi)發(fā)揮著促凋亡作用[12,13]。上述的實驗結(jié)果告訴我們龍膽瀉肝湯對人HaCaT細胞起著明顯的誘導凋亡的作用，而且這種誘導作用伴隨著Bcl-2的顯著下調(diào)和Bax的顯著上調(diào)。鑒于Bcl-2和Bax在凋亡中的重要功能，這些結(jié)果提示龍膽瀉肝湯可能通過調(diào)控Bcl家族成員的表達來實現(xiàn)對凋亡的誘導。

天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶(Caspase)家族級聯(lián)反應最下游的蛋白酶caspase-3是凋亡過程的關(guān)鍵執(zhí)行因子[14]，尤其當細胞出現(xiàn)染色質(zhì)凝結(jié)和DNA裂解時[15,16]并且有研究證實Bcl-2和Bax以及caspase-3相互影響，共同調(diào)控細胞的凋亡進程[17]。我們的結(jié)果顯示龍膽瀉肝湯可導致HaCaT細胞內(nèi)caspase-3激活，而抑制caspase-3的活性能有效逆轉(zhuǎn)龍膽瀉肝湯誘導的HaCaT細胞凋亡。因此，龍膽瀉肝湯可通過激活caspase-3途徑實現(xiàn)對HaCaT細胞的凋亡誘導作用。然而龍膽瀉肝湯對Bax和Bcl-2表達調(diào)控的具體機制如何？龍膽瀉肝湯是否直接調(diào)控Bax和Bcl-2來實現(xiàn)caspase-3的激活？龍膽瀉肝湯是否還有其他的細胞凋亡調(diào)控靶點？此外，藥物對細胞增殖抑制作用可能通過細胞毒性也可以通過凋亡和壞死等途徑。我們發(fā)現(xiàn)低濃度龍膽瀉肝湯就可以顯著誘導細胞凋亡并激活凋亡關(guān)鍵標志物活性caspase-3的表達，提示凋亡途徑在龍膽瀉肝湯抑制HaCaT細胞增殖中具有重要意義。但同時，我們只進行了Tunel染色和活性caspase-3檢測，不能排除其他途徑也在該過程中發(fā)揮作用。針對這些問題還有待于在下一步工作中進一步研究。