楊 艷 陳 荃 劉玉梅 周 欣 田 歆 高愛莉 熊斯穎 陳曉吟 李 薇 朱慧蘭

廣州市皮膚病防治所，廣東廣州，510095

特應(yīng)性皮炎(atopic dermatitis, AD)是臨床較為常見的一種慢性炎癥性皮膚病，具有明顯的遺傳因素并受到環(huán)境因素的影響。單卵雙胎和雙卵雙胎中AD的一致率分別為77%和15%[1]。研究發(fā)現(xiàn)，AD可能與皮膚內(nèi)發(fā)生的免疫功能失調(diào)有關(guān)，T輔助(Th)-1和Th-2細(xì)胞的細(xì)胞因子之間失衡在AD的病理生理中起著重要作用。因此，研究細(xì)胞因子基因的單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphisms，SNPs)與AD的發(fā)病機(jī)制之間的關(guān)系具有重要的意義[2]。IL-33同時(shí)具備前炎癥因子和抗炎癥因子的雙重作用：一方面它參與了變態(tài)反應(yīng)性疾病中Th2介導(dǎo)的炎癥應(yīng)答；另一方面，它在動(dòng)脈粥樣硬化、2型糖尿病、肥胖以及心肌重構(gòu)等病理過程中發(fā)揮保護(hù)作用[3]；同時(shí)，IL-33也被認(rèn)為是連接天然免疫與獲得性免疫防御的重要橋梁[4]。IL-33和其受體IL1RL1結(jié)合發(fā)揮生理作用。本研究旨在探討中國漢族人群IL-33和IL1RL1基因SNPs與AD易感性的相關(guān)性。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 該研究納入了2015年3月至2018年3月在我院皮膚科接受治療的AD患者89例，作為AD組。AD的臨床診斷及病變程度判斷均是根據(jù)Hanifin和Rajka標(biāo)準(zhǔn)[5]，包括中度組和重度組。同時(shí)納入了138例無AD病史的健康受試者作為對(duì)照組。該項(xiàng)目得到了本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)的審查和批準(zhǔn)。在采血之前，從所有受試者處獲得了知情同意書。

1.2 主要試劑 AxyGene小量全血基因組DNA提取試劑盒購自長春百奧公司，SNaPshot多重分析試劑盒由上海Invitrogen有限公司提供，dNTP-mix由北京全式金公司提供，Platinum Taq聚合酶，SAP，ExoI，DNAmarker由上海 Invitrogen 有限公司提供，其他常用試劑均為國內(nèi)分析純?cè)噭?/p>

1.3 方法

1.3.1 DNA抽提和PCR擴(kuò)增 采靜脈血2 mL，按照AxyGene小量全血基因組DNA試劑盒說明書提取 DNA，加入1×TE 緩沖液溶解，4℃儲(chǔ)存?zhèn)溆?。引物由上海Invitrogen有限公司設(shè)計(jì)和合成。

1.3.2 PCR反應(yīng)體系的優(yōu)化 PCR擴(kuò)增體系(40.0 μL):模板DNA 2.0 μL，10×PCR Buffer(Mg2+free)4.0 μL，10 mM dNTP 1.0 μL，上、下游引物混合液各1.0 μL，ddH2O 30.0 μL, MgCl2(50 mM)1.6 μL，Platinum Taq酶(5U)0.4 μL?；靹蚝笾糜赑CR熱循環(huán)儀(Bio Rad公司，美國) 進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性2 min，94℃變性20 s, 55℃退火30 s, 72℃延伸 40 s，共33循環(huán)，最后72℃延伸10 min，4℃保存。1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，由上海 Invitrogen有限公司優(yōu)化。

1.3.3 PCR產(chǎn)物及延伸產(chǎn)物的純化 根據(jù)文獻(xiàn)研究及課題組既往研究，IL-33基因的[密碼子(codon，cdn)10 C/T和cdn 25 G/C]和IL1RL1基因的(-1092 A/G，-592 A/C和-819 T/C)可能與AD具有相關(guān)性，因此，以IL-33基因的[密碼子(codon，cdn)10 C/T和cdn 25 G/C)]和IL1RL1基因的(-1092 A/G，-592 A/C和-819 T/C)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)作為目標(biāo)位點(diǎn)以分析其與AD之間的相關(guān)性。PCR反應(yīng)體系總體積10.0 μL，其中 ddH2O 7.5 μL；SAP(1 U/μL)0.3 μL； ExoI(20 U/μL)0.2 μL； PCR產(chǎn)物2.0 μL震蕩混勻，37℃保溫100 min，75℃保溫存放15 min滅活ExoI酶和SAP，4℃保存24 h。SNaPshot延伸反應(yīng)的優(yōu)化：總體積5.0 μL，PCR產(chǎn)物1.5 μL，Probe Mix 1.0 μL，Reaction mix 2.5 μL。延伸反應(yīng)條件:96℃變性10 s，51℃退火 5 s，60℃延伸30 s，共25循環(huán)，4℃保存。延伸產(chǎn)物純化：總體積8.0 μL，其中 ddH2O 2.5 μL，SAP(1 U/μL)0.5 μL，延伸產(chǎn)物5.0 μL震蕩混勻，37℃放置1 h，75℃保溫15 min滅活SAP 酶，4℃保存24 h。

1.3.4 測序 使用3730XL型DNA 測序儀(Applied Biosystems公司，美國)，對(duì)樣本進(jìn)行測序，委托上海Invitrogen有限公司進(jìn)行。比較兩組患者的IL-33[密碼子(codon，cdn)10 C/T和cdn 25 G/C]和IL1RL1(-1092 A/G，-592 A/C和-819 T/C)的等位基因、基因型和單倍型的頻率。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，2組患者間的等位基因、基因型和單倍型的頻率比較采用χ2檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 患者的一般臨床特征 本研究共納入89例AD患者，其中男52例，女37例，患者平均年齡(15.34±1.34)歲。依據(jù)病變程度，中度和重度AD患者分別為52例(58.4%)和37例(41.6%)。80例(89.90%)患者有AD家族史。67.4%患者皮膚點(diǎn)刺試驗(yàn)≥1種過敏原陽性，外周血嗜酸粒細(xì)胞平均數(shù)為269/mm3，血清總IgE中位數(shù)為33 IU/mL。

2.2 兩組受試者的等位基因和基因型頻率比較 AD患者的IL-33密碼子cdn10 C等位基因的頻率顯著增加(P<0.001，OR=6.77)，而在相同位置的T等位基因的頻率顯著下降(P<0.001，OR=0.14)。對(duì)照組中IL-33 cdn 25 G等位基因的頻率顯著高于AD患者(P<0.001，OR=0.08)。IL-33 cdn 10和25的CC(P<0.001，OR=15.10)和CG(P<0.001)基因型與AD易感性顯著正相關(guān)。兩組患者的IL1RL1基因的等位基因和基因型頻率無明顯差異(均P>0.05)。見表1。

2.3 不同組間受試者IL-33的單倍型頻率比較 AD患者的IL-33 CC型(36% vs 7.6%，P<0.001)和TC型(14% vs 0%，P<0.001)單倍型頻率顯著高于對(duì)照組。AD患者的IL-33 TG單倍型頻率顯著低于對(duì)照組(0% vs 52.5%，P<0.001)。見表2。重度組患者的IL-33 CC型(40.5% vs 9.6%，P<0.001)和TC型(24.3% vs 1.0%，P<0.001)單倍型頻率顯著高于中度組。重度組患者的IL-33 TG單倍型頻率顯著低于中度組(1.4% vs 58.7%，P<0.001)。見表3。

3 討論

AD是一種慢性復(fù)發(fā)性、瘙癢性、炎癥性皮膚病，約80% 成人患者對(duì)吸入性過敏原及食物過敏，伴有高水平的血清特異性IgE和總IgE[6]。AD發(fā)病的免疫學(xué)異常表現(xiàn)為Th1/Th2細(xì)胞平衡失調(diào)及相應(yīng)細(xì)胞因子、免疫炎癥因子分泌異常。在AD急性期以Th2反應(yīng)為主，AD皮損處活化的Th2細(xì)胞產(chǎn)生IL-13等多種細(xì)胞因子，介導(dǎo)IgE依賴性的炎癥反應(yīng)。一些與過敏性體質(zhì)有關(guān)的疾病如AD、哮喘和過敏性鼻炎等，其中IgE構(gòu)成此類超敏反應(yīng)性疾病發(fā)生的主要機(jī)制，與發(fā)病過程及其臨床表現(xiàn)三者密切相關(guān)[7]。有研究[8]結(jié)果顯示 IL-13 基因 rs1800925位點(diǎn)多態(tài)性與過敏性疾病顯著相關(guān)。

表1 兩組受試者的等位基因和基因型頻率比較

表2 AD組與對(duì)照組IL-33的單倍型頻率比較

表3 中度組與重度組患者IL-33的單倍型頻率比較

當(dāng)受到病毒感染、機(jī)械損傷、變應(yīng)原及內(nèi)部誘因刺激時(shí)，受損或壞死的上皮細(xì)胞會(huì)釋放IL-33。而這些刺激因素又同時(shí)激活如Toll樣受體等模式識(shí)別受體，這也間接導(dǎo)致了上皮細(xì)胞中IL-33的釋放[8]。目前發(fā)現(xiàn)多種炎癥細(xì)胞，包括肥大細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、嗜堿粒細(xì)胞、嗜酸粒細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞、Th2細(xì)胞及CD34+細(xì)胞等都能表達(dá) IL1RL1[9-11]。一些變態(tài)反應(yīng)性疾病中IL1RL1 在血清和/或上皮的表達(dá)明顯增高[12,13]。IL-33可表達(dá)于皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞、肥大細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞和成纖維細(xì)胞[14,15]。當(dāng)內(nèi)源性或者外源性致敏原刺激人體內(nèi)皮細(xì)胞或上皮細(xì)胞后，可導(dǎo)致IL-33釋放，功能異常的IL-33與肥大細(xì)胞和嗜堿粒細(xì)胞等炎癥細(xì)胞膜上功能或數(shù)量異常的IL1RL1結(jié)合，可介導(dǎo)產(chǎn)生一系列炎癥反應(yīng)。IL-33/IL1RL1 通路激活可能進(jìn)一步使Th2和Th17等失去平衡，導(dǎo)致炎癥反應(yīng)的持久發(fā)生。

IL-33和IL1RL1基因SNPs與AD易感性的相關(guān)性尚未得到充分的研究。本研究結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，AD患者IL-33 cdn 10的C等位基因和CC基因型明顯過表達(dá)，而AD患者的IL-33 cdn 10的T等位基因以及TT和CT基因型的頻率明顯低于對(duì)照組，表明它們對(duì)于AD可能具有保護(hù)作用。而以往沒有任何研究發(fā)現(xiàn)這種相關(guān)性。此外，本研究發(fā)現(xiàn)IL-33 cdn 25的C等位基因與AD顯著正相關(guān)。該等位基因在正常人群中的頻率非常低，而50%的AD患者在該位置存在C等位基因。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)cdn 25的G等位基因和GG基因型對(duì)于AD可能具有保護(hù)作用。這些結(jié)果與Stavric等[16]的研究結(jié)果基本一致。Arkwright等[17]的研究結(jié)果顯示，在此位置將G替換為C會(huì)導(dǎo)致較高的AD風(fēng)險(xiǎn)。另外，本研究結(jié)果顯示，CC和TC單倍型頻率與AD顯著正相關(guān)，而TG單倍型對(duì)于AD具有保護(hù)作用。Stavric等[16]的研究結(jié)果也顯示，CC與AD顯著正相關(guān)，而TG與AD顯著負(fù)相關(guān)。本研究沒有發(fā)現(xiàn)兩組患者的IL1RL1基因在-1082 A/G、-819 C/T和-592 C/A位置的等位基因和基因型頻率存在明顯差異，提示IL1RL1基因內(nèi)可能還存在其他多態(tài)性，影響了AD的發(fā)生發(fā)展。

綜上所述，本研究是針對(duì)中國漢族AD患者進(jìn)行的首次研究，發(fā)現(xiàn)IL-33基因多態(tài)性與AD之間存在相關(guān)性。AD患者和對(duì)照組之間的IL-33 cdn 10 C/T等位基因以及CC、CT和TT基因型、cdn 25 C/G等位基因以及CG和GG基因型頻率具有顯著性差異。此外，AD患者和對(duì)照組、中度組與重度組AD患者之間的TG、CC和TC單倍型頻率具有顯著性差異。